Vi sóng (micro-onde, microwave) là sóng cực ngắn hay còn gọi là sóng siêu tần, sóng UHF (Ultra High Frequence wave). Trong lĩnh vực ISM(Industry, Science, Medicine) trên thế giới người ta quy ước sử dụng các loại vi sóng có tần số 915, 2450, 5800, 24125MHz. Trong các tần số trên chỉ có tần số 2450 MHz là được sử dụng rộng rãi. Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vòng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường. Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống.
Trong chiết xuất, trong chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân nguyên liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi. Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hòa tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng
làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn. Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuất nguyên liệu ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho chiết xuất truyền thống (như chiết bằng Soxhlet) do rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài chục giây tới 15-20 phút. Cũng đã có những thiết bị chiết vi sóng ở quy mô lớn. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng cũng có nhược điểm đó là các tạp chất trong dịch chiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp tiếp theo. Thiết bị chiết hỗ trợ bằng vi sóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước. Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm lượng tinh dầu thu được thường cao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn. Cũng có báo cáo về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương pháp này như chiết saponin, anthraquinon, alkaloid...
Ưu điểm:
- Không có quán tính nhiệt.
- Hiệu suất chiết cao hơn so với một số phương pháp thông thường. - Sản phẩm trích ly chất lượng tốt.
- Thiết bị dễ sử dụng, an toàn và bảo vệ môi trường ( Năng lượng sạch, dễ chế tạo, dễ kiểm soát).
- Thời gian chiết nhanh.
- Có tác dụng đặc biệt với các phân tử phân cực. Nhược điểm:
- Không áp dụng cho các phân tử không phân cực.
- Khó áp dụng cho quy mô công nghiệp vì đầu tư cho thiết bị tạo vi sóng là không nhỏ để có đủ công suất.
- Nhiệt độ sôi của các dung môi đạt được rất nhanh, có thể gây nổ.
Bên cạnh 3 phương pháp chiết xuất trên, ngày nay chiết dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction – PLE) là một kỹ thuật chiết được sử dụng trong chiết xuất hiện đại. Khả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế, trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giả thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới áp suất.
Khi nhiệt độ tăng lên 10oC, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi. Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80 – 200oC và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết.
So với SFE, PLE có sự linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi do đó có thể chiết các chất trong một giới hạn rộng hơn về độ phân cực. Các thiết bị cũng không cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt như SFE nên dễ dàng áp dụng thực tế trên quy mô lớn.
Một biến thể của PLE cũng được áp dụng trong chiết xuất nguyên liệu là chiết bằng nước nóng dưới áp suất (pressurized hot water extraction, PHWE). Do diểm tới hạn của nước khá cao nên trong PHWE người ta dùng áp suất thấp hơn nhiều (chỉ vào khoảng 20 bar) ở nhiệt độ thay đổi từ trên 100 – 200oC. Đặc tính (độ phân cực) của nước thay đổi rất nhiều trong điều kiện này làm cho nước có thể chiết được các chất kém phân cực hơn. Trong PHWE, sự phân hủy các chất có thể xảy ra.
1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết [1] 1.4.1. Dung môi
chiết tách không giống nhau. Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt.
Độ phân cực của dung môi: dung môi kém phân cực thì dễ hòa tan những chất không phân cực, dung môi càng phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phân cực.Độ nhớt và sức căng bề mặt: độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chất cần chiết. Độ nhớt cao sẽ cản trở quá trình khuếch tán của chất.
Bảng 1.3. Độ nhớt (η) và sức căng bề mặt (δ) của một số dung môi thường gặp ở nhiệt độ 20oC (xếp theo thứ tự tăng dần).
Dung môi η (cp) Dung môi δ (dyn/cm)
Hexan 0.31 Hexan 1.11 Acetone 0.32 Ethanol 22.03 chloroform 0.57 Propanol 22.90 Methanol 0.60 Methanol 22.99 Benzene 0.65 Acetone 23.70 Dicloethan 0.89 Choloroform 27.70 Nước 1.00 Benzene 28.87 Ethanol 1.20 Dicloethan 32.20 Propanol 2.23 Nước 72.75 1.4.2. Nhiệt độ chiết
Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Eintein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên. Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:
− Đối với hợp chất kém bền ở nhiêt độ cao: nhiêt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một số hoạt chất như vitamine, glycosid, alkaloid....
− Đối với tạp chất: Khi nhiêt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng của tạp chất cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp chất. Nhất là đối với một số tạp như gôm, chất nhầy. khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa,
độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế. − Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi.
− Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độ tăng, độ tan của chúng lại giảm. Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ.
Từ những phân tích trên thấy tùy từng trường hợp cụ thể mà lựu chọn nhiệt độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết.).
1.4.3. Thời gian chiết xuất
Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp như nhựa, keo...). Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết, thành phần dược liệu dung môi, phương pháp chiết. phù hợp.
1.4.4. Độ mịn của dược liệu
Khi kích thước của nguyên liệu chiết thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt được dược liệu, hoạt chất khó hòa tan vào dung môi. Khi độ mịn của dược liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu chiết và dung môi tăng lên; theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết sẽ nhanh hơn. Tuy nhiên thực tế nếu nguyên liệu chiết quá mịn sẽ gặp một số bất lợi sau: - Bột nguyên liệu bị dính bết vào nhau tạo thành dạng bột nhão vón cục, khi đó sẽ làm chậm quá trình chiết xuất. Mặt khác khi lọc dịch chiết dịch sẽ chảy chậm hoặc không chảy được vì bột nguyên liệu dính kết vào nhau và do các hạt kích thước nhỏ bít kín lỗ chảy của màng lọc.
- Nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản.
- Từ đó phải lựa chọn độ mịn nguyên liệu thích hợp, tùy trường hợp cụ thế, tùy vào nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết .... Vd: với nguyên liệu đã già cần xay mịn; với nguyên liệu nhiều chất nhầy, chất nhựa nên xay thô. Với dung môi dễ hòa tan nhiều tạp hoặc chiết ở nhiệt độ cao thì nguyên liệu không nên quá mịn.
0 1.4.5. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
0 Tỷ lệ DM/NL góp phần quan trọng trong việc chiết xuất, tạo điều kiện khuếch tán các chất từ trong tế bào ra ngoài dung môi. Nếu tỷ lệ DM/NL quá thấp dẫn đến tốc độ khuếch tán cơ chất chậm, có thể dẫn đến hiệu suất chiết thấp, ngược lại nếu tỷ lệ DM/NL cao quá sẽ tạo ra hiệu suất cao thời gian ngắn, nhưng tốn kém trong thu hồi dung môi và tốn dung môi.
1.4.5. pH dung môi
pH dung môi có ảnh hưởng đến khẳ năng chiết chất hợp chất tự nhiên. Trong môi trường kiềm việc hút cation mạnh hơn anion, còn trong môi trường acid thì ngược lại.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Xạ đen (Celastrus hindsu) sử dụng trong nghiên cứu được thu hái tại Khánh Hòa.
2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1 Hóa chất
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), K3(Fe[CN]6), FeCl3, axit trichloracetic (TCA), NaH2PO4, Na2HPO4, cồn 99.5%. Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích. Được mua tại cửa hàng hóa chất và dụng cụ thí nghiệm Hoàng Trang 42-Hoàng Hoa Thám-Phường Lộc Thọ-Nha Trang- Khánh Hòa.
2.2.2. Thiết bị
Sử dụng các thiết bị chủ yếu: bể ổn nhiệt, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm, máy so màu UV- VIS, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, phễu lọc, pipet hiện có tại các phòng thí nghiệm của trường.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp phân tích
2.3.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm
Để xác định độ ẩm ta dùng phương pháp sấy. Cách thực hiện được mô tả ở phụ lục 1.1
2.3.1.2. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu andShieh (2002) [7] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cách tiến hành được mô tả trong phụ lục 1.2
2.3.1.3. Xác định tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) [12] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cách tiến hành được mô tả trong phụ lục 1.3
2.3.2. Bố trí thí nghiệm.
2.3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Cách tiến hành: Lá hoặc thân xạ đen được thu hoạch đưa về phòng thí nghiệm, tiến hành xay nhỏ đến kích thước nhất định, chiết bằng một số dung môi khác nhau như nước và cồn ở thời gian nhất định. Sau đó, tiến hành lọc bằng giấy lọc whatman để thu dịch lọc và tiến hành xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ lá xạ đen. 2.3.2.2. Thí nghiệm xác định bộ phận chiết thích hợp Nguyên liệu Xử lý Chiết Lọc Cố định các thông số: Nhiệt độ chiết: 100oC Thời gian chiết: 15 phút Tỷ lệ DM/NL: 30/1
Thay đổi nguyên liệu chiết: lá khô, lá tươi, thân
Xác định hoạt tính chống oxy hóa Chọn thông số thích hợp Bã Xạ đen Xay nhỏ Chiết Lọc Dịch lọc Thử hoạt tính chống oxy hóa Bã
1
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ một số bộ phận cây xạ đen
Tiến hành:
Chuẩn bị 3 bình tam giác 250ml , bình thứ nhất cho 2g lá khô đã xay nhỏ, bình thứ 2 cho vào 7g là tươi đã xay nhỏ và bình thứ 3 cho vào 7g thân cây đã cắt nhỏ, bổ sung 60ml nước, đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ chiết là 100oC. Sau 15 phút lấy ra, để nguội, lọc bằng giấy whatman 01, lọai bỏ bã thu lấy dịch chiết. Xác định hoạt tính chống oxy hóa.
Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn nguyên liệu chiết thích hợp nhất và tiến hành cho các thí nghiệm sau.
2.3.2.3. Thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp
Chiết
Nước
Lọc
Dịch chiết
Chon dung môi thíchhợp Ethanol 90% Lá xạ đen Xay nhỏ Cố định các thông số: Nhiệt độ chiết: 60oC Thời gian chiết: 40 phút Tỷ lệ DM/NL: 30/1
Ethanol 70%
Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp
♦ Cách thực hiện
Cho 2g lá khô đã chuẩn bị vào bình tam giác 250ml, bổ sung 60ml
ethanol 70%, đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ chiết là 60oC. Sau 40 phút lấy ra, để nguội, lọc bằng giấy whatman 01, lọai bỏ bã thu lấy dịch chiết. Xác định hoạt tính chống oxy hóa.
Tiến hành làm lần lượt với ethanol 90% và nước. Cách làm tương tự như trên.
Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn dung môi chiết thích hợp nhất và tiến hành cho các thí nghiệm sau.
2.3.2.4. Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Lá xạ đen Xay nhỏ Chiết Cố định các thông số: • Dung môi chiết: nước • Thời gian chiết: 20
phút
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp
♦ Cách thực hiện
Chuẩn bị 4 bình tam giác 250ml, cho 2g rong đã chuẩn bị vào bình tam giác 250ml, cho 60 ml dung môi đã chọn. Đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ khác nhau (70-80-90-100oC). Sau 10 phút lấy ra để nguội, lọc bằng giấy whatman 01, lọai bỏ bã thu lấy dịch chiết. Đem dịch chiết đi xác định hoạt tính chống oxy hóa..Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn nhiệt độ thích hợp nhất.
Lọc Dịch chiết Chọn nhiệt độ thích hợp 80oC 90oC 100oC Xác định hoạt tính chống oxy hóa 70oC Bã
2.3.2.5. Thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Chon thời gian thíchhợp
10 phút 20 phút 30 phút 40 phút
Xay nhỏ
Chiết
Cố định các thông số: Dung môi chiết: nước Nhiệt độ chiết: 90oC Tỷ lệ DM/NL: 30/1 Lá xạ đen Lọc Dịch chiết Bã
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp
♦ Cách thực hiện
Chuẩn bị 4 bình tam giác 250ml, cho 2g lá đã chuẩn bị vào bình tam giác 250ml, cho 60 ml dung môi đã chọn. Đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ đã chọn ở thí nghiệm trên. Sau các khoảng thời gian khác nhau (hình 2.4) lấy bình ra, để nguội rồi lọc bằng giấy whatman 01lấy