Sử dụng các thiết bị chủ yếu: bể ổn nhiệt, cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm, máy so màu UV- VIS, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, phễu lọc, pipet hiện có tại các phòng thí nghiệm của trường.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp phân tích
2.3.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm
Để xác định độ ẩm ta dùng phương pháp sấy. Cách thực hiện được mô tả ở phụ lục 1.1
2.3.1.2. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu andShieh (2002) [7] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cách tiến hành được mô tả trong phụ lục 1.2
2.3.1.3. Xác định tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) [12] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cách tiến hành được mô tả trong phụ lục 1.3
2.3.2. Bố trí thí nghiệm.
2.3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Cách tiến hành: Lá hoặc thân xạ đen được thu hoạch đưa về phòng thí nghiệm, tiến hành xay nhỏ đến kích thước nhất định, chiết bằng một số dung môi khác nhau như nước và cồn ở thời gian nhất định. Sau đó, tiến hành lọc bằng giấy lọc whatman để thu dịch lọc và tiến hành xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ lá xạ đen. 2.3.2.2. Thí nghiệm xác định bộ phận chiết thích hợp Nguyên liệu Xử lý Chiết Lọc Cố định các thông số: Nhiệt độ chiết: 100oC Thời gian chiết: 15 phút Tỷ lệ DM/NL: 30/1
Thay đổi nguyên liệu chiết: lá khô, lá tươi, thân
Xác định hoạt tính chống oxy hóa Chọn thông số thích hợp Bã Xạ đen Xay nhỏ Chiết Lọc Dịch lọc Thử hoạt tính chống oxy hóa Bã
1
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ một số bộ phận cây xạ đen
Tiến hành:
Chuẩn bị 3 bình tam giác 250ml , bình thứ nhất cho 2g lá khô đã xay nhỏ, bình thứ 2 cho vào 7g là tươi đã xay nhỏ và bình thứ 3 cho vào 7g thân cây đã cắt nhỏ, bổ sung 60ml nước, đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ chiết là 100oC. Sau 15 phút lấy ra, để nguội, lọc bằng giấy whatman 01, lọai bỏ bã thu lấy dịch chiết. Xác định hoạt tính chống oxy hóa.
Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn nguyên liệu chiết thích hợp nhất và tiến hành cho các thí nghiệm sau.
2.3.2.3. Thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp
Chiết
Nước
Lọc
Dịch chiết
Chon dung môi thíchhợp Ethanol 90% Lá xạ đen Xay nhỏ Cố định các thông số: Nhiệt độ chiết: 60oC Thời gian chiết: 40 phút Tỷ lệ DM/NL: 30/1
Ethanol 70%
Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp
♦ Cách thực hiện
Cho 2g lá khô đã chuẩn bị vào bình tam giác 250ml, bổ sung 60ml
ethanol 70%, đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ chiết là 60oC. Sau 40 phút lấy ra, để nguội, lọc bằng giấy whatman 01, lọai bỏ bã thu lấy dịch chiết. Xác định hoạt tính chống oxy hóa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành làm lần lượt với ethanol 90% và nước. Cách làm tương tự như trên.
Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn dung môi chiết thích hợp nhất và tiến hành cho các thí nghiệm sau.
2.3.2.4. Thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Lá xạ đen Xay nhỏ Chiết Cố định các thông số: • Dung môi chiết: nước • Thời gian chiết: 20
phút
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp
♦ Cách thực hiện
Chuẩn bị 4 bình tam giác 250ml, cho 2g rong đã chuẩn bị vào bình tam giác 250ml, cho 60 ml dung môi đã chọn. Đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ khác nhau (70-80-90-100oC). Sau 10 phút lấy ra để nguội, lọc bằng giấy whatman 01, lọai bỏ bã thu lấy dịch chiết. Đem dịch chiết đi xác định hoạt tính chống oxy hóa..Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn nhiệt độ thích hợp nhất.
Lọc Dịch chiết Chọn nhiệt độ thích hợp 80oC 90oC 100oC Xác định hoạt tính chống oxy hóa 70oC Bã
2.3.2.5. Thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Chon thời gian thíchhợp
10 phút 20 phút 30 phút 40 phút
Xay nhỏ
Chiết
Cố định các thông số: Dung môi chiết: nước Nhiệt độ chiết: 90oC Tỷ lệ DM/NL: 30/1 Lá xạ đen Lọc Dịch chiết Bã
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp
♦ Cách thực hiện
Chuẩn bị 4 bình tam giác 250ml, cho 2g lá đã chuẩn bị vào bình tam giác 250ml, cho 60 ml dung môi đã chọn. Đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ đã chọn ở thí nghiệm trên. Sau các khoảng thời gian khác nhau (hình 2.4) lấy bình ra, để nguội rồi lọc bằng giấy whatman 01lấy dịch chiết, loại bỏ bã. Dịch chiết sau khi thu được đem đi xác định hoạt tính chống oxy hóa. Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn thời gian thích hợp nhất.
2.3.2.6. Thí nghiệm xác định tỷ lệ DM/NL chiết thích hợp Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Dịch chiết Xác định hoạt tính chống oxy hóa Chon tỷ lệ thích hợp 10/1 30/1 50/1 Xay nhỏ Chiết Cố định các thông số: Dung môi chiết: nước Nhiệt độ chiết: 90oC Thời gian chiết: 20 phút Lá xạ đen
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ chiết thích hợp
♦ Cách thực hiện
Chuẩn bị 3 bình tam giác 250ml, cho 2g rong đã chuẩn bị vào bình tam giác 250ml, cho dung môi đã chọn với các tỷ lệ DM/NL khác nhau (hình 2.5). Đậy chặt miệng bình bằng giấy bạc, rồi cho vào bể ổn nhiệt để ổn định ở nhiệt độ đã chọn. Sau thời gian đã chọn lấy bình ra để nguội, lọc bằng giấy whatman 01, loại bỏ bã, thu dịch chiết. Đem dịch chiết đi xác định hoạt tính chống oxy hóa. Dựa vào kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa lựa chọn tỷ lệ chiết thích hợp nhất.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần để đảm bảo tiến hành phân tích ANOVA. Số liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm xử lý số liệu thống kê chuyên dụng SPSS 16.0. Kiểm định Tukey được thực hiện để đánh giá mức độ khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị với mức ý nghĩa P < 0,05. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Excel 2010.
3.1. Hàm lượng ẩm trong một số bộ phận của cây xạ đen
Theo kết quả bảng 3.1 cho biết, lá tươi có độ ẩm lớn nhất chiếm 75,57%, tiếp theo là lá khô chiếm 14,59% và cuối cùng là thân chiếm 13,63%. Việc xác định độ ẩm sẽ giúp ta tính được hàm lượng chất khô có trong các bộ phận này, từ đó sẽ tính được khối lượng cần lấy để đi xác định hoạt tính chống oxy hóa của chúng.
Bảng 3.1. Hàm lượng ẩm trong một số bộ phận của cây xạ đen
Bộ phận Hàm lượng ẩm (%) Lá tươi 75,57 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lá khô 14,59
thân 13,63
3.2. Hoạt tính chống oxi hóa của cây xạ đen ở các bộ phận khác nhau
Trong dân gian người ta thường dùng lá xạ đen để uống hàng ngày với mục đích thanh nhiệt, giải độc, mát gan. Tuy nhiên, bộ phận nào cho hoạt tính cao nhất và phương pháp làm khô lá ảnh hưởng như thế nào đến hoạt tính của lá, tác giả tiến hành nghiên cứu thí nghiệm trên 1 số bộ phận khác nhau của cây xạ đen. Kết quả được thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1.Hoạt tính chống oxy của dịch chiết từ lá khô, lá tươi và thân cây Xạ đen được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (A)
và tổng năng lực khử (B)
Ghi chú: Các chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Kết quả ở hình 3.1A cho thấy phần lá tươi thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất (63,34%), tiếp đến là phần lá khô (52,18%), và cuối cùng là phần thân (14,86%).
Hình 3.1B lại trình bày kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp tổng năng lực khử. Kết quả phân tích cho thấy giống với phương pháp khử gốc tự do DPPH, phần lá tươi vẫn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất vì giá trị IC50 là nhỏ nhất với giá trị IC50 là (0,61ml), tiếp theo là lá khô (0,72ml), và cuối cùng phần thân (2,49ml).
Như vậy phần lá có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn phần thân, và lá tươi lai cao hơn lá khô. Nhưng do nơi thu hai, lấy mẫu và nơi nghiên cứu ở cách xa nhau, hơn nữa lại không có phương tiện đi lại thường xuyên nên không thể có lá tươi để nghiên cứu thường xuyên được, vì những lý do dó nên tôi chọn lá khô để nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết nhằm thu được hoạt tính chống oxi hóa cao nhất. Trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm nên dùng lá tươi để sản xuất là tốt nhất.
Có thể giải thích các điều trên như sau:
Lá khô vì bị phơi ngoài nắng, dưới tác động của nhiệt độ làm cho nước trong lá bị bay hơi, kéo theo các hợp chất có hoạt tính chống oxy hoa như flavonoid, Saponin Triterbenoid, Quinone, alkaloid, diphenylpropane cũng bị bay hơi theo, gây thất thoát 1 phần hàm lượng trong lá. Cho nên lá khô cho hoạt tính chống oxy hoa thấp hơn lá tươi.
Ngoài ra, cây xạ đen tác giả dùng trong nghiên cứu là loại cây có tuổi đời thấp cho nên hàm lượng các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong thân còn ít, hơn nữa điều kiện tách chiết (nhiệt độ, thời gian, kích thướ c và độ min của nguyên liệu) chưa phù hợp, dẫn đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ thân thấp hơn dịch chiết bộ phận lá. Do đó kết quả nghiên cứu này đi ngược lại với kết quả nghiên cứu của GS.TSKH Lê Thế Trung.
3.3. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá xạ đen
Dung môi dùng để chiết xuất chất rất quan trọng, việc lựa chọn được dung môi thích hợp nhất sẽ thu được hiệu quả chiết xuất cao.
Để chiết các hoạt chất chống oxy hóa từ lá xạ đen, có nhiều loại dung môi khác nhau đã được nghiên cứu như methanol, ethanol, nước, acetone,
acetonitrile…trong số đó nước và ethanol đã chứng tỏ khả năng chiết tốt do độ phân cực cao, phù hợp để chiết các hoạt chất chống oxy hóa cũng có tính phân cực cao trong lá xạ đen, hơn nữa đây là những dung môi an toàn, cho phép sử dụng trong chế biến thực phẩm, nên chúng tác giả chọn chúng là đối tượng nghiên cứu. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của lá Xạ đen khô được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (A) và
tổng năng lực khử (B)
Ghi chú: Các chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Ảnh hưởng của dung môi chiết lên hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện ở hình 3.2. Ở hình 3.2A, kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết khi chiết bằng nước là cao nhất khi khả năng khử gốc tự do DPPH ở nước là (45,98%), trong khi chiết với ethanol 90% và ethanol 70% là thấp hơn (P<0,05). Khả năng khử gốc tự do DPPH lần lượt là (41,94%) và(39,75%). Một xu hướng tương tự cũng được ghi nhận đối với phương pháp tổng năng lực khử. Theo đó, dung môi chiết là nước cho hoạt tính chống oxi hóa cao hơn khi giá trị IC50 của nước là thấp hơn ethanol 90% và ethanol 70% (P < 0,05). Giá tri IC50 của dịch chiết nước và ethanol 90% và ethanol 70% lần lượt là 1,10ml; 120ml và 1,27ml.
+ Độ phân cực của dung môi và hợp chất tự nhiên là rất quan trọng
trong chiết xuất. Dung môi phân cực thì sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực. Flavanoid ,quinone, saponin triterpenoid.Trong lá xạ đen đều là hợp chất có độ phân cực do đó hiệu quả chiết của dung môi tăng khi độ phân cực tăng.
+ Nước có độ phân cực lớn hơn ethanol, độ phân cực của nước là 16δP và độ phân cực của ethanol chỉ là 8.8δP. Nên khả năng hòa tan các chất trong nước vẫn dễ dàng hơn, vì vậy trong dịch chiết thu được có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với ethanol.
+ Ethanol 90% có nồng độ cao hơn ethanol 70% nên khả năng chiết tốt hơn, nhưng vì chênh lệch nồng độ là không cao nên hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết của chúng là không khác biệt nhau lắm.
Từ những kết quả đạt được chúng tôi chọn dung môi chiết là nước cho những thí nghiệm tiếp theo
3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của dich chiết lá xạ đen
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất chất. Tuy nhiên chiết ở nhiệt độ nào sẽ cho hoạt tinh chống oxy hóa cao nhất, và ảnh hưởng của chúng đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết là xạ đen như thế nào. Tác giả đã tiến hành thí nghiệm. Kế quả được thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa của lá xạ đen khô được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH (A)
và tổng năng lực khử (B) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi chú: Các chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Hình 3.3A thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử gốc tự do DPPH. Qua hình cho thấy khi nhiệt độ tăng lên thì khả năng khử gốc tự do DPPH cũng tăng lên, khi tăng nhiệt độ 70oC lên 80oC khả năng khử gốc tự do tăng lên không đáng kể (p<0,05), từ 42,47% đến 50,15%. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ lên 90oC, khả năng khử gốc tự do DPPH lại tăng lên đáng kể (61,03%). Và khi tăng lên 100oC thì khả năng khử gốc tự do lai tăng chậm lại (64%).
Đối với phương pháp tổng năng lưc khử (hình 3.3B), theo đó một xu hướng tương tự cũng được quan sát thấy, tức là khi tăng nhiệt đô lên thì giá trị IC50 lại giảm xuống tức là hoạt tính chống oxy hóa tăng lên. Và nhiệt độ từ 70oC lên 90oC thì giá trị IC50 giảm mạnh, từ 1ml xuống 0,7ml, nhưng khi tăng nhiệt độ đến 100oC thị IC50 lại tăng chậm lại (0,66ml). Điều này có thể được lý giải như sau:
+ Khi nhiệt độ tăng thì thuận lợi cho việc phá hủy màng tế bào thực vật và tăng tốc độ hòa tan của các hợp chất chống oxy hóa trong lá. Đồng thời độ nhớt của dịch sẽ giảm, làm tăng tốc độ phản ứng giữa các thành phần hóa học trong lá với nhau, cũng như các thành phần đó với nước tăng lên. Dẫn đến tốc độ khuếch tán của các chất tan cũng như các chất có hoạt tính chống oxy hóa từ bên trong tế bào lá thoát ra ngoài môi trường chiết tăng, đồng thời sự thẩm thấu giữa dung môi và tế bào nguyên liệu cũng tăng. Do đó, hàm lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa thu được nhiều hơn, dẫn đến hoạt tính chống oxy hóa cao hơn.
+ Tuy nhiên nhiệt độ là yếu tố giới hạn. Vì khi nhiệt độ tăng cao có thể xảy ra các phản ứng không mong muốn. Nhiệt độ cao còn làm các chất có hoạt tính chống oxy hóa như flavonoid, Saponin Triterbenoid, Quinone , alkaloid, diphenylpropane dễ bị phá hủy một phần, làm giảm hàm lượng và hoạt tính của chúng. Ngoài ra nhiệt độ cao không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tan của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp.