tối ưu hóa quy tr ình nhân sinh khối rễ tơ cây ba kích (morinda officinalis how )

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 25 3.1 Đối tượng, vật liệu và thời gian nghiên cứu 25 Phần 4 Kế

U HÓA QUY TRÌNH NHÂN SINH KHỐI R

CÂY BA KÍCH(Morinda officinalis How.)

N VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

I RỄ TƠ How.)

Ĩ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

TRẦN HỒNG LIÊN

TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH NHÂN SINH KHỐI RỄ

TƠ CÂY BA KÍCH (Morinda officinalis How.)

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo

HÀ NỘI, NĂM 2015

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày… tháng… năm…

Tác giả luận văn

Trần Hồng Liên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, được sự quan tâm, dạy dỗ tận tình của các thầy cô, các cán bộ tại phòng thí nghiệm cùng với sự nỗ lực của của bản thân em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Để có được thành quả này đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô đã tạo điều kiện và dạy dỗ, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kĩ năng cần thiết trong suốt quá trình học tập ở Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo,Thạc sỹ Ninh Thị Thảo,giảng viên khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này

Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc các thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện giúp tôi có thể hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn ThS Phạm Thị Thu Hằng cán bộ phòng thí nghiệm nghiên cứu viên phòng thí nghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, chia sẻ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.2.3 Tác dụng sinh lý, công dụng Anthraquinone 10 2.2.4 Phân tích định tính và định lượng anthraquinone 11 2.3 Khái niệm chung về rễ tơ và các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cáy rễ tơ 15

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối và khả năng tổng hợp hoạt

2.2.4 Các nghiên cứu liên quan nhân nuôi sinh khối rễ tơ 21

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 25

3.1 Đối tượng, vật liệu và thời gian nghiên cứu 25

Phần 4 Kết quả và thảo luận 31

4.1.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong các điều kiện và điều kiệnn

chiếu sáng khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục

4.1.2 Ảnh hưởng của elicitor đến sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu

4.1.3 Xác định công thức tối ưu hóa nuôi cấy rễ tơ ba kích 42

4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong các điều kiện và giai đoạn chiếu

sáng khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu của

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

B5 : Gamborg’sB5 (Môi trường dinh dưỡng trung bình)

CRD : Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên

CV% : Coefficient of variation (Hệ số biến thiên)

HMGR : 3 – hydroxyl – 3 – methylglutaryl CoA reductase

LDL : Low - Density – Lipoprotein

LSD 5% : Least significant difference (Mức sai khác có ý nghĩa nhỏ nhất 5%)

MJ : Methyl jasmonate

YE : Yeast extract (Cao nấm men)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo phân tử của chất 9,10 anthraquinone 7 Hình 2.2 Con đường chuyển hóa chất anthraquinone từ các đơn vị acetat 8 Hình 2.3 Con đường chuyển hóa anthraquinone từ acid shikimic 9 Hình 4.1 Hàm lượng anthraquinone trong mỗi 1gram mẫu khô của các công

Hình 4.2 Sự sinhtrưởng rễ tơ nuôi cấy sau 3 tuần ở các điều kiện chiếu sáng

Hình 4.7 Hàm lượng anthraquinone rễ tơ được nuôi cấy trong 8 tuần ở các

công thức khác nhau về chu kỳ chiếu sáng 38 Hình 4.8 Hàm lượng anthraquinone thu được trong 1 g mẫu khô của các công

Hình 4.9 Sự sinh trưởng của rễ tơ của các công thức khác nhau về thời điểm

bổ sung elicitor trước khi dừng nuôi cấy 40 Hình 4.10 Hàm lượng anthraquinone thu được trong 1 g mẫu khô của các công

thức khác nhau sau 8 tuần nuôi cấy không bổ sung elicitor 41 Hình 4.11 Hàm lượng anthraquinone trong 1 g mẫu khô của các công thức khác

nhau về điệu kiện chiếu sáng và bổ sung elicitor 43 Hình 4.12 Hàm lượng anthraquinone của các công thức khác nhau về điệu kiện

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

TÓM TẮT

Nghiên cứuđược tiến hành nhằm tối ưu qui trình nhân nuôi rễ tơ cây ba kích cho khả năng tăng sinh khối và tích lũy hàm lượng hoạt chất mục tiêu cao Trong đề tài này, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng khác nhau củađiều kiện chiếu sáng, thời gian chiếu sáng tối ưu nhất Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố elicitor và thời điểm bổ sung elicitor

trước khi dừng nuôi cấy

Kết quả thu được: Nuôi cấy rễ tơ theo hai giai đoạn Giai đoạn 1, 8 tuần đầu rễ tơ chủ yếu tăng sinh về khối lượng Giai đoạn 2: rễ tơ tăng sinh chậm, hóa màu đen hoặc nâu, tích lũy hoạt chất mục tiêu mạnh.Ánh sáng có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng rễ tăng sinh ở giai đoạn 3 tuần khi bắt đầu nuôi cấy Giai đoạn tiếp theo, sư phát triển và tích lũy hợp chất mục tiêu tăng mạnh khi rễ tơ được nuôi cấy trong điều kiện tối

Bổ sung elicitor trướ c ngày dừng nuôi cấy 5 rễ tơ đạt tích lũy hàm lượng hoạt chất mục tiêu lớn nhất so với thời gian 1, 3, 5, 10 ngày Bổ sung elicitor 100 mg/l YE + 0,1 mM

MJ có khă năng làm tăng tích lũy hàm lượng hợp chất mục tiêu mạnh nhất ở công thức nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 3 tuần 8h sáng 16h tối sau đó 5 tuần tối hoàn toàn,

bổ sung elicitor trước 5 ngày dừng nuôi cấy.Công thức tối ưu hóa thu được là: nuôi cấy

rễ tơ trong điều kiện tuần (16h sáng-8h tối) + 5 tuần tối hoàn toàn, bổ sung elicitor trước thời điểm dừng nuôi cấy 5 ngày

Các kết quả thí nghiệm góp phần tạo tiền đề cho quá trình xây dựng quy trình sản xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ cây ba kích, phục vụ cho ngành công nghiệp dược liệu tại Việt Nam

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix

ABTRACT

The research was conducted to optimize the hairy root culture process which targeted to increase biomass and secondary compound accumulation In this study, different factors were studied that including: the effects of lighting conditions, lighting period and elicitortreatment

The period culturing hairy root has two stages Stage 1, the first 8 weeks of culturing, hairy root proliferate mainly in weight, but not stimulate secondary compound Stage 2: hairy root proliferated slowly, turns brown, accumulates strongly target compound This result showed the an important role of lighting forroots induction inthe first 3 weeks from the beginning time of culturing hairy root In the next stage, from 8 week to 10 week, the development and accumulation of targeting compounds got the highestconcentrationwhen hairy rootcultured completely in dark conditions Elicitor were supplied 5 days before culture ending time, secondary compounds gotthe biggest amount, was compared with the time of 1, 3, 5, 10 days Beside that, supplement

of elicitor 100 mg / l YE + 0.1 mM MJ had the ability to increase the accumulation ofthe secondary compounds concentration of hairy root cultured in lighting conditions

3 weeks (8h light – 16 h dark)then 5 weeks (dark only) Optimized process is: growing hairy root in 3 weeks (8h light – 16 h dark) then 5 weeks (dark completely), elicitors were added 5 days before culture ending time

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây ba kích (Morinda oficinalis How) từ lâu trong dân gian đã được sử

dụng như một vị thuốc quý, có tác dụng bổ thần kinh, bổ gân cốt, giảm xơ cứng động mạch, tăng cường khả năng sinh lý nam giới, tăng sức dẻo dai, sức đề kháng, chống viêm, hạ huyết áp, không có tính độc, bổ thận, tráng dương, ích tinh, cường gân cốt, khứ phong thấp, bổ thận âm, bổ huyết hải, định tâm khí Rễ

Ba kích có thành phần hóa học là các anthraglucosid, iridoid glucoside, các sterol, các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu, Zn…, tinh bột, đường, acid hữu

cơ, vitamin C (Việt Báo, theo SK & ĐS), dịch chiết cồn từ rễ cây ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp

ăn ngon và ngủ ngon

Cây ba kích còn là một cây có giá trị kinh tế cao, giá thành trong nước khoảng 400.000-500.000 đồng/kg tươi Tuy nhiên trong tự nhiên, sinh khối của

ác dược liệu quý hiếm ngày bị hạn chế bởi thời gian sinh trưởng kéo dài cùng những hoạt chất tích lũy chậm Hiện nay, nguồn cung cấp dược liệu cho ngành dược vẫn chủ yếu bằng thu hái tự nhiên và nuôi trồng.Cây ba kích trồng trong tự nhiên phải mất tới 3 -4 năm mới cho thu hoạch Bên cạnh đó sự nhiễm kim loại nặng, vi sinh vật, chất phóng xạ, dư lượng thuốc trừ sâu, thay thế các loài thảo mộc độc hại và giả mại trong dược liệu, đã được thông báo rộng (Drew và Myers, 1997) Một số nhiễm bẩn khác có thể bị gây ra trong quá trình xử lý và bảo quản nguyên liệu (Leung và công sự, 2005) Mặt khác, vùng phân bố ba kích đang bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này đang rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần phải được bảo vệ (Nghị định số 48/2002/NĐ-CP)

Để sản xuất một loại dược liệu sạch, chất lượng cao, áp dụng công nghệ

sinh học mà cụ thể ở đây là kỹ thuật nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro các loài

thảo dược – một phương pháp lý tưởng để tăng trưởng bền vững ngành công nghiệp thảo dược Nó cho thấy hiệu quả rõ rệt trong sản xuất sinh khối các hợp chất thứ cấp có giá trị, đặc biệt là từ các loài quý hiếm, sinh trưởng chậm trong tự

nhiên như sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius),

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

Cây tam thất (Panax pseudoginseng), cây thủy tùng (Taxus sp.)… Phương pháp

nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm vượt bậc như rễ phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc đất, bền vững về mặt di truyển và tổng hợp hoạt chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng cây mẹ, tạo sinh khôi; giúp giảm thời gian sản xuất, giảm giá thành sản xuất… hứa hẹn là một hướng đi bền vững, đầy triển vọng

Dựa trên cơ sở những ưu điểm vượt trội phương pháp nuôi cấy rễ tơ, rễ tơ cây ba kích đã được cảm ứng thành công (Lê Thị Thanh Hương, 2014) và đã bước đầu khảo sát môi trường thích hợp cho việc nuôi cấy rễ tơ (Nguyễn Quỳnh Chi, 2015), đề tài được tiến hành nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm năng cao sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ cây ba kích

Chính vì vậy tôi tiến hành đề tài: “Tối ưu hóa quy trình nhân sinh khối

rễ tơ cây Ba kích (Morinda officinalis How.)”.Đề tàigóp phần tạo tiền đề cho

quá trình xây dựng quy trình sản xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ cây ba kích, phục vụ cho ngành công nghiệp dược liệu tại Việt Nam

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu

Hoàn thiện quy trình nhân sinh khối rễ tơ cây ba kích

Yêu cầu

Xác định được điều kiện chiếu sáng thích hợp và thời gian nuôi cấy cần cho

sự tăng sinh khối rễ tơ và tích lũy hoạt chất mục tiêu

Xác định được yếu tố Elicitor thích hợp cho khả năng tích lũy hoạt chất mục tiêu trong rễ tơ

Xác định được công thức tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được thực hiệntrên đối tượng rễ tơ ba kích M4 được cảm ứng thành công (Bộ môn Công nghê sinh học thực vật nghiên cứu) tại bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 8 năm 2015

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN

Ý nghĩa khoa học: đề tài giúp xác định ảnh hưởng của ánh sáng, thời gian

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

nuôi cấy đến sự sinh trưởng cũng như tích lũy hoạt chất mục tiêu (anthraquinone) cũng như sự ảnh hưởng của yếu tố elicitor lên rễ tơ

Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài sẽ có đóng góp quan trọng trong việc

đưa rễ tơ cây ba kích vào trong sản xuất sinh khối lớn phục vụ cho ngành công nghiệp dược liệu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY BA KÍCH

2.1.1 Nguồn gốc, phân bố

Cây ba kích (Morinda officinalis How.) còn gọi là dây ruột gà, ba kích

thiên, liên châu ba kích, chẩu phóng xì, sáy cáy (Thái), thau tày cáy (Tày), chồi hoàng kim, chày kiàng đòi (Dao)… là một loại thực vật lâu năm, phân bố tự nhiên ở Lào, Việt Nam, Trung Quốc Tên gọi khác là Radix Morindae officinalis, tên Trung Quốc là Ba Ji Tian

Ở Việt Nam hoặc Trung Quốc, cây ba kích thường được sử dụng có nguồn gốc tự nhiên hoặc canh tác Nó phổ biến ở các tỉnh Quảng Đông, Hà Nam, Quảng Tây, Phúc Kiến và Hà Nam Trung Quốc, đặc biệt là Quảng Đông Ba kích ở nước ta phân bố nhiều ở vùng đồi núi thấp và trung du các tỉnh phía Bắc và có nhiều ở các tỉnh Quảng Ninh, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Yên bái, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hòa Bình, Lạng Sơn, Hà Giang (Lê Mộng Chân, 2000)

Chi: Nhàu (Morinda)

Loài: Morinda officinalis How

Tên thường gọi: Ba kích Hiện nay có 13.150 loài (Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000)

2.1.3 Đặc điểm thực vật học

Ba kích là cây thân thảo sống lâu năm, leo bằng thân hoặc quấn vào cành cây khác hoặc giá đỡ Thân cây màu tím hoặc xanh, thân non có màu hơi tím, cành non có 4 lông bao phủ, thân già nhẵn màu nâu Lá mọc đối, cứng nhọn, hình

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

ngọn giáo thuôn dài 6 -14 cm, rộng 2,5 – 6 cm, lúc non màu xanh, có lông dài ở mặt dưới, sau đó ít lông và có màu trắng mốc; lá kèm hình ống Lá già ít lông màu hơi trắng mốc Lá kèm mỏng dạng ống dính sát thân Hoa mọc thành cụm tập trung thành tán tròn ở đầu cành từ 2 - 10 hoa Hoa mẫu 4 (4 lá dài, 4 cánh hoa, 4 nhị), hoa dài từ 0,3 - 1,5 cm, cuống từ 3 – 10 mm Hoa lúc non màu trắng, sau ngả vàng Đài hoa hình chén hay hình ống gồm các lá đài nhỏ hình tam giác đều phát triển không đều nhau, tràng hoa 4 cánh màu trắng liền nhau thành ống ngắn, nhị ở đáy của sống tràng, bầu hạ chẻ đôi ở đỉnh Mùa hoa vào khoảng tháng 5 đến tháng 6 Quả dạng quả hạch, hình cầu, hoặc dính vào nhau, đường kính 6 – 11 mm Khi chín quả màu đỏ, bên trong có 4 hạt nhỏ hình bầu dục hay trứng ngược, màu vàng, vỏ hạt nhám.Quả ra từ tháng 7 đến tháng 10 Rễ dạng rễ

củ có hình trụ tròn, thắt khúc, dài không bằng nhau, vặn vẹo như ruột gà, đường kính 1,5 – 2 cm Vỏ ngoài màu nâu nhạt hoặc hồng nhạt, nhám, có vân dọc Bên trong là thịt củ dày màu nâu hồng hoặc tím, không mùi, vị ngọt nhưng hơi chát, trong cùng là lõi củ.Thông thường có hai loại ba kích là ba kích tím và ba kích trắng.Ba kích tím có lõi củ màu tím, ba kích trắng có lá bầu, lõi củ màu vàng hoặc hồng vàng (Lê Mộng Chân, 2000)

2.1.4 Đặc điểm sinh thái học

Ba kích ưa sáng, ưa ẩm và chịu bóng, mọc trên đất feralit đỏ vàng, lượng mùn trung bình, tơi xốp và hơi chua, nhiệt độ trung bình 21 – 23 độ C, thích hợp

ở các vùng trung du, miền núi Ba kích có thể trồng bằng rễ, cành bánh tẻ hay gieo ươm bằng hạt Vào khoảng tháng 3 - 4, khi thời tiết ấm dần, chọn những cành bánh tẻ ở cây ba kích sống khoẻ, chặt thành từng đoạn 20 - 30 cm, mỗi đoạn

có 2 - 4 mắt Có thể đem trồng ngay hoặc giâm và vườn ươm cho đến khi nảy mầm, ra rễ mới đem trồng Ba kích trồng từ 3 - 7 năm có thể thu hoạch Năng suất dược liệu là rễ phụ thuộc vào số năm trồng, càng lâu năm, năng suất càng cao Thời điểm thu hoạch vào khoảng tháng 10 – 11 (Lê Mộng Chân, 2000)

2.1.5 Công dụng

Bộ phận dùng là rễ ba kích tươi hay sấy khô Theo y học hiện đại, ba kích

có tác dụng tăng sức dẻo dai, sức đề kháng Theo y học cổ truyền, rễ ba kích có

vị ngọt, cay, hơi ấm không độc, có tác dụng bổ thận tráng dương ích tinh, cường gân cốt, khử phong thấp, bổ thận âm, bổ huyết hải, định tâm khí, chủ trị thận hư, lãnh cảm, lưng gối mỏi, tê bại, phong thấp, thần kinh suy nhược, trúng phong, ho suyễn, tiêu chảy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

Theo Trung Dược Học, ba kích có công dụng trong chống viêm: Trên mô hình gây viêm thực nghiệm ở chuột cống trắng bằng kaolin với liều lượng 5 - 10 g/kg, ba kích có tác dụng chống viêm rõ rệt.Đối với hệ thống nội tiết: thí nghiệm trên chuột lớn và chuột nhắt cho thấy ba kích không có tác dụng kiểu Androgen (là kích thích tố đực) nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của Androgen hoặc tăng cường quá trình chế tiết hoormon Androgen Tăng sức đề kháng: dùng phương pháp gây nhiễm độc cấp bằng Ammoni Clorua trên chuột nhắt trắng, với liều 15 g/kg, ba kích có tác dụng tăng cường sức đề kháng chung của cơ thể đối với các yếu tố độc hại Nước sắc ba kích có tác dụng tương tự như ACTH (adreno cortico trophic hormon) còn được gọi là “corticotropin”.ACTH được bài tiết từ tuyến yên phía trước để đáp ứng corticotropin- releasing hormone

từ vùng dưới đồi.Nó là một thành phần quan trọng của tuyến yên- thượng thận, trục dưới đồi và thường được sản xuất để đáp ứng với stress sinh học, ngoài ra còn có tác dụng hạ huyết áp

Theo Tài nguyên cây thuốc Việt Nam ba kích có công dụng tráng dương, cường tráng cân cốt Đối với cơ thể những người tuổi già, những bệnh nhân có biểu hiện mệt mỏi, ăn kém, ngủ ít, gầy yếu mà không thấy có những yếu tố bệnh

lý gây nên và một số trường hợp có đau mỏi các khớp sau khi sử dụng ba kích sẽ

có kết quả đỡ mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon và những dấu hiệu khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực Còn đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp thì sau khi dùng ba kích dài ngày, các triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt.Đối với những bệnh nhân nam có hoạt động sinh dục không bình thường, ba kích có tác dụng làm tăng khả năng giao hợp, đặc biệt đối với những trường hợp giao hợp yếu và thưa

Ba kích có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù nó không làm tăng đòi hỏi tình dục, không thấy có tác dụng kiểu Androgen Tuy không làm thay đổi tinh dịch đồ nhưng trên thực tế có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh dục cũng như điều trị vô sinh cho những nam giới có trạng thái vô sinh tương đối và suy nhược thể lực

Trong nhân dân, ba kích là vị thuốc có tác dụng bổ trí não và tinh khí, chữa xuất tinh sớm, di mộng tinh, liệt dương, kinh nguyệt chậm hoặc bế kinh, phong thấp, huyết áp cao

2.1.6 Giá trị dược liệu

2.1.6.1 Thành phần hóa học

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

Trong ba kích có gentianine, carpaine, choline, trigonelline, yamogenin, gitogenine, tigogenin, vitexin, orientin, quercetin, luteolin, vitamin B1, rubiadin, rubiadin-1-methylether Trong rễ chứa thành phần hóa học chính là các hợp chất anthranoid: tectoquinon, 1 – hydroxyl – 2, 3- dimethyl – anthraquinon… , ngoài

ra còn antraglycozid, các hợp chất iridoid: asperulosid, morofficialosid…., đường, nhựa, acid hữu cơ, phytosterol và ít tinh dầu, morindin, rễ tươi có chứa vitamin C (Đỗ Tất Lợi, 2005)

Để nghiên cứu các thành phần hóa học từ rễ cây ba kích phương pháp sắc

ký cột silica gel và Sephadex LH-20 được sử dụng và các cấu trúc hóa học đã được làm sáng tỏ trên cơ sở phân tích quang phổ, kết quả có 17 hợp chất được xác định bao gồm: physcion; 1-hydroxy-2methylanthraquinone; 2-hydroxy-1-methoxyanthraquinone; rubiadin; rubiadin 1- methylether; 1,3-dihydroxy-2-methoxyanthraquinone; 3-hydroxy-2-methylanthraquinone; digiferruginol;1,2-dimetoxy-3-hydroxyanthraquinone;1,3-dihydroxy-2-hydroxymethyl-anthraquinone; lucidin ether ώ-ethyl; axit-anthraquinone-2 carboxylic; 7-hydroxy-6-methoxy-coumarin; acid

fumaric; stimasterol; daucosterol; β-sitosterol (Zhang Hai-Long và cộng sự, 2010) Bên cạnh đó Zhongguo và cộng sự (1995) đã phân lập từ rễ của Morinda officinalis được năm hợp chất có hoạt động chống trầm cảm.Bằng phương pháp

hóa học và quang phổ các hợp chất này được xác định là: axit succinic, nystose, 1F-fructofuranosylnystose

2.2 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ANTHRAQUINONE

Hình 2.1: Cấu tạo phân tử của chất 9,10 anthraquinone

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

(Bài giảng dược liệu” tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, Ngô Văn Thu,2011)

Anthranoid hay anthraquinon khi tồn tại dưới dạng glycosid thì được gọi là anthraglycosid hay anthracenosid Cũng như các loại glycosid khác Anthraglycosid là những glycosid khi bị thuỷ phân sẽ cho phần đường và phần aglycon (genin) là dẫn chất 9,10 anthraquinon*, (9,10-anthracendion*) (9,10 dixeton của anthraxen)

Đa số các anthraglycosid là các polyoxy anthraquinon Gắn vào nhân thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH Tuỳ theo vị trí các nhóm chức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau:

Vì trong tự nhiên hầu như chưa gặp các dẫn chất 1,2 hoặc anthracendion nên khi nói đến các dẫn chất anthraquinon trong tự nhiên thì người

1,4-ta hiểu rằng đó là những dẫn chất 9,10-anthracendion Sự tạo thành các dẫn chất anthraquinon xuất phát từ 2 con đường:

Ðối vơi những dẫn chất 1,8-dihydroxyanthraquinon hay gặp trong các họ thực vật Polygonaceae, Caesalpiniaceae, Rhamnaceae cũng như trong một số nấm và địa y, con đường sinh nguyên xuất phát từ các đơn vị acetat Người ta đưa acetat có đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ vào môi trường nuôi cấy nấm Penicillium islandicum là nấm tạo ra dẫn chất anthranoid thì thấy các đơn vị acetat được ngưng tụ nối với nhau theo đầu đuôi Chất poly-b-cetomethylen acid được tạo thành đầu tiên rồi tiếp theo các dẫn chất anthranoid

Hình 2.2: Con đường chuyển hóa chất anthraquinone từ các đơn vị acetat

(Bài giảng dược liệu” tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, Ngô Văn Thu,2011)

Con đường thứ hai tạo thành các dẫn chất anthraquinon trong một số họ thực vật khác chủ yếu là họ Rubiaceae thì chất tiền sinh là acid shikimic Sau khi acid này ngưng tụ với một acid a-cetoglutaric thì tạo thành một dẫn chất naphtalen rồi chất này lại gắn thêm một gốc isoprenyl để rồi đóng vòng tạo ra các

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

dẫn chất anthraquinon

Hình 2.3: Con đường chuyển hóa anthraquinone từ acid shikimic

(Bài giảng dược liệu” tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, Ngô Văn Thu, 2011)

2.2.2 Phân loại

Thành phần chính của cánh kiến đỏ là nhựa dùng để chế shellac dùng để đánh bóng vecni đồ gỗ, mây tre; sản phẩm phụ là chất màu đỏ sẫm gọi là acid laccaic Đây là một hỗn hợp nhiều chất, trong đó Acid laccaic A,B,Ccó màu

đỏ Acid laccaic D không có 2 nhóm OH ở nên có màu vàng.Nhóm này có trong một số chi thuộc họ: Rubiaceae (Rubia tinctoria)

Nhóm nhuận tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinon)

Dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinon (oxymethylanthraquinon) thường có nhóm CH3, CH2OH, CHO hoặc COOH ở vị trí 3 Dẫn chất 1,8 dihydroxyantraquinon có thể ở dạng tự do hoặc kết hợp với phần đường ở dạng glycosid Một số chất thường gặp thuộc nhóm này: Cryzophanol (Acid Cryzophanic), Aloe emodin, Rein, Reum emodin (Emodin), (Phyxion)

Tuỳ thuộc mức độ oxyhoá của các dẫn chất anthraxen người ta chia thành: anthraquinon (dạng oxy hoá), anthron và anthranol (dạng khử) Nếu khử một trong hai nhóm chức ceton của anthraquinon sẽ cho dẫn chất anthron hoặc đồng phân hỗ biến của chất này là anthranol (dạng enol) Nếu khử tiếp th_ì dẫn đến dẫn xuất chất dihydroanthranol Dạng khử có tác dụng xổ mạnh nhưng hay gây đau bụng vì vậy một số dược liệu chứa anthranoid phải để 1 năm sau khi thu hái mới

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

Một số ví dụ khác là các chất: ararobinol (có trong cốt khí muồng và trong

các loài Rumex spp.), sennosid A,B,C (có trong Phan tả diệp) hoặc rheidin A,B,C

(có trong Đại hoàng)

Khi tạo thành dimer nếu 2 nửa phân tử giống nhau th_ gọi là homodianthron

ví dụ ararobinol, sennosid A,B; nếu 2 nửa phân tử không giống nhau gọi là heterodianthron ví dụ sennosid C, rheidin A.Trong chi Cassia người ta còn gặp một số dimer dạng dianthraquinon như cassianin, cassiamin.Loại dianthraquinon

gặp trong một số loài nấm Penicillium

Trong thực vật ngoài những dẫn chất anthranoid xếp vào 3 nhóm trên còn

có những dẫn chất khác có một số nhóm thế đặc biệt, ví dụ chất fragilin có trong

địa y Sphaerophorus globosus hoặc nalgiolaxin có trong nấm Penicillium

Các dẫn chất anthranoid được phân bố trong khoảng 30 họ thực vật khác

nhau, chủ yếu là những cây 2 lá mầm Các họ hay gặp: Caesalpiniaceae, Rhamnaceae, Rubiaceae, Polygonaceae

Trong cây một lá mầm rất hiếm Cho đến nay có 2 cây được biết: Lô hội -

Aloe spp và Hemerocallis aurantiaca Trong nấm, địa y cũng có Trong động vật thì gặp trong các loài sâu như Coccus cacti, Kermococcus ilicus, Lacifer lacca

2.2.3 Tác dụng sinh lý, công dụng Anthraquinone

Các dẫn chất anthraglycosid, chủ yếu là các β-glucosid dễ hoà tan trong nước, không bị hấp thu cũng như bị thủy phân ở ruột non Khi đến ruột già, dưới tác dụng của β-glucosidase của hệ vi khuẩn ở ruột th_ các glycosid bị thủy phân và các dẫn chất anthraquinon bị khử tạo thành dạng anthron và anthranol là dạng có tác dụng tẩy xổ, do đó có thể giải thích lư do tác dụng đến chậm sau khi uống thuốc Dạng genin th_ì bị hấp thu ở ruột non nên không có tác dụng

Do tác dụng làm tăng nhu động ruột nên với liều nhỏ các dẫn chất dihydroxyanthraquinon dưới dạng heterosid giúp cho sự tiêu hoá được dễ dàng,

1,8-Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

liều vừa nhuận, liều cao xổ Hỗn hợp các dẫn chất anthraquinon có trong rễ cây

Rubra tinctoria L có tác dụng thông tiểu và có khả năng tống sỏi thận

Chrysophanol có tác dụng kháng nấm dùng để trị nấm, hắc lào, lang ben Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất quinon đặc biệt là các dẫn chất anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư Xuất phát từ acid chrysophanic và các dẫn chất anthraquinon khác, người ta bán tổng hợp một số dẫn chất có N-, S- và gốc halogen có hoạt tính chống ung thư

Các hợp chất anthraquinone có thể thúc đẩy sản xuất tiểu cầu, tăng đáng kể fibrinogen, thời gian đông máu được rút ngắn, làm giảm tính thấm mao mạch, cải thiện mạch máu mỏng manh, do đó sự gia tăng trong hoạt động co bóp của các mạch máu, vì vậy họ có thể thúc đẩy máu đông máu

Mặt khác, anthraquinone có tác dụng kháng khuẩn: Các hợp chất anthraquinone chống lại vi khuẩn khác nhau có mức độ khác nhau của sự ức chế,

mà tụ cầu, liên cầu nhạy cảm nhất, Shigella, nhạy cảm hơn với bệnh bạch hầu, và

trực khuẩn subtilis thương hàn Cơ chế ức chế ức chế quá trình oxy hóa của vi khuẩn và khử đường và trung gian trao đổi chất, và ức chế sự tổng hợp protein và axit nucleic, như vậy tránh nhiễm độc và kháng thuốc kháng sinh nhất định về mặt lâm sàng

Anthraquinone còn có tác dụng tẩy: ràng buộc để bảo vệ glycosides anthraquinone nguyên nhân glycosyl hóa, hầu hết không có sự hấp thụ trực tiếp vào ruột già, men vi khuẩn bị phá vỡ trong ruột vào aglycone và đường Aglycone kích thích niêm mạc, ruột và ức chế sự hấp thu ion natri từ độ ẩm ruột quá lớn làm tăng nhu động ruột gây tiêu chảy cường giáp

Các hợp chất anthraquinone có thể làm tăng lượng nước tiểu và thúc đẩy nhu động niệu quản, niệu natri và kali cũng tăng đáng kể, trong khi hiệu quả hạ

áp lợi tiểu Vai trò của nó là làm giảm sự tái hấp thu đường ruột của các amino acid ức chế sự tổng hợp urê trong mô gan và thận, làm tăng nồng độ máu của các axit amin thiết yếu miễn phí, sử dụng trong cơ thể tổng hợp protein và phân urê

để ngăn chặn sự phân hủy của protein cơ bắp, và tăng bài tiết urê và creatinin để hoàn thành

2.2.4 Phân tích định tính và định lượng anthraquinone

- Phương pháp cân: phương pháp của Daels và Kroeber

Nguyên tắc của phương pháp này như sau: Dược liệu được đun với acid

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

sulfuric 25% để thủy phân các glycosid, các aglycon được chiết ra bằng chloroform Dung dịch chloroform đem rửa với dung dịch natri bisulfit rồi tiếp theo với dung dịch HCl loãng Sau đó bốc hơi dung môi, cắn được đem sấy và cân Dược điển Liên Xô IX ứng dụng phương pháp này để định lượng các

oxymethylanthraquinon trong vỏ câyRhamnus frangula L và trong đại hoàng

Cách tiến hành: cân chính xác 2 g bột dược liệu, đun cách thủy trong bình

có ống sinh hàn hồi lưu trong 2 giờ rưỡi với 200 ml CHCl3 và 50 ml H2SO4 25% Sau đó lắc các dịch chiết CHCl3 với 50 ml dung dịch natri bisulfit 10% trong 5 phút Sau khi để yên tách lớp CHCl3, lọc và lắc với dung dịch acid hydrochloric 1% trong 5 phút Sau khi 2 lớp phân cách rõ ràng, người ta tách lớp dưới, lọc và bốc hơi CHCl3, sấy, lúc đầu 600 rồi sau đó 800C đến khi khối lượng không đổi

- Phương pháp so màu:

Phương pháp này dựa trên phản ứng màu Borntraeger Tschirch là người đầu tiên đưa ra phương pháp để định lượng anthranoid trong đại hoàng Theo tác giả, bột đại hoàng được đun sôi với dung dịch H2SO4 loãng, sau đó chiết bằng ether Từ dịch ether lại chiết bằng kiềm rồi đo màu Nhiều tác giả khác có thay đổi một số điều kiện về dung môi hữu cơ, acid, thời gian thủy phân, loại dung dịch kiềm để làm phản ứng màu Sau đây chỉ trình bày phương pháp của Auterhoff là phương pháp được nhiều người chấp nhận Nguyên tắc của phương pháp là đun dược liệu với acid acetic để thủy phân các glycosid, sau đó thêm ether để chiết aglycon Từ dịch acid acetic - ether (chú ý acid acetic hoà tan trong ether) các aglycon được lắc nhanh với dung dịch xút cộng với ammoniac Dung dịch kiềm có màu đỏ, được đem đo mật độ quang Đường cong chuẩn được xây dựng với chất mẫu istizin (= 1,8-dihydroxyanthraquinon) hoặc acid chrysophanic được pha cũng trong dung dịch xút + ammoniac hoặc dựa vào dung dịch cobalt chlorid; dung dịch này có màu hồng như màu của phản ứng Mật độ quang của 0,36mg istizin trong 100ml dung dịch xút + ammoniac (5g NaOH trong 50ml nước thêm 2ml ammoniac đậm đặc và thêm đủ 100ml với nước cất) bằng mật độ quang của dung dịch cobalt chlorid 1%

Phương pháp này hạn chế tới mức thấp nhất sự oxy hoá các chất ở dạng khử anthron Các chất này có màu vàng trong môi trường kiềm nên không cản trở sự định lượng Nếu muốn định lượng anthranoid toàn phần cần oxy hoá các dẫn chất anthron bằng cách đặt các dung dịch đã phản ứng với kiềm lên nồi cách thủy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

trong 20 phút Ở môi trường kiềm cộng với nhiệt độ và không khí, các dẫn chất anthron sẽ bị oxy hoá thành anthraquinon Hiệu giữa 2 lần đo trước và sau khi oxy hoá cho phép ta tính được hàm lượng của các dẫn chất anthron

Nếu muốn định lượng các aglycon ở dạng tự do trong dược liệu thì không qua giai đoạn thủy phân mà chỉ cần chiết các aglycon tự do bằng ether rồi thêm dung dịch kiềm để làm phản ứng màu

Phương pháp Auterhoff đã được đưa vào Dược điển Việt Nam để định lượng những dẫn chất anthranoid trong dược liệu

- Phương pháp thể tích của Tschirch và Schmitz:

Nguyên tắc của phương pháp là dùng dung dịch KOH 0,1 N để tác dụng lên các dẫn chất anthraquinon rồi chuẩn độ kiềm thừa bằng HCl 0,1 N; sự chuyển màu từ đỏ sang vàng của phản ứng thay cho chỉ thị màu Phương pháp này thiếu chính xác

- Phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC

HPLC được thực hiện dựa trên việc bơm để đẩy một lượng chất lỏng dưới

áp suất cao và hỗn hợp mẫu cần phân tích đi qua một cột được nhồi đầy một loại chất hấp phụ và từ đó dẫn tới việc tách các thành phần của mẫu Chất hấp phụ – được nhồi trong cột, là các hạt rắn (như silica, polymers) với kích thước từ 2 – 50

µm Các thành phần trong hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau nhờ vào mức độ tương tác khác nhau với các hạt chất hấp phụ Dòng chất lỏng dưới áp suất cao thường là hỗn hợp của các dung môi (nước, acetonitrile và/hoặc methanol), được gọi là “pha động” Thành phần và nhiệt độ dung môi đóng vai trò chính trong quá trình tách chất do tương tác xảy ra giữa các thành phần của mẫu và chất hấp phụ

Về bản chất, các tương tác này là tương tác vật lý như tương tác kị nước (phân tán), tương tác lưỡng cực và tương tác ion, thông thường nhất là tổng hợp của tất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

từ 2-50 µm) Điều này cho phép HPLC khả tách các hỗn hợp một cách hữu hiệu

và trở hành một kỹ thuật sắc ký phổ biến

- Phương pháp quang phổ UV-Vis

Trong quang phổ học, ánh sáng nhìn thấy (ánh sáng khả kiến), tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia Rơnghen, sóng radio đều được gọi chung một thuật ngữ

là bức xạ Theo thuyết sóng, các dạng bức xạ này là dao động sóng của cường độ điện trường và cường độ từ trường, nên bức xạ còn được gọi là bức xạ điện từ Sau thuyết sóng, thuyết hạt cho thấy bức xạ gồm các “hạt năng lượng” gọi là photon chuyển động với tốc độ ánh sáng (c = 3.108 m/s) Các dạng bức xạ khác nhau thì khác nhau về năng lượng của các photon Ở đây, năng lượng của bức xạ

đã được lượng tử hóa, nghĩa là năng lượng của bức xạ không phải liên tục mà các lượng tử năng lượng tỉ lệ với tần số của dao động điện từ

Phương pháp đường chuẩn

Ưu điểm là chính xác, thực hiện được nhiều lần

+ Chuẩn bị từ 6 dung dịch chuẩn (trong khoảng tuân theo định luật Beer) + Đo độ hấp thụ quang A của dung dịch ở λmax so với các dung dịch so sánh được chuẩn bị giống như dung dịch tiêu chuẩn nhưng không chứa ion cần xác định

+ Biểu diễn sự phụ thuộc A theo C trên đồ thị hoặc tính theo phương trình hồi qui A= aC + b (a và b là hệ số cần tìm của phương trình hồi quy – tương quan)

Sau khi đo được giá trị độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn, chúng

ta có thể tiến hành xây dựng đường chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy tương quan Sau khi thiết lập đường chuẩn, ta được dạng phương trình y = ax + b với y

là độ hấp thụ quang, x là nồng độ Đối với dung dịch xác định, ta tiến hành phản ứng và đo được hệ số hấp thu của mẫu (A mẫu = y), ta có thể tính được nồng độ của mẫu cần xác định theo phương trình:

x = (y – b)/a

Chiết xuất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

Muốn chiết xuất glycosid, dùng cồn ethylic hoặc cồn methylic hoặc hỗn hợp cồn - nước.Muốn chiết phần aglycon, thủy phân bằng acid sau đó chiết bằng ether hoặc chloroform

2.3 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ RỄ TƠ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN NUÔI CÁY RỄ TƠ

2.3.1 Khái niệm về rễ tơ

Rễ tơ được tạo ra do sự chuyển gen sử dụng hệ thống vector tự nhiên từ tác

nhân gây bệnh là Agrobacterium rhizhogenses

Rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra Hê ethống rễ đa bội là nơi lý tưởng để sản sinh ra hóa chất thực vâte và chúng rất ổn đineh về di truyền Rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, sinh trưởng nhanh Đặc biệt hơn ở hệ thống nuôi cấy lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dược phẩm sinh học tái tổ hợp ra ngoài môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh sạch các dược phẩm sinh học này

Nuôi cấy rễ tơ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất hợp chất thứ cấp, tạo giống cây trồng mới, mô hình nghiên cứu phytoremediation, tìm hiểu con đường sinh tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học, nghiên cứu sinh lý của rễ và sản xuất protein tái tổ hợp Trong đó, việc nghiên cứu để sản xuất hợp chất thứ cấp

từ rễ tơ được chú trọng hơn cả Cho tới nay, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất thành công các protein tái tổ hợp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơ như SEAP protein huỳnh quang kết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B, fungal phytase, và đặc biệt hơn cả là các kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối và khả năng tổng hợp hoạt chất thứ cấp ở rễ tơ

Quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong rễ tơ được kiểm soát bởi hệ gen, tuy nhiên chúng cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố dinh dưỡng và các nhân

tố môi trường Các yếu tố ảnh hưởng có thể là nguồn cacbon, nguồn nitơ tổng và hàng loạt các yếu tố khác như ánh sáng, nhiệt độ, pH môi trường và các chất kích kháng bảo vệ thực vật Để đạt được hiệu quả cao nhất, các điều kiện nuôi cấy cần được tối ưu hóa và được kiểm soát chặt chẽ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

Trong nghiên cứu của Yu và cộng sự (2005) ở rế tơ cây P ginseng cho thấy rễ tơ

cảm ứng với dải bước sóng anh sáng khác nhau gây ảnh hưởng với sự sinh trưởng và tổng hợp các hợp chất mặc dù việc thu sinh khối rễ tơ đạt được thấp hơn khi được nuôi cấy trong môi trường chiếu sáng huỳnh quang (50 µmol m-2s-

1/ ngày) thấp hơn nuôi cấy trong tối dựa trên kết quả thí nghiệm, 2 bước nuôi cấy, bước trong tối và sau đó là nuôi cấy trong ánh sáng huỳnh quang , cho thấy lượng sản xuất ginengnoid Một nhóm nghiên cứu khác công bố ảnh hưởng của ánh sáng có bước sóng 385-790nm với sự phát triển và tổng hợp artermisinin của

rễ tơ cây A annua Rễ được nuôi trong điều kiện lắc 120 rpm ở 25oC và 16 giờ ánh sáng (trắng, đỏ, xanh dương, xanh lá, vàng) với cường độ 25µmol m-2s-1/ ngày Sau 30 ngày, ánh sáng đỏ tại 660nm cho thấy việc thúc đẩy sinh khối (5,73 g/l) và lượng hớp chất chất arteminisin thu được là 31 mg/g DW), khối lượng này lần lượt là 17 và 67%, cao hơn khi nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng trắng Anh sáng có thể hoạt hóa tín hiệu cho sự hoạt động của các enzyme chính trong quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp

Sự khác nhau giữa định chất lượng và khối lượng trong việc sản xuất

diterpenoid và ttriterpenoid trong rễ tơ của S sclarea sinh trưởng trong điều kiện

chiếu sáng liên tục (với đền huỳnh quang tại 40 µmol m-2s-1/ ngày và trong tối như trong tiến hành của Kuzma và công sự Ánh sáng làm tăng nồng độ diterprnoid một cách rõ rệt và ảnh hưởng không nhiều đến thành phần triterpenoid ở rễ tơ Sự khác biệt về thành phần của triterpenoid phân biệt giữa từ

rễ sinh trưởng trong tối và trong ánh sáng đã được cảm ứng cho số nhóm

hydroxy trong skeleton ursine Trong nuôi cấy rễ tơ của cây A annua, tỷ lệ tăng

trưởng của rễ tơ tăng một cách rõ rệt khi nuôi cấy trong cường độ ánh sáng từ

0-3000 lux Sinh khối thu được dưới điều kiện chiếu sáng (24h) cao hơn khi nuôi cất trong điều kiện chiếu sáng liên tục và trong các khoảng thời gian chiếu sáng khác (8, 12, 16h) sau 30 ngày Tuy nhiên, artemisinin dưới điều kiện chiếu sáng liên tục cho kết quả thấp hơn khi chiếu sáng

2.3.2.2 Nhiệt độ

Toi và cs (1991) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

tổng hợp alkaloid indol dòng rễ chuyển gen No8 cây Catharanthus roseus Dòng

rễ tơ No8 được nuôi trên môi trường B5 lỏng, 40g/l sucrose, 45mg/l (NH4)2SO4, 0,5g/l carbenicillin ở các nhiệt độ khác nhau là 19,5℃; 24℃; 42℃ Nhiệt độ hạ thấp sẽ kích thích rễ làm tăng hàm lượng lipid không bão hòa, mà chủ yếu là tăng lượng axit inilenic Sự thay đổi trong thành phần lipid làm cho màng tế bào thích nghi với các nhiệt độ, hàm lượng alkaloid tích lũy có sự gia tăng rõ rệt

2.3.2.3 pH môi trường

pH môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến việc tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở rễ tơ G Sivakumar và cs (2005) đã chỉ ra những tác động của pH ban đầu

lên sự tăng trưởng rễ tơ Panax ginseng C.A Meyer và sản xuất ginsenoside trong

môi trường MS pH ban đầu khoảng 6,0 - 6,5 trước khi khử trùng là pH tối ưu cho sự phát triển rễ tơ và sản xuất ginsenoside Tốc độ tăng trưởng tối đa (7,44%)

và năng suất tối đa (239,68 mg/l) ginsenoside thu được tương ứng ở pH 6,0 và 6,5 pH ban đầu dưới 4,0 hoặc cao hơn 7,0 thì sự tăng trưởng rễ tơ và sản xuất ginsenoside bị ức chế mạnh pH quá thấp, nhôm và hydro trong môi trường sẽ gây độc hại đến hệ thống rễ của nhân sâm Nếu độ pH quá cao, chất dinh dưỡng

vi lượng có thể không được rễ tơ hấp thu

A.Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes Các rễ

foenum-tơ cây này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %) Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng

2.3.2.4 Sử dụng Elicetor để tăng cường tổng hợp các hợp chất thứ cấp

Elicitor là các hóa chất được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau, có thể gây ra thay đổi về mặt sinh lý đối với sinh vật sống bị tác động theo nghĩa rộng hơn, Elicitor là các chất tác động vào thực vật, kích hoạt các phản ứng sinh lý; hình thái, tích tụ phytoalexin và kết hợp với các cơ chế phòng thủ thực vật tương tác này dẫn tới sự tổng hợp hoặc giải phóng các hợp chất thứ cấp (Zhao và cộng sự, 2005) Elicitor có thể được phân loại, dựa trên nguồn gốc, thành hai nhóm chính;

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

sinh học và phi sinh học Các elicitor sinh học là các đại phân tử như oligosaccharides (ví dụ, chitin, chitosan) polysaccharides có nguồn gốc từ tế bào thực vật (ví dụ như pectin hoặc cellulose), phospholipid và các glycoprotein, các phân tử nhỏ như 15 hydrogen peroxide, ethylene, methyl jasmonate, và acid salicylic elicitor phi sinh học thường dùng các muối vô cơ như thủy ngân clorua (HgCl2), đồng sunfat (CuSO4), calcium chloride (CaCl2), và vanadyl sulfate (VSO4), bao gồm cả các tác nhân gây ức chế cơ học như bức xạ cực tím, gây thương tích và các hóa chất làm thay đổi cấu trúc của màng Những elicitor tương tác với các tế bào thực vật thong qua nhiều cơ chế khác nhau và phức tạp (Darvill và Albersheim, 1984; Benhamou, 1996)

Một vài các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các elicitor sinh học, elicitor carbohydrate, đặc biệt, trong khi những tác động của elicitor phi sinh học trong việc sản sinh các hợp chất thứ cấp ở thực vật chưa được hiểu rõ Những giả thuyết được đưa ra là sự kích kháng liên quan đến ion truyền tin Ca 2+, yếu tố ảnh hưởng đến sự toàn vẹn của màng tế bào, ức chế / kích hoạt của các đường hướng trong nội bào và những thay đổi áp suất thẩm thấu bằng những tác nhân gây ức chế.(Radman và cộng sự, 2003) Phản ứng đầu tiên chống lại sự kích kháng là nhận diện chất kích kháng, gắn nó với một protein thụ thể trên màng sinh chất, giai đoan tiếp theo, ức chế hoạt động của protein ATPase trên màng sinh chất dẫn tới làm giảm gradient điện tích dương qua màng (Dörnenburg và Knorr, 1995) Chitin và chitosan là elicitor hiệu quả, được sử dụng rộng rãi Liệu pháp Chitosan làm tăng lên rất nhiều tính thấm của màng tế bào trong nuôi cấy tế bào gián đoạn (Brodelius và cộng sự, 1989) Sản sinh phytoalexin và các lớp hydrogen peroxide cũng là phản ứng của thực vật với chất kích kháng chitosan

Có bằng chứng trên những đường truyền tín hiệu tham gia vào các hoạt động kích kháng Các nghiên cứu chỉ ra rằng chitosan kích thích sự tích tụ của acid jasmonic, một phân tử tín hiệu liên quan đến việc quy định gen phòng thủ Hơn

nữa, liệu pháp sử dụng chitosan trong nuôi cấy Rubia Tinctorum tăng cường

Việc dẫn truyền tín hiệu elicitor trong tế bào thực vật có thể là một cơ chế hữu ích trong sản xuất hợp chất thứ cấp Các thong tin thứ cấp được tạo ra và truyền dẫn để kích hoạt dòng thác các protein kinase, kích hoạt khả năng sinh tổng hợp nhưng sản phẩm cụ thể ở thực vật Một cơ chế kích kháng sinh học ở thực vật có thể được tóm lược trên cơ sở của sự tương tác elicitor - thụ thể Khi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

thực vật hay tế bào thực vật được nuôi cấy đang bị tác động bởi các elicitor một loạt các phản ứng sinh hóa nhanh chóng xảy ra theo trình tự từng bước được mô

tả dưới đây (Radman và cộng sự, 2003)

- Gắn các elicitor với các thụ thể trên màng sinh chất

- Những thay đổi trong dòng ion qua màng: dòng Ca2+ vào tế bào chất từ môi trường ngoại bào và nội bào chứa Ca2+; kích thích hoạt động của bơm K+

- Axit hóa tế bào chất do H + -ATPase bất hoạt, giảm phân cực màng tế bào

và tăng pH ngoại bào

- Sự kích hoạt các NADPH oxidase chịu trách nhiệm về ROS và sự axit hóa dịch bào tương

- Tổ chức lại bộ khung tế bào

- Sản phẩm của ROS như các anion superoxide và H2O2 có thể có tác dụng trực tiếp kháng vi sinh vật cũng như góp phần vào việc tạo ra những nhóm dẫn xuất của các axit béo có hoạt tính sinh học và được tham gia vào các liên kết ngang với prolinerichproteins bao quanh thành tế bào H2O2 có thể hoạt động như một thông tin thứ cấp và tham gia vào việc kích hoạt quá trính phiên mã của gen phòng thủ

- Tích tụ của các protein liên quan đến phòng thủ hoặc các protein liên quan đến tác nhân gây bệnh như chitinases, glucanases và endopolygalacturonases đóng góp vào việc giải phóng tín hiệu oligomer pectic (elicitor nội sinh), hydroxyproline-rich glycoproteinsvà các chất ức chế protease

- Cái chết tế bào ở các vùng bị lây nhiễm (phản ứng siêu nhạy)

- Thay đổi cấu trúc thành tế bào (sự ligni hóa của vách tế bào, xuất hiện mô sẹo)

- kích hoạt Phiên mã các gen phòng thủ tương ứng

- Phân tử bảo vệ thực vật như tannin và phytoalexin được phát hiện 2-4 h

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

sau khi kích thích với các elicitor

- Tổng hợp các axit salicylic và jusmonic là những thông tin thứ cấp

đề kháng Ngoài vai trò bảo vệ, MJ cũng có tác động đến sự chết tế bào và già hóa của lá, chúng có thể tương tác với nhiều kinase và các yếu tố phiên mã có liên quan đến sự già hóa MJ cũng có thể gây ra cái chết của ty thể và lạp thể bằng cách gây tích tụ của các phản ứng oxy, các hợp chất này phá vỡ màng ty thể

và làm tổn hại tế bào bằng cách gây ra apoptosis Vai trò của MJ trong các quá trình này là phát tín hiệu kích thích khả năng tự vệ của cây chống lại những stress

và hạn chế lây lan sự nhiễm bệnh

Wang và cs (2007) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của MJ đến sự sinh tổng hợp và giải phóng tanshinone khi nuôi cấy rễ tơ đan sâm Kết quả thu được sau 9 ngày bổ sung MJ, lượng cryptotanshinone và tanshinone IIA tăng lần lượt 23,8 và 6,2 lần so với đối chứng không bổ sung MJ

b,Yeast extract (YE)

Yeast extract - chiết xuất nấm men (hay còn gọi là cao nấm men) là nội bào của tế bào nấm men Chúng gồm tế bào chất, nhân tế bào và các cơ quan tế bào

và thường rất giàu axit amin, vitamin (vitamin B, Glutathione), cacbon hydrat và muối Chúng được sử dụng chủ yếu để tạo ra hương vị ngon miệng tự nhiên trong ngành thực phẩm và như các chất dinh dưỡng cho việc nuôi vi khuẩn trong

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

ngành dược phẩm Cao nấm men có nhiều dạng khác nhau như dạng sệt hoặc dạng bột Cao nấm men thường có 50-75% protein, 4-13% carbon hiydrat và không có lipit

YE lần đầu tiên được sử dụng như một yếu tố elicitor sinh học để kích thích sản xuất chuyển hóa các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ tơ đan sâm bởi Chen

và cs (2001) Nghiên cứu đã sử sụng một phương pháp sắc kí lỏng khối lượng Spetrometry (LC – MS) Kết quả: YE làm thúc đẩy sự phát triển của rễ tơ và tăng cường sự tích lũy hoạt chất tanshinone và axit phenolic

Nghiên cứu của Yang và cs (2012) cho thấy: dịch chiết nấm men và sợi

nấm viên của Streptomyces pactum Act12 (Act12) có thể thúc đẩy sự tích tụ đường hòa tan và tăng sự tích lũy tanshinone trong rễ tơ Salvia miltiorrhiza đồng

thời ức chế sự tích tụ protein hòa tan trong rễ tơ Act12 tăng cường sự biểu hiện của gen 3-hydroxy-3-methyglutary 1-CoA reductase (HMGR), 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS), 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) và geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS) Trong đó, gen HMGR biểu hiện tăng gấp 33,66 lần so với đối chứng, điều này chứng tỏ rằng Act12 có ảnh hưởng đáng kể đến việc tăng tích lũy tanshinone trong rễ tơ, nhất là cryptotanshinone

2.2.4 Các nghiên cứu liên quan nhân nuôi sinh khối rễ tơ

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về tổng hợp, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng phương pháp nuôi cấy sinh khối tế bào So với nuôi trồng tự nhiên thì nuôi cấy sinh khối tế bào có nhiều ưu điểm vượt trội như không chịu tác động các yếu tố tự nhiên, điều kiện nuôi cấy được kiểm soát chặt chẽ, có thể chủ động điều khiển quá trình sinh tổng hợp cũng như tích lũy hợp chất mong muốn, thời gian thu sản phẩm được rút ngắn Tuy nhiên, các tế bào nuôi cấy sinh khối lại thiếu sự ổn định di truyền, chất lượng sản phẩm bị ảnh hưởng bởi các chất điều tiết sinh trưởng có khả năng tồn dư

Hu và Alfermann (1993) đã tiến hành tạo rễ Salvia miltiorrhiza chuyển

gen bằng cách lây nhiễm các bộ phận của cây được nuôi cấy trong điều kiện

vô trùng với các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes khác nhau

Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến khả năng cảm ứng rễ tơ từ lá cây đan sâm, chủng vi khuẩn LBA 9402 có mang plasmid pRi 1855 cảm ứng tạo rễ tơ tốt nhất Nghiên cứu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

cũng cho thấy acetosyringone (20µM) giúp làm tăng hiệu quả chuyển gen; môi trường không có hormone sinh trưởng, ammonium nitrate và bổ sung 3% sucrose vào ngày nuôi cấy thứ 12 có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng và tích lũy diterpenes của rễ tơ

Trong rễ đan sâm không chuyển gen, vẫn có sự tổng hợp tanshinone tuy nhiên thời gian nuôi cấy dài Rễ chuyển gen (rễ tơ) với đặc điểm sinh trưởng nhanh mà không cần bổ sung hormone sinh trưởng, tính ổn định di truyền cao nên nuôi cấy rễ tơ bằng hệ thống nuôi cấy mô thực vật rất thuận tiện và hiệu quả cho các nghiên cứu và phát triển khoa học trong công nghệ sinh học thực vật cũng như công nghệ sản xuất sinh khối các cây dược liệu (Guillon và cs, 2006) Chen và cs (2001) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết nấm men đến sự tăng trưởng và tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong rễ tơ đan sâm Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, dịch chiết nấm men giúp tăng cường tích lũy hai loại axit phenolic và tanshinone Sự tích lũy cryptotanshinone tăng từ 0,001% lên 0,096%, axit rosmarinic tăng từ 1,24% lên 2,89% và axit lithospermic B tăng từ 1,25% lên 2,98% (theo khối lượng khô)

Ge và Wu (2005) tiến hành nghiên cứu sự tổng hợp tanshinone và các con đường trao đổi hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ tơ đan sâm dưới sự cảm ứng của dịch chiết nấm men (YE) và ion Ag+ Kết quả cho thấy, sự tích lũy tanshinone tăng sau 2 ngày xử lý với YE (30 µM) và YE (100 µg/ml) Ag+ có ảnh hưởng tới hoạt tính của 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA redutase (HMGR) và

YE có tác động lớn hơn Ag+ trong ảnh hưởng tới hoạt tính của xylulose 5-phosphate synthase (DXS) Chất ức chế non –MVA (DXP - xảy ra trong plastid) ức chế sự tổng hợp tanshinone bị tác động bởi cả YE và Ag+ Trong khi đó, chất ức chế con đường MVA (ức chế mevinolin – xảy ra trong bào tương) chỉ ức chế sự tích lũy tanshinone được cảm ứng bởi Ag+. Các kết quả đưa

l-deoxy-D-ra đã chứng minh sự tích lũy tanshinone được cảm ứng bởi YE và Ag+ chủ yếu được tổng hợp qua con đường non –MVA (DXP) hoạt động nhưng cũng có thể phụ thuộc vào sự tương tác giữa hai con đường MVA và non – MVA

Năm 2005, Yan và cs đã sử dụng 3 yếu tố là elicitor (YE), sự hấp thụ tại chỗ tanshinone (in situadsorption) sử dụng resin trùng hợp kị nước (X-5) và chế

độ điều khiển bán liên tục nhằm tăng sự tổng hợp tanshinone và các hợp chất thứ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

cấp Nghiên cứu cho thấy việc xử lý YE kích thích quá trình sinh tổng hợp tanshinone, làm tăng hàm lượng tanshinone tổng số (gồm 3 loại tanshinone chính

là cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA) trong rễ lên gấp khoảng hai lần Môi trường nuôi cấy được bổ sung X - 5 resins làm tăng hàm lượng nhỏ tanshinone nhưng lại giúp thu lại được trên 80% tanshinone từ rễ đan sâm Sử dụng chế độ nuôi cấy bán liên tục, bổ sung YE và thay thế resins từ giai đoạn muộn của pha sinh trưởng theo cấp số mũ, khối lượng rễ khô tăng lên đến 30,5 g/l (chế độ thông thường, khối lượng rễ khô chỉ tăng 8-10 g) và hàm lượng tanshinone tăng lên gấp 15 lần Kết quả này đã chứng minh sự phối hợp giữa các yếu tố elicitor, sự hấp thụ tại chỗ hay chế độ nuôi cấy bán liên tục đều có thể làm tăng sự tích lũy tanshinone trong nuôi cấy rễ tơ đan sâm

Anna và cs (2007) đã tiến hành nuôi cấy tạo callus để xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp và sự sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học Callus sau đó được nuôi cấy trong môi trường rắn và lỏng lắc cùng với các điều kiện ánh sáng khác nhau và trong tối hoàn toàn Kết quả thu được, khi nuôi ở môi trường rắn, tổng lượng axit phenolic trong callus tăng trung bình từ 2,58% đến 5,72% trong tối về khối lượng khô Trong khi đó, axit rosmarinic tích lũy được 1,66% (điều kiện chiếu sáng) và 1,54% (trong tối hoàn toàn) Kết quả trên đã cho

thấy, nuôi cấy in vitro tạo sinh khối có nhiều ưu việt so với nuôi trồng tự nhiên,

như: điều chỉnh và kiểm soát nghiêm ngặt các điều kiện nuôi cấy, không phụ thuộc vào các yếu tố tự nhiên (đất đai, khí hậu ), có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp để tích lũy được các hợp chất mong muốn và rút ngắn thời gian thu hoạch sản phẩm

Năm 2007, Shi và cs cũng tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các chất có tính thẩm thấu cao và YE để tăng cường tổng hợp diterpenoid tanshinone trong rễ tơ đan sâm Sorbitol được sử dụng như một yếu tố thẩm thấu

ở nhiều nồng độ khác nhau (30-100 g/l) trong nuôi cấy rễ tơ trên môi trường MS Sorbitol làm tăng tổng hàm lượng tanshinone trong rễ cao nhất ở nồng độ 50-70 g/l, tăng gấp 4,5 lần so với đối chứng Sự kết hợp giữa YE và sorbitol làm tăng tổng hàm lượng tanshinone lên đến 10 lần và sản lượng tanshinone tăng 9 lần về thể tích so với đối chứng Kết quả chỉ ra rằng, việc sử dụng kết hợp các chất có tính thẩm thấu cao cùng một yếu tố elicitor hữu cơ có thể tăng cường tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ tơ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

Việc tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở thực vật thường liên quan đến phản ứng phòng thủ của cây trồng đối với các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, các thành phần của tế bào vi khuẩn, đặc biệt là carbohydrate hay polysaccharide đã được sử dụng rộng rãi như là các elicitor để cảm ứng hay kích thích sự tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở tế bào hay mô nuôi cấy thực vật Zhao và cs (2010) đã tiến hành

nghiên cứu ảnh hưởng của 25 polysaccharide của vi khuẩn nốt sần Bacillus cereus (BPS) đến sự sinh trưởng và tổng hợp tanshinone của rễ tơ Salvia miltiorrhiza Kết quả cho thấy, việc bổ sung BPS vào môi trường nuôi cấy rễ với

nồng độ 100 - 400 mg/l vài ngày trước pha sinh trưởng cân bằng, kích thích sự tích lũy tanshinone trong rễ cây khoảng 7 lần

Trên thế giới chưa nghiên cứu trên rễ tơ cây ba kích Tại Việt Nam, Lê

Thị Thanh Hương (2014) đã tạo rễ tơ cây ba kích, cảm ứng bởi vi khuẩn A Rhizogenes Năm 2015, Nguyễn Quỳnh Chi đã chứng minh rễ tơ cây ba kích sinh

trưởng tốt nhất trên môi trường B5 Trong nghiên cứu, Ngô Thị Thương (2015) cũng đã chỉ ra rằng khi bổ sung elicitor 100 mg/l YE + 0,025 mM MJ thu được sinh khối rễ tơ và hàm lượng anthraquinone cao nhất trong điều kiện chiếu sáng

3 tuần đầu (16 sáng – 8h tối), 5 tuần tối hoàn toàn Tuy nhiên, việc nghiên cứu mới chỉ bước đầu khảo sát lần lượt từng yếu tố riêng biệt trong quy trình nuôi cấy

rễ tơ ba kích Vì vậy, việc kết hợp các yếu tố trên và tìm ra được điều kiện nuôi cấy tối ưu bước đầu giúp cho việc ứng dụng nuôi cấy công nghiệp rễ tơ cây ba kích là vô cùng cần thiết

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Rễ tơ ba kích (dòng M4) do phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật- Khoa Công nghệ Sinh học- Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam cung cấp

3.1.2.Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

- Dụng cụ : bình nuôi cấy, ống đo thể tích, dao, panh, chày cối sứ

- Các trang thiết bị phòng thí nghiệm: buồng cấy, máy ly tâm, bể ổn nhiệt, máy cất nước, máy đo pH, máy khuấy từ, cân phân tích, cân kỹ thuật, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh (4ºC), máy đo mật độ quang, phòng nuôi cấy mô

3.1.3 Hóa chất

- Các dung dịch: magnesium acetate, methanol,

- Dung môi: Chloroform

- Elicitor: Dịch chiết cao nấm men, Methyl jasmonic

- Môi trường sử dụng: B5+30 g/l đường, pH=5,7-5,8 Môi trường hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, áp suất 1,1 atm

3.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật- Khoa Công nghệ Sinh học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2014 đến tháng 8/2015

3.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nội dung nghiên cứu

3.3.1.1 Nôi dung 1:Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong các điều kiệnchiếu sáng khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ cây ba kích

a, Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến tốc độ tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ cây ba kích

Ánh sáng là yếu tố vật lý quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng

và phát triển của rễ tơ và hình thành và chuyển hóa các hợp chất thứ cấp Các điều kiện chiếu sáng trong ngày khác nhau được tiến hành nghiên cứu nhằm tìm

ra điều kiện chiếu sáng thích hợp cho nuôi cây rễ tơ Cùng với đó,việc nuôi cấy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26

rễ tơ yêu cầu một khoảng thời gian xác định mà trong giai đoạn này rễ tơ tăng trưởng nhanh, sinh hoạt chất mạnh Bởi vậy yếu tố thời gian được kết hợp với điều kiện chiếu sáng khác nhau được tiến hành thí nghiệm Các thí nghiệm bố trí

3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 2 mẫu Nhân tố thí nghiệm là điều kiện chiếu sáng trong ngày xét trong từng giai đoạn 3 tuần, 5 tuần, 8 tuần, 10 tuần

Bố trí thí nghiệm:

Công thức (CT) Điều kiện chiếu sáng Thời gian nuôi cấy

CT1 16h sáng 8h tối 3, 5, 8, 10 tuần CT2 12h sáng 12h tối 3, 5, 8, 10 tuần CT3 8h sáng 16h tối 3, 5, 8, 10 tuần CT4 Tối hoàn toàn 3, 5, 8, 10 tuần

b, Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng trong các giai đoạn đầu chiếu sáng đến sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ

Thí nghiệm được thực hiện nhằm tìm ra thời gian chiếu sáng thích hợp trong giai đoạn đầu chiếu sáng nhằm tăng cường tổng hợp hoạt chất thứ cấp, khối lượng rễ tơ Các thí nghiệm bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 2 mẫu Nhân tố thí nghiệm là thời gian chiếu sáng trong giai đoạn chiếu sáng ban đầu Nhân tố phi thí nghiệm là điều kiện chiếu sáng trong giai đoạn

chiếu sáng ban đầu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27

chiếu sáng trong ngày khác nhau ở giai đoạn đầu có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu trong giai đoạn sinh trưởng của rễ tơ.Các thí nghiệm bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 2 mẫu Nhân tố thí nghiệm là điều kiện chiếu sáng trong 8 tuần nuôi cấy

Công thức thí nghiệm

Công thức (CT) Điều kiện chiếu sáng Thời gian nuôi cấy

CT1 3 tuần (16h sáng 8h tối) + 5 tuần

tối hoàn toàn

8 tuần

CT2 3 tuần (12h sáng 12h tối) + 5 tối

hoàn toàn

8 tuần

CT3 3 tuần (8h sáng 16h tối) + 5 tuần

tối hoàn toàn

8 tuần

CT4 8 tuần (16h sáng 8h tối) 8 tuần

3.3.1.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của elicitor đến sự tăng trưởng

và tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ

a, Thí nghiệm 4 : Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian bổ sung elicitor trước thời gian dừng nuôi cấy

Bổ sung 100 mg/l YE + 0,1 mM MJ, công thức đã được cho là tốt nhất so với việc bổ sung từng chất, trong điều kiện nuôi cấy 3 tuần (16h sáng- 8h tối), 5 tuần tối hoàn toàn (Ngô Thị Thương, 2015) Tiến hành bổ sung elicitor tại các thời điểm khác nhau trước thời điểm dừng nuôi cấy nhằm thời gian thích hợp nhất cho việc bổ sung elicitor Các thí nghiệm bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 2 mẫu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28

Dựa trên kết quả từ thí nghiệm nội dung 4, tiến hành kết hợp các điều kiện chiếu sáng khác nhau kết hợp với việc bổ sung elicitor trước 5 ngày dừng nuôi cấy nhằm xác định khả năng giúp tăng sinh khối rễ tơ của các yếu tố này Rễ tơ được nuôi cấy trong 8 tuần, bổ sung elicitor 5 ngày trước thời điểm dừng nuôi cấy Các thí nghiệm bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 2 mẫu

Bổ sung elicitor CT4 3 tuần (16h sáng 8h tối) + 5 tuần tối hoàn toàn

CT5 3 tuần (12h sáng 12h tối) + 5 tối hoàn toàn CT6 3 tuần (8h sáng 16h tối) + 5 tuần tối hoàn toàn

3.3.1.3 Nội dung 3: Xác định công thức tối ưu hóa nuôi cấy rễ tơ ba kích

Thí nghiệm 6: Xác định công thức tối ưu hóa nuôi cấy rễ tơ ba kích

Bố trí thí nghiệm

Công thức Chế độ chiếu sáng khi bổ sung elicitor

CT1 3 tuần (8h sáng 16h tối) + 5 tuần tối hoàn toàn, bổ sung elicitor 5 ngày

trước ngày dừng nuôi cấy CT2 3 tuần (8h sáng 16h tối) + 7 tối hoàn toàn, bổ sung elicitor 5 ngày trước

ngày dừng nuôi cấy

CT 3 5 tuần (8h sáng + 16 tối) + 5 tuần tối hoàn toàn, bổ sung elicitor 5 ngày

trước ngày dừng nuôi cấy CT4 10 tuần tối hoàn toàn, bổ sung elicitor 5 ngày trước ngày dừng nuôi cấy

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.3.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô:

Thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô hiện hành; môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung 7g/l agar, 3% sucrose, pH = 5,8; hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, áp suất 1 atm

Các thí nghiệm sử dụng dòng rễ tơ M4 Rễ tơ cây ba kích được cắt thành từng phần có khối lượng 0,5g và được cấy vào môi trường Bình nuôi cấy là bình trụ thể tích 250 ml, mỗi bình đổ 50 ml môi trường