tối ưu hóa quy tr ình nhân sinh khối rễ tơ cây ba kích (morinda officinalis how )

HỌC C VIỆN VIỆ NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - TRẦN HỒNG LIÊN TỐI ƯU U HÓA QUY TRÌNH TR NHÂN SINH KHỐII R RỄ TƠ CÂY BA KÍCH(Morinda KÍCH officinalis How.) LUẬN N VĂN V THẠC SĨĨ HÀ NỘI, NĂM 2015 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - TRẦN HỒNG LIÊN TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH NHÂN SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY BA KÍCH (Morinda officinalis How.) Chuyên ngành Mã số : Công nghệ sinh học : 60420201 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Trần Hồng Liên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, quan tâm, dạy dỗ tận tình thầy cô, cán phòng thí nghiệm với nỗ lực của thân em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Để có thành xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học toàn thể thầy cô tạo điều kiện dạy dỗ, truyền đạt cho kiến thức kĩ cần thiết suốt trình học tập Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đặc biệt, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo,Thạc sỹ Ninh Thị Thảo,giảng viên khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ suốt thời gian thực tập hoàn thành báo cáo tốt nghiệp Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành sâu sắc thầy cô môn Công nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện giúp hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn ThS Phạm Thị Thu Hằng cán phòng thí nghiệm nghiên cứu viên phòng thí nghiệm hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để hoàn thành khóa luận Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè giúp đỡ, chia sẻ động viên suốt trình học tập nghiên cứu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Tóm tắt viii Abtract ix Phần 1: Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung ba kích 2.1.1 Nguồn gốc, phân bố 2.1.2 Vị trí phân loại 2.1.3 Đặc điểm thực vật học 2.1.4 Đặc điểm sinh thái học 2.1.5 Công dụng 2.1.6 Giá trị dược liệu 2.2 Khái niệm chung Anthraquinone 2.2.1 Cấu trúc hóa học 2.2.2 Phân loại 2.2.3 Tác dụng sinh lý, công dụng Anthraquinone 10 2.2.4 Phân tích định tính định lượng anthraquinone 11 2.3 Khái niệm chung rễ tơ yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cáy rễ tơ 15 2.3.1 Khái niệm rễ tơ 15 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tăng sinh khối khả tổng hợp hoạt 2.2.4 chất thứ cấp rễ tơ 15 Các nghiên cứu liên quan nhân nuôi sinh khối rễ tơ 21 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 25 3.1 Đối tượng, vật liệu thời gian nghiên cứu 25 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 3.1.2 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 25 3.1.3 Hóa chất 25 3.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 3.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 25 3.2.1 Nội dung nghiên cứu 25 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 28 Phần Kết thảo luận 31 4.1 Kết 31 4.1.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy điều kiện điều kiệnn chiếu sáng khác đến tốc độ tăng trưởng tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ ba kích 4.1.2 31 Ảnh hưởng elicitor đến tăng trưởng tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ 39 4.1.3 Xác định công thức tối ưu hóa nuôi cấy rễ tơ ba kích 42 4.2 Thảo luận 44 4.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy điều kiện giai đoạn chiếu sáng khác đến tốc độ tăng trưởng tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ ba kích 4.2.2 4.2.3 44 Ảnh hưởng elicitor đến tăng trưởng tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ 47 Xác định công thức tối ưu hóa nuôi cấy rễ tơ ba kích 48 Phần Kết luận đề nghị 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Đề nghị 50 Tài liệu tham khảo 51 Phụ lục 56 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT B5 : Gamborg’sB5 (Môi trường dinh dưỡng trung bình) CRD : Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên CV% : Coefficient of variation (Hệ số biến thiên) HMGR : – hydroxyl – – methylglutaryl CoA reductase LDL : Low - Density – Lipoprotein LSD 5% : Least significant difference (Mức sai khác có ý nghĩa nhỏ 5%) MJ : Methyl jasmonate YE : Yeast extract (Cao nấm men) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Khối lượng rễ khô hàm lượng anthraquinone công thức khác Bảng 4.2 31 Khối lượng rễ tươi (gram) công thức sau 3, 6, 8, 10 tuần nuôi cấy 37 Bảng 4.3 Hàm lượng anthraquinone g mẫu khô công thứckhác 38 Bảng 4.4 Hàm lượng anthraquinone tổng số (µg) thu điều kiện nuôi cấy công thức khác sau tuần nuôi cấy không bổ sung elicitor Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 42 Page vi DANH MỤC HÌNH Số hình Tên hình Trang Hình 2.1 Cấu tạo phân tử chất 9,10 anthraquinone Hình 2.2 Con đường chuyển hóa chất anthraquinone từ đơn vị acetat Hình 2.3 Con đường chuyển hóa anthraquinone từ acid shikimic Hình 4.1 Hàm lượng anthraquinone 1gram mẫu khô công thức khác điều kiện chiếu sáng Hình 4.2 32 Sự sinhtrưởng rễ tơ nuôi cấy sau tuần điều kiện chiếu sáng khác Hình 4.3 32 Sự sinh trưởng rễ tơ nuôi cấy sau tuần điều kiện chiếu sáng khác Hình 4.4 32 Sự sinh trưởng rễ tơ nuôi cấy sau tuần điều kiện chiếu sáng khác Hình 4.5 33 Sự sinh trưởng rễ tơ nuôi cấy sau 10 tuần điều kiện chiếu sáng khác Hình 4.6 33 Sự sinh trưởng rễ tơ chu kỳ chiếu sáng thời gian nuôi cấy khác Hình 4.7 36 Hàm lượng anthraquinone rễ tơ nuôi cấy tuần công thức khác chu kỳ chiếu sáng Hình 4.8 38 Hàm lượng anthraquinone thu g mẫu khô công thức khác sau tuần nuôi cấy Hình 4.9 39 Sự sinh trưởng rễ tơ công thức khác thời điểm bổ sung elicitor trước dừng nuôi cấy Hình 4.10 40 Hàm lượng anthraquinone thu g mẫu khô công thức khác sau tuần nuôi cấy không bổ sung elicitor Hình 4.11 41 Hàm lượng anthraquinone g mẫu khô công thức khác điệu kiện chiếu sáng bổ sung elicitor Hình 4.12 43 Hàm lượng anthraquinone công thức khác điệu kiện chiếu sáng bổ sung elicitor Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 44 Page vii TÓM TẮT Nghiên cứuđược tiến hành nhằm tối ưu qui trình nhân nuôi rễ tơ ba kích cho khả tăng sinh khối tích lũy hàm lượng hoạt chất mục tiêu cao Trong đề tài này, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng khác củađiều kiện chiếu sáng, thời gian chiếu sáng tối ưu Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố elicitor thời điểm bổ sung elicitor trước dừng nuôi cấy Kết thu được: Nuôi cấy rễ tơ theo hai giai đoạn Giai đoạn 1, tuần đầu rễ tơ chủ yếu tăng sinh khối lượng Giai đoạn 2: rễ tơ tăng sinh chậm, hóa màu đen nâu, tích lũy hoạt chất mục tiêu mạnh.Ánh sáng có vai trò quan trọng việc cảm ứng rễ tăng sinh giai đoạn tuần bắt đầu nuôi cấy Giai đoạn tiếp theo, sư phát triển tích lũy hợp chất mục tiêu tăng mạnh rễ tơ nuôi cấy điều kiện tối Bổ sung elicitor trướ c ngày dừng nuôi cấy rễ tơ đạt tích lũy hàm lượng hoạt chất mục tiêu lớn so với thời gian 1, 3, 5, 10 ngày Bổ sung elicitor 100 mg/l YE + 0,1 mM MJ có khă làm tăng tích lũy hàm lượng hợp chất mục tiêu mạnh công thức nuôi cấy điều kiện chiếu sáng tuần 8h sáng 16h tối sau tuần tối hoàn toàn, bổ sung elicitor trước ngày dừng nuôi cấy.Công thức tối ưu hóa thu là: nuôi cấy rễ tơ điều kiện tuần (16h sáng-8h tối) + tuần tối hoàn toàn, bổ sung elicitor trước thời điểm dừng nuôi cấy ngày Các kết thí nghiệm góp phần tạo tiền đề cho trình xây dựng quy trình sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ ba kích, phục vụ cho ngành công nghiệp dược liệu Việt Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii 22 Merkli, P Christen, I Kapetanidis (1997) Production of diosgenin by hairy root cultures ofTrigonella foenum-graecum L Plant Cell Reports 16: 632-636 23 Mukudan, U., Hjortso, M.A (1991) Effect of light on growth and thiophene accumulation in transformed roots of Tagetes patula.J Plant Physiol 138: 252-255 24 Radman, R., T Saez, C Bucke and T Keshavarz 2003 Elicitation of plants and microbial systems Biotech Appl Biochem 37: 91-102 25 Shin JS, Yun KJ, Chung KS, Seo KH, Park HJ, Cho YW, Baek NI, Jang D, Lee KT (2013) Monotropein isolated from the roots of Morindae officinalis ameliorates proinflammatory mediators in RAW 264.7 macrophages and dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis via NF-κB inactivation Food Chem Toxicol 53:263 26 Taya, M Sato, H Masahiro, K Tone (1994) Characterization of pak-bung green hairy roots cultivated under light irradiation J Ferment Bioeng 78:42–48 27 Toivonen L., Ojala M., Kauppinen V (1991) Studies on the optimization of growth and indole alkaloid production by hairy root cultures of Catharanthus roseus Biotechnol Bioeng 37: 673-80 28 Yang D., Ma P., Liang X., Zheng Wei, Zongsuo Liang, Yan Liu, Fenghua Liu (2012) PEG and ABA trigger methyl jasmonate accumulation to induce the MEP pathway and increase tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy roots Physiologia Plantarum 146: 173–183 29 Yang X, Zhang YH., Ding CF, Yan ZZ (2006) Extract from Morindae officinalis against oxidative injury of function to human sperm membrane Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 31(19):1614-1617 30 Yu KW, Murthy HN, Hahn EJ, Paek KY (2005) Ginsenoside production by hairy root cultures of Panax ginseng: influence of temperature and light quality Biochem Eng J 23: 53–56 31 Zachary Marsh, Tianhong Yang, Luis Nopo-Olazabal, Shuchi Wu (2014) Effect of light, methyl jasmonate and cyclodextrin on production of phenolic compounds in hairy root cultures of Scutellaria lateriflora Phytochemistry, 107 32 Zhang Hai-Long, Zhang Qing-Wen, Zhang Xiao-Qi, YE Wen-Cai, Wang Yi-Tao (2010) Chemical Constituents from the Roots of Morinda officinalis 8(3): 192-195 33 Zhao, J., L.C Davis and R Verpoorte 2005 Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites Biotech Adv 23: 283-333 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 34 M Torkamani, Naser Abbaspour, M Jafari, A Samadi (2014) Elicitation of Valerenic Acid in the Hairy Root Cultures of Valeriana officinalis L (Valerianaceae) Tropical Journal of Pharmaceutical Research: 943-949 35 Sayed Farag, Oliver Kayser (2015) Cannabinoids Production by Hairy Root Cultures of Cannabis sativa L American Journal of Plant Sciences: 1874-1884 36 Grzegorczyk I, Królicka A, Wysokińska H (2006) Establishment of Salvia officinalis L hairy root cultures for the production of rosmarinic acid.Z Naturforsch C:351-6 37 Masoumeh Khalili, Tahereh Hasanloo, Seyyed Kamal Kazemi Tabar (2010) Ag+ enhanced silymarin production in hairy root cultures of Silybum marianum (L.) Gaertn POJ:109-114 38 T Hasanloo, S Eskandari, F Najafi (2014) Chitosan (middle-viscous) as an effective elicitor for silymarin production in Silybum marianum hairy root cultures Research Journal of Pharmacognosy: 9-13 39 Gwi-Taek Jeong, Don-Hee Park (2005) Enhancement of growth and secondary metabolite biosynthesis: Effect of elicitors derived from plants and insects Biotechnology and Bioprocess Engineering: Volume 10, pp 73-77 40 Miyasaka H., Nasu M., Yamamoto T., Endo Y., Yoneda K (1986) Regulation of Ferruginol and Cryptotanshinone Biosynthesis in Cell Suspension Cultures of Salviamiltiorrhiza Phytochemistry 25: 637-640 41 Guillon S., Tremouillaux-Guiller J., Pati P K., Rideau M., Gantet P (2006) Harnessing the potential of hairy roots: dawn of a new era Trends Biotec 24: 403 - 409 42 Chen H, Chen F, Chiu FCK, Lo CMY (2001) The effect of yeast elicitoron the growth and secondary metabolism of hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza Enzym and Microbial Technology 28: 100-105 43 Yan Q., Hu Z., Tan R X., Wu J (2005) Efficient production and recovery of diterpenoid tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures with in situ adsorption, elicitation and semi-continuous operation J Biotec 119: 416-424 44 Anna Kra jewska - Patan, Mar iola Dreger, Małgorzata Górska -Pauks zta, Alina Mścisz, Sebas tian Mielcar ek,Mar ek Bara niak, Waldemar Buchwa Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 ld1, Roma Marecik, Włodzimierz Gra jek, Przemysław M Mrozikiewicz Research (2007) Salvia milthiorrhiza Bunge in vitro cultivation in callus cultures Institute of Medicinal Plants 27: 61-707 45 Shi H.P., Kintzios S (2007) Genetic transformation of Pueraria phaseoloides with Agrobacterium rhizogenes and puerarin production in hairy roots Plant Cell Rep.21(11): 1103-7 46 Hu Z, Alfermann AW (1993) Diterpenoid production in hairy root cultures ò Saltiva miltiorrhiza Phytochemistry 32(3): 699-703 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 PHỤ LỤC I KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ BẰNG CHƯƠNG TRÌNH IRRISTAT 4.0 PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi va tich luy hoat chat VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT NL * RESIDUAL 254999 849997E-01 2.00 0.148 109215 109215 2.56 0.122 19 809062 425822E-01 * TOTAL (CORRECTED) 23 1.17328 510120E-01 CT NL 0.12844E-01 REPS 0.41090E-01 0.09 0.966 0.45 0.647 CT REPS 0.23012 0.86 0.548 NL REPS 0.37161 7.22 0.005 CT NL REPS 0.15340 0.51 0.794 TUKEY'S TEST FOR TRANSFORMABLE NON-ADDITIVITY SS= 0.922023E-03, F(1, 18)= 0.02, P= 0.883 REGRESSION SLOPE=-0.44569 SUGGESTED POWER TRANSFORMATION= 1.8856 MEAN ORTHOGONAL RESIDUAL = -0.2301E-02, P-VALUE= 0.960 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 3TUAN 19/ 8/15 0:31 -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi va tich luy hoat chat MEANS FOR EFFECT CT CT NOS KLT 0.842333 0.970333 1.03667 1.12483 SE(N= 5%LSD 6) 19DF 0.842439E-01 0.249359 - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS KLT 12 1.06100 12 0.926083 SE(N= 12) 0.595694E-01 1.03667 5%LSD 19DF 0.176323 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 3TUAN 19/ 8/15 0:31 -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi va tich luy hoat chat F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 24) NO OBS TOTAL SS KLT DEVIATION BASED ON RESID SS 24 0.99354 BASED ON | 0.22586 C OF V |CT % | | 0.20635 |NL | | | | | | 20.8 0.1477 0.1222 BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLT FILE TUAN 19/ 8/15 0:54 : PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh k VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 1.08855 NL 554593E-01 554593E-01 * RESIDUAL 19 2.40386 362850 2.87 0.063 0.44 0.523 126519 * TOTAL (CORRECTED) 23 3.54787 154255 CT NL 0.50206 1.41 0.277 REPS 0.75690E-01 0.28 0.765 CT REPS NL REPS 0.22872E-01 0.08 0.921 CT NL REPS 0.36089 0.38 0.877 1.4424 3.25 0.035 TUKEY'S TEST FOR TRANSFORMABLE NON-ADDITIVITY SS= 0.323114 , F(1, 18)= 2.80, P= 0.108 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 REGRESSION SLOPE= 5.6669 SUGGESTED POWER TRANSFORMATION= -20.356 MEAN ORTHOGONAL RESIDUAL = CT NL 0.3800E-01, P-VALUE= 0.651 OBS VALUE 3.180 FITTED VALUE 2.293 RESIDUAL 0.8873 BOX PLOT OF STUDENTIZED RESIDUALS FROM LPLT= -1.918 TO ULPT= 2.804 NO.UPLT I MEDIAN= + I - 0.1113E+00 ANDERSON-DARLING STATISTIC= TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS * 0.408 FILE TUAN 19/ 8/15 0:54 -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh k MEANS FOR EFFECT CT CT NOS KLT 1.82395 1.69600 1.77267 2.24467 SE(N= 6) 5%LSD 0.145212 19DF 0.429822 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS KLT 12 1.93239 12 1.83625 SE(N= 12) 0.102680 5%LSD 19DF 0.303930 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TUAN 19/ 8/15 0:54 -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh k F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp |NL | Page 58 (N= 24) SD/MEAN | NO OBS BASED ON TOTAL SS KLT 3.BALANCED 24 RESID SS 1.8843 | 0.39275 ANOVA FOR VARIATE BASED ON KLT % | | 0.35570 | | | | 18.9 0.0630 FILE TUAN | 19/ 8/15 0.5225 0:59 -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi re to ba kich tuan VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT NL * RESIDUAL 3.35107 1.11702 5.34 0.008 119992 119992 0.57 0.464 19 3.97712 209322 * TOTAL (CORRECTED) 23 7.44819 323834 CT NL 0.46530 REPS 1.2499 0.71 0.565 3.90 0.040 CT REPS 0.82172 0.56 0.753 NL REPS 0.50328E-01 CT NL REPS 1.3899 0.11 0.897 1.16 0.382 TUKEY'S TEST FOR TRANSFORMABLE NON-ADDITIVITY SS= 0.523915E-03, F(1, 18)= 0.00, P= 0.960 REGRESSION SLOPE= 0.88417E-01 SUGGESTED POWER TRANSFORMATION= 0.32394 MEAN ORTHOGONAL RESIDUAL = 0.1017E-02, P-VALUE= 0.989 PLOT OF LS RESIDUALS AGAINST FITTED VALUES\ TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TUAN 19/ 8/15 0:59 : PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi re to ba kich tuan MEANS FOR EFFECT CT CT NOS KLT 3.57283 3.51400 3.75367 4.45200 SE(N= 6) 0.186781 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 5%LSD 19DF 0.552864 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS KLT 12 3.89383 12 3.75242 SE(N= 12) 0.132074 5%LSD 19DF 0.390934 - BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLT FILE 10TUAN 19/ 8/15 1: -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi re to ba kich 10 tuan VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 3.49102 1.16367 6.02 0.005 NL 374250 374250 1.93 0.177 19 3.67505 193424 * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) 23 7.54032 327840 CT NL 0.36043 0.58 0.640 REPS 0.41833 1.09 0.359 CT REPS 1.7882 2.05 0.130 NL REPS CT NL REPS 0.17015E-01 1.0911 0.04 0.961 0.91 0.515 TUKEY'S TEST FOR TRANSFORMABLE NON-ADDITIVITY SS= 0.292959 , F(1, 18)= REGRESSION SLOPE= -1.1599 1.56, P= 0.226 SUGGESTED POWER TRANSFORMATION= 12.731 MEAN ORTHOGONAL RESIDUAL = -0.3615E-01, P-VALUE= 0.724 MEDIAN= 0.1977E+00 ANDERSON-DARLING STATISTIC= TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS 0.193 FILE 10TUAN 19/ 8/15 1: -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi re to ba kich 10 tuan Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 MEANS FOR EFFECT CT CT NOS KLT 4.81200 5.08700 4.66550 5.66333 SE(N= 6) 0.179547 5%LSD 19DF 0.531454 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS KLT 12 5.18183 12 4.93208 SE(N= 12) 0.126959 5%LSD 19DF 0.375795 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 10TUAN 19/ 8/15 1: -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi re to ba kich 10 tuan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 24) NO OBS BASED ON TOTAL SS KLT 24 DEVIATION RESID SS 5.0570 | 0.57257 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE BASED ON C OF V |CT % | 0.43980 FILE TUAN | |NL | | | | | | 8.7 0.0047 19/ 8/15 0.1774 0:59 -PAGE Anh huong cua dieu kien chieu sang den su tang sinh khoi re to ba kich tuan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 24) NO OBS TOTAL SS BASED ON RESID SS DEVIATION BASED ON | C OF V |CT % | | Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp |NL | | | | | | Page 61 KLT 24 3.8231 0.56906 BALANCED ANOVA FOR VARIATE 0.45752 KLT 12.0 0.0078 FILE 8TUAN 0.4641 19/ 8/15 2: -PAGE anh huong cua che chieu sang den tang truong re to ba kich VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 2.99944 NL 243207E-01 243207E-01 * RESIDUAL 999813 19 4.53729 4.19 0.020 0.10 0.751 238805 * TOTAL (CORRECTED) 23 7.56105 328741 CT NL 0.20880 0.26 0.856 REPS 0.23829 0.47 0.637 CT REPS 0.77921 0.45 0.834 NL REPS 1.8897 6.07 0.010 CT NL REPS 1.4213 0.99 0.472 TUKEY'S TEST FOR TRANSFORMABLE NON-ADDITIVITY SS= 0.198178 , F(1, 18)= REGRESSION SLOPE= -4.0373 0.82, P= 0.380 SUGGESTED POWER TRANSFORMATION= MEAN ORTHOGONAL RESIDUAL = -0.2568 32.214 , P-VALUE= 0.032 PLOT OF LS RESIDUALS AGAINST FITTED VALUES MEDIAN= 0.2511E-01 ANDERSON-DARLING STATISTIC= TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS 0.206 FILE 8TUAN 19/ 8/15 2: : PAGE anh huong cua che chieu sang den tang truong re to ba kich MEANS FOR EFFECT CT CT NOS KLT 3.68417 3.51967 3.80683 4.45200 SE(N= 6) 0.199501 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 5%LSD 19DF 0.590517 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS KLT 12 3.83383 12 3.89750 SE(N= 12) 0.141069 5%LSD 19DF 0.417558 - BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLT FILE ELI1 19/ 8/15 2:14 -PAGE anh huong cua elicitor den su tang sinh khoi va tich luy cua re to VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 322642 161321 0.33 0.727 NL 169362 169362 0.35 0.570 14 6.79900 485643 * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) 17 7.29100 428882 CT NL 0.44667 0.42 0.669 REPS 1.1623 1.24 0.325 CT REPS 2.2255 1.22 0.363 NL REPS 1.7465 2.07 0.167 CT NL REPS 1.2181 0.55 0.708 TUKEY'S TEST FOR TRANSFORMABLE NON-ADDITIVITY SS= 0.274358 , F(1, 13)= REGRESSION SLOPE= -4.7533 MEAN ORTHOGONAL RESIDUAL = 0.55, P= 0.479 SUGGESTED POWER TRANSFORMATION= 0.2340 42.170 , P-VALUE= 0.228 BOX PLOT OF STUDENTIZED RESIDUALS FROM LPLT= -1.725 TO ULPT= NO.UPLT + I MEDIAN= -0.1261E+00 ANDERSON-DARLING STATISTIC= BALANCED ANOVA FOR VARIATE 2.727 KLT FILE ELI2 * 0.293 19/ 8/15 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 6:44 Page 63 -PAGE Thoi gian dung nuoi cay den tang truong hoat chat muc tieu VARIATE V003 KLT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 2.36374 787913 3.89 0.025 NL 786626 786626 3.88 0.061 19 3.85280 202779 * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) 23 7.00316 304485 CT NL 1.2451 REPS 0.65063 2.55 0.092 1.73 0.206 CT REPS 1.1494 0.92 0.511 NL REPS 0.68468E-01 0.15 0.859 CT NL REPS 0.73923 0.51 0.788 TUKEY'S TEST FOR TRANSFORMABLE NON-ADDITIVITY SS= 0.274114 , F(1, 18)= REGRESSION SLOPE= 0.94050 1.38, P= 0.255 SUGGESTED POWER TRANSFORMATION= -7.7773 MEAN ORTHOGONAL RESIDUAL = -0.1262 , P-VALUE= 0.235 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ELI2 19/ 8/15 6:44 -PAGE Thoi gian dung nuoi cay den tang truong hoat chat muc tieu MEANS FOR EFFECT CT CT NOS KLT 5.07183 4.39500 4.87017 4.32817 SE(N= 5%LSD 6) 0.183838 19DF 0.544154 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS 12 KLT 4.48525 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 12 4.84733 SE(N= 12) 0.129993 5%LSD 19DF 0.384775 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ELI2 19/ 8/15 6:44 :PAGE Thoi gian dung nuoi cay den tang truong hoat chat muc tieu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 24) NO OBS BASED ON TOTAL SS KLT 24 RESID SS 4.6663 0.55180 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS DEVIATION BASED ON | 0.45031 FILE ELI1 C OF V |CT % | | |NL | | | | | | 9.7 0.0252 19/ 8/15 0.0610 2:14 :PAGE anh huong cua elicitor den su tang sinh khoi va tich luy cua re to MEANS FOR EFFECT CT CT NOS KLT 4.22100 4.51917 4.25183 SE(N= 6) 0.284500 5%LSD 14DF 0.862952 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS KLT 4.42767 4.23367 SE(N= 9) 0.232294 5%LSD 14DF 0.704598 - Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ELI1 19/ 8/15 2:14 :PAGE anh huong cua elicitor den su tang sinh khoi va tich luy cua re to F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 18) NO OBS BASED ON TOTAL SS KLT 18 DEVIATION RESID SS 4.3307 | 0.65489 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE BASED ON C OF V |CT % FILE 8TUAN | | 0.69688 |NL | | | | | | 16.1 0.7266 19/ 8/15 0.5704 2: :PAGE anh huong cua che chieu sang den tang truong re to ba kich F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 24) NO OBS BASED ON TOTAL SS KLT 24 RESID SS 3.8657 0.57336 DEVIATION BASED ON | 0.48868 C OF V |CT % | | |NL | | | | | | 12.6 0.0195 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 0.7510 Page 66 PHỤ LỤC II Quy trình nhân nuôi sinh khối rễ tơ ba kích ` Chủng vi khuẩn A.Rhizogenes ATCC 15834 Cây ba kích invitro Cảm ứng tạo rễ tơ Kiểm tra rễ chuyển gen phương pháp PCR Nhân nuôi môi trường B5 điều kiện chiếu sáng 8h sáng16h tối/ ngày Nhân nuôi môi trường B5 điều kiện tốihoàn toàn tuần tuần Bổ sung elicitor 100 mg/l YE + 0,1 mM MJ trước thời điểm dừng nuôi cấy ngày Thu sinh khối rễ tơ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 [...]... cấy rễ tơ (Nguyễn Quỳnh Chi, 201 5), đề tài được tiến hành nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm năng cao sinh khối và tích lũy hoạt chất mục tiêu rễ tơ cây ba kích Chính vì vậy tôi tiến hành đề tài: Tối ưu hóa quy tr nh nhân sinh khối rễ tơ cây Ba kích (Morinda officinalis How. ) .Đề tàigóp phần tạo tiền đề cho quá tr nh xây dựng quy tr nh sản xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ cây ba kích, phục... quy tr nh nhân sinh khối rễ tơ cây ba kích Yêu cầu Xác định được điều kiện chiếu sáng thích hợp và thời gian nuôi cấy cần cho sự tăng sinh khối rễ tơ và tích lũy hoạt chất mục tiêu Xác định được yếu tố Elicitor thích hợp cho khả năng tích lũy hoạt chất mục tiêu trong rễ tơ Xác định được công thức tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thực hiệntrên đối tượng rễ tơ ba kích. .. cứu tr n rễ tơ cây ba kích Tại Việt Nam, Lê Thị Thanh Hương (201 4) đã tạo rễ tơ cây ba kích, cảm ứng bởi vi khuẩn A Rhizogenes Năm 2015, Nguyễn Quỳnh Chi đã chứng minh rễ tơ cây ba kích sinh tr ởng tốt nhất tr n môi tr ờng B5 Trong nghiên cứu, Ngô Thị Thương (201 5) cũng đã chỉ ra rằng khi bổ sung elicitor 100 mg/l YE + 0,025 mM MJ thu được sinh khối rễ tơ và hàm lượng anthraquinone cao nhất trong điều... chuyển hóa khác nhau của chúng có chức năng chính là giúp điều chỉnh khả năng chống chịu của cây với các stress phi sinh học và sinh học cũng như sự tăng tr ởng và phát triển của cây Quá tr nh tăng tr ởng và phát triển của cây được quy định bao gồm các quá tr nh ức chế tăng tr ởng, sự hóa già, phát triển hoa và hiện tượng rụng lá Mặc dù MJ điều hòa rất nhiều các quá tr nh khác nhau trong cây nhưng vai tr ... nhiên từ tác nhân gây bệnh là Agrobacterium rhizhogenses Rễ tơ có thể sinh tr ởng, phát triển tốt tr n môi tr ờng không cần bổ sung các chất điều hòa sinh tr ởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra Hê ethống rễ đa bội là nơi lý tưởng để sản sinh ra hóa chất thực vâte và chúng rất ổn đineh về di truyền Rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, sinh tr ởng nhanh... khoảng 6,0 - 6,5 tr ớc khi khử tr ng là pH tối ưu cho sự phát triển rễ tơ và sản xuất ginsenoside Tốc độ tăng tr ởng tối đa (7,44 %) và năng suất tối đa (239,68 mg/l) ginsenoside thu được tương ứng ở pH 6,0 và 6,5 pH ban đầu dưới 4,0 hoặc cao hơn 7,0 thì sự tăng tr ởng rễ tơ và sản xuất ginsenoside bị ức chế mạnh pH quá thấp, nhôm và hydro trong môi tr ờng sẽ gây độc hại đến hệ thống rễ của nhân sâm Nếu... (anthraquinone) cũng như sự ảnh hưởng của yếu tố elicitor lên rễ tơ Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài sẽ có đóng góp quan tr ng trong việc đưa rễ tơ cây ba kích vào trong sản xuất sinh khối lớn phục vụ cho ngành công nghiệp dược liệu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY BA KÍCH 2.1.1 Nguồn gốc, phân bố Cây ba kích (Morinda. .. bào Trong nghiên cứu của Yu và cộng sự (200 5) ở rế tơ cây P ginseng cho thấy rễ tơ cảm ứng với dải bước sóng anh sáng khác nhau gây ảnh hưởng với sự sinh tr ởng và tổng hợp các hợp chất mặc dù việc thu sinh khối rễ tơ đạt được thấp hơn khi được nuôi cấy trong môi tr ờng chiếu sáng huỳnh quang (50 µmol m-2s1 / ngày) thấp hơn nuôi cấy trong tối dựa tr n kết quả thí nghiệm, 2 bước nuôi cấy, bước trong tối. .. 7 đến tháng 10 Rễ dạng rễ củ có hình tr tr n, thắt khúc, dài không bằng nhau, vặn vẹo như ruột gà, đường kính 1,5 – 2 cm Vỏ ngoài màu nâu nhạt hoặc hồng nhạt, nhám, có vân dọc Bên trong là thịt củ dày màu nâu hồng hoặc tím, không mùi, vị ngọt nhưng hơi chát, trong cùng là lõi củ.Thông thường có hai loại ba kích là ba kích tím và ba kích tr ng .Ba kích tím có lõi củ màu tím, ba kích tr ng có lá bầu,... gen; môi tr ờng không có hormone sinh tr ởng, ammonium nitrate và bổ sung 3% sucrose vào ngày nuôi cấy thứ 12 có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh tr ởng và tích lũy diterpenes của rễ tơ Trong rễ đan sâm không chuyển gen, vẫn có sự tổng hợp tanshinone tuy nhiên thời gian nuôi cấy dài Rễ chuyển gen (rễ t ) với đặc điểm sinh tr ởng nhanh mà không cần bổ sung hormone sinh tr ởng, tính ổn định di truyền cao