Nghiên cứu xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu lan kim tuyến (anoectochilus formosanus hayata)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - TRẦN VĨNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN VĨNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS LÊ THỊ HỒNG VÂN TS LÊ MINH QUÂN TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS Lê Thị Hồng Vân TS Lê Minh Quân Các số liệu kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khoa học Tác giả luận văn Trần Vĩnh Nguyên TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa 2019 – 2021 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA) Trần Vĩnh Nguyên Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Hồng Vân TS Lê Minh Quân Đặt vấn đề Trong năm gần xu hướng sử dụng thuốc từ dược liệu ngày tăng lên Việt Nam nước có nhiều kiểu địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng Do Việt Nam đa dạng tài nguyên sinh vật Nhiều loài thực vật Việt Nam có giá trị làm thuốc cao, số Lan kim tuyến Lan kim tuyến dược liệu quý, sử dụng số nước châu Á Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan để trị nhiều bệnh bảo vệ gan, kháng đái tháo đường Trên giới có nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý Lan kim tuyến Tại Việt Nam Lan kim tuyến bị khai thác mức đưa vào sách đỏ Cho đến chưa có nghiên cứu Việt Nam thực để xây dựng quy trình chiết xuất hướng đến sản xuất chế phẩm từ cao chiết Lan Kim tuyến Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu Lan kim tuyến Anoectochilus sp.” thực nhằm xây dựng quy trình định lượng hoạt chất Lan kim tuyến, tối ưu hóa quy trình chiết xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao chiết từ quy trình Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Toàn thân dược liệu Lan Kim Tuyến nuôi cấy cung cấp Việc sinh học nhiệt đới (Giấy xác nhận loài Anoectochillus formosanus Hayata kèm theo) Dược liệu rửa sạch, để nước, dùng mẫu tươi sấy 50oC khơ xay thành bột tùy mục đích công đoạn nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Xây dựng thẩm định quy trình định lượng hoạt chất dược Lan kim tuyến Sau xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao giàu hoạt chất việc sử dụng phần mềm thông minh Design Expert v12.0 Xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết với tiêu chí tính chất, định tính, khối lượng làm khô, kim loại nặng định lượng Kết Xây dựng thẩm định quy trình định lượng kinsenosid dược liệu Lan kim tuyến Xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu Lan kim tuyến Quy trình chiết tối ưu: Cân khoảng 950 g bột dược liệu khô Lan kim tuyến (đạt tiêu chuẩn sở bao gồm tiêu kích thước, phân bố kích thước dược liệu thơ) cho vào bồn chiết, thêm 30 L ethanol 96% vào bồn đun hồi lưu 78-80oC hai Kết thúc giai đoạn chiết ethanol, thu hồi dịch chiết cô thu hồi dung môi thiết bị cô áp suất giảm thu cao lỏng A Trong bồn chiết chứa bã dược liệu, thêm 30 L nước chiết hồi lưu nhiệt độ 100oC hai Kết thúc giai đoạn chiết nước, dịch chiết thu được cô bồn cô áp suất giảm đến thu cao lỏng B Trộn lẫn cao A cao B cô đến thể chất cao đặc (hàm ẩm không 20%) Cao chiết xây dựng tiêu chuẩn sở với tiêu chí tính chất, định tính, khối lượng làm khô, kim loại nặng định lượng Kết luận Đề tài định lượng hoạt chất Lan kim tuyến, tối ưu hóa quy trình chiết xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao chiết từ quy trình Từ khóa Lan kim tuyến, cao chiết, kinsenosid, polysaccharid, tối ưu hóa ABSTRACT Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2019-2021 RESEARCH FOR OPTIMIZATION OF THE EXTRACTION PROCESS OF (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA) Tran Vinh Nguyen Instructor: Ph.D Le Thi Hong Van Ph.D Le Minh Quan Introduction Anoectochillus formosanus is a small perennial and terrestrial orchid with high medicinal value grown in China Southeast, Japan, Taiwan and other countries including Vietnam This species is distributed in several regions in Vietnam including Gia Lai, Kontum, Quang Tri, Ha Tay, Vinh Phuc, Ha Giang, Lao Cai In addition to their beautiful appearance, some recent studies revealed that A formosanus have some beneficial effects such as anti-inflammatory activity, antioxidant and hepatoprotective, anti-tumor and immune-stimulating and antihyperglycemic effects This study was conducted to develop a procedure for the quantification of the main active ingredients in Anoectochilus formosanus, optimize the extraction process and develop a standard for the extracts Materials and methods Material Fresh material of Anoectochilus formosanus was purchased from Insitute of Tropical Biology, Vietnam Whole plant of Anoectochilus formosanus is fresh or dried powder Method Developing and validate the process of quantifying the main active ingredients in Anoectochilus formosanus Then develop a standard for this medicinal herb Optimize the extraction process using the Design Expert v12.0 software Develop a extract standard with the criteria of properties, qualitative, loss on drying, heavy metals and quantification Results Develop and evaluate the process of quantifying the main active ingredients in Anoectochilus formosanus Develop a standard for this medicinal herb Optimal extraction process: Weigh about 950g of dried material powder into the extraction tank, add 30 L of ethanol 96% into the bath and reflux at 78-80oC for two hours At the end of the ethanol extraction phase, the extract was collected and the solvent was recovered using a reduced-pressure evaporator to obtain extract A In the extraction tank containing residues, add 30 L of water and reflux at heat 100oC for two hours At the end of the water extraction phase, the extract obtained was concentrated in a reduced-pressure evaporator until extract B was obtained Mix A and B and thicken to a dense consistency (moisture content not more than 20%) Established a extract standard with the criteria of properties, qualitative, loss on drying, heavy metals and quantification Conclusion The thesis quantifies the main activity in Anoectochilus formosanus, optimizes the extraction process and establishes a standard for extraction from this process Key words: Anoectochillus formosanus, kinsenoside, polysaccharide, optimization MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC SƠ ĐỒ ix ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN 1.2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 21 1.3 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT 27 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ 31 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 32 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ 51 3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT CHÍNH TRONG LAN KIM TUYẾN 51 3.2 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN HÓA 72 3.3 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DÀNH CHO CAO CHUẨN HÓA 85 CHƯƠNG BÀN LUẬN 103 4.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT CHÍNH TRONG LAN KIM TUYẾN 103 4.2 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN HĨA 106 4.3 XÂY DỰNG BỘ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO CAO CHUẨN HÓA 110 4.4 TRIỂN VỌNG CỦA ĐỀ TÀI 111 CHƯƠNG KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ 112 5.1 KẾT LUẬN 112 5.2 ĐỀ NGHỊ 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC .i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên ACN Acetonitril CFU Colony forming unit Dd Dung dịch DDA Detector diod array DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide EtOH Ethanol HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao IUCN International Union for Conservation of Nature Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế 10 LOD Limit of detection Giới hạn phát 11 LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng 12 MeOH Methanol 13 RI Refractive index Chỉ số khúc xạ 14 Rs Resolution Độ phân giải 15 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối 16 RSM Response surface methodology Phương pháp đáp ứng bề mặt 17 SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Tiếng Việt Đơn vị hình thành khuẩn lạc Đầu dị qt chồng phổ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh thân gồm tế bào có hình chữ nhật, tinh thể calxi oxalat hình kim dài khoảng 17-25 µm, mảnh mạch vạch, sợi mơ cứng 1.2 Định tính: Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 1.3 Độ ẩm: Không % 1.4 Phân bố kích cỡ tiểu phân: tiểu phân bột dược liệu có kích cỡ khơng nhỏ 0,3 mm, khơng q 70% tiểu phân bột dược liệu có kích cỡ nhỏ 0,075 mm 1.5 Độ tro tồn phần: Không 7,5 % 1.6 Tro không tan acid: Không 2,5 % 1.7 Định lượng: Trong dược liệu chứa: - Khơng 10 % kinsenosid (C10H16O8) - Khơng 1,0 % polysaccharid tồn phần PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Tính chất: Mơ tả: quan sát cảm quan Quan sát thân rễ, chiều cao, hình dạng, màu sắc Hình thái kích cỡ màu sắc Đường kính, màu sắc, hình thái thân Vi phẫu: quan sát kính hiển vi Mẫu vi phẫu lá, thân rễ Lan kim tuyến cắt nhuộm phương pháp nhuộm kép Carmin - lục iod trước quan sát Soi bột: dược liệu tươi sấy khơ 50oC 72 giờ, sau xay nhỏ rây qua rây 0,5 mm để thu bột có độ mịn đồng Nhận xét cảm quan bột dược liệu mắt thường, soi bột kính hiển vi chụp ảnh cấu tử 2.2 Định tính: - Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) - Bản mỏng: Silica gel F254 - Dung môi khai triển: EtOAc–MeOH–H2O–HCOOH (8:3:1:0.5) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Mẫu thử: Lấy 100 mg bột dược liệu qua cỡ rây số 250, thêm ml ethanol 90% (TT), chiết siêu âm (45 oC, 30 phút), lọc thu lấy dịch chiết ethanol 90% dùng làm dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: cân mg chuẩn kinsenoside hòa tan mL methanol (TT) - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng khoảng 10 μl dung dịch thử dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng - Phát hiện: Nhúng mỏng dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT) Sấy mỏng 105 oC đến rõ vết Quan sát ánh sáng thường soi UV 365 nm sau nhúng TT Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 2.3 Độ ẩm: Tiến hành theo DĐVN V, Phụ lục 9.6 Sấy khô cốc thủy tinh miệng rộng đáy có nắp mài tủ sấy vòng 30 phút Cân để xác định khối lượng cốc thủy tinh Cân vào cốc g bột dược liệu (đã làm mịn rây kích thước 0,5 mm) dàn thành lớp mỏng độ dày không mm Tiến hành làm khô mẫu thử tủ sấy nhiệt độ 55oC đến khối lượng không đổi Làm nguội mẫu tới nhiệt độ phịng bình hút ẩm có silica gel Xác định độ chênh lệch khối lượng mẫu trước sau thử nghiệm tính tốn độ ẩm 2.4 Phân bố kích cỡ tiểu phân: Xác định phương pháp rây Cân khoảng 30 g bột dược liệu, rây dược liệu qua rây 0,3 mm Lượng dược liệu qua 0,3 mm tiếp tục rây qua rây 0,075 mm Thu toàn dược liệu qua rây 0,3 mm rây 0,075 mm (bột A); thu dược liệu qua rây 0,075 mm (bột B) Khối lượng bột B không lớn 70% lương bột cân ban đầu Tổng khối lượng bột A bột B không bé 98% tổng khối lượng bột cân ban đầu 2.5 Độ tro toàn phần: Cân mẫu bột dược liệu (2 g/mẫu) cho vào chén nung (đã nung đến khối lượng không đổi xác định khối lượng) Tiến hành đun cách cát để loại hết khói Cho vào tủ nung 600oC tới khối lượng không đổi, làm nguội cân Tính tỉ lệ phần trăm tro tồn phần theo dược liệu làm khơ Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2.6 Tro không tan acid: Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi phút, lọc để tập trung chất không tan vào giấy lọc không tro, rửa nước nóng đem nung 600°C đến khối lượng khơng đổi Tính tỉ lệ phần trăm tro khơng tan acid so với dược liệu làm khô 2.7 Định lượng 2.7.1 Định lượng kinsenosid: Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng - Pha động: Tiến hành phân tích sắc ký theo chương trình bảng sau: Thời gian (phút) % Acetonitril (tt/tt) % Nước (tt/tt) 0-15 100 15-20 0-20 100-20 20-30 20-0 20-100 - Dung dịch thử: Cân 80 mg bột dược liệu, thêm xác 10 mL MeOH, siêu âm 30 oC 45 phút, ly tâm thu lấy mL dịch lọc, bốc MeOH khí nitơ, hịa lại mL nước, siêu âm, lọc qua màng lọc 0,2 uM bơm qua hệ thống UPLC - Dung dịch chuẩn: Cân xác kinsenosid hịa tan methanol (TT) để dung dịch chuẩn có nồng độ chuẩn khoảng 1000 ppm - Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ (15 cm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh octadecylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (3 m) Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại bước sóng 215 nm Tốc độ dịng: 0,4 ml/phút Thể tích tiêm: 10 l Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Cách tiến hành: Tiêm dung dịch đối chiếu dung dịch thử Căn vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng chuẩn, tính hàm lượng kinsenosid dược liệu - Dược liệu phải chứa không 10% kinsenosid tính theo dược liệu khơ kiệt 2.7.2 Định lượng polysaccharid dược liệu: - Cân 2,0 g bột dược liệu cho vào erlen, thêm 200 mL ethanol 95% siêu âm 40oC 30 phút Gạn lấy dịch chiết cồn Thêm 100 mL nước đun hồi lưu 70oC 1,5 Lặp lại lần trình Lượng dịch chiết thu từ lần đun hồi lưu cô quay thu hồi dung môi đến khoảng 60 mL dịch chiết Thêm 180 mL hỗn hợp CHCl3 : n-butanol (4:1, tt/tt) lắc phân bố để thu phân đoạn nước dung môi hữu Đối với phân đoạn dịch chiết nước, quay thu hồi dung mơi đến cịn khoảng 10 mL dịch chiết Thêm 40 mL ethanol 99% vào hỗn hợp thu được, làm lạnh giờ, ly tâm lọc lấy cắn Hòa cắn vào 20 mL ethanol 99%, làm lạnh giờ, ly tâm lọc lấy cắn Sấy cắn đến khô cân xác định khối lượng hỗn hợp polysaccharid toàn phần thu - Dược liệu phải chứa khơng 1,0% polysaccharid tính theo dược liệu khơ kiệt Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Tiêu chuẩn sở cao chuẩn hóa YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Tính chất: Thể chất đặc sệt, màu đỏ đậm, mùi thơm, vị mặn, đắng 1.2 Định tính: Chế phẩm phải có xuất vết Kinsenosid 1.3 Mất khối lượng làm khô: Không 20% 1.4 Kim loại nặng: Không 20 phần triệu 1.5 Định lượng: Trong cao chuẩn hóa chứa: - Khơng 10,0 % Kinsenosid (C10H16O8) - Khơng 3,0 % polysaccharid tính theo glucose tính cao nguyên trạng 1.6 Giới hạn nhiễm khuẩn: STT Tên tiêu Mức tối đa Đơn vị tính Tổng số Vi khuẩn hiếu khí 104 CFU/g Tổng số Nấm men, nấm mốc 102 CFU/g Vi khuẩn gram âm 102 CFU/g Ecoli Không có 1g Samonella Khơng có 10 g Staphylococcus aureus Khơng có 1g PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Hình thức: Thể chất đặc sệt, màu xanh nâu, mùi thơm dược liệu 2.2 Định tính: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng: (Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Phụ lục 5.4) a Dụng cụ, thuốc thử: - Bản mỏng Silica gel GF254 tráng sẵn, hoạt hóa 105oC 30 phút - Dung môi khai triển: EtOAc-MeOH-H2O-HCOOH ((8:3:1:0,5) b Cách thử: - Dung dịch chuẩn Kinsenosid: Hòa mg với 1ml methanol thu dung dịch chuẩn đối chiếu - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 500 mg vào 10 ml methanol, lắc siêu âm 15 phút, khấy đều, gạn lấy dịch dung dịch mẫu thử - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu Sau triển khai xong, lấy mỏng để khô không khí Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm Phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol, sấy đến vết c Yêu cầu: Sắc ký đồ cùa dung dịch thử phải có vết có màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch chuẩn đối chiếu 2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ: Trong dung dịch thử phải có pic tương ứng với pic kinsenosid dung dịch chuẩn 2.3 Mất khối lượng làm khô: Phụ lục 9.6, DĐVN V 2.4 Kim loại nặng: Tiến hành phép thừ giới hạn kim loại nặng (Phụ lục 9.4.8, phương pháp 3), sử dụng g chế phẩm ml dung dịch chì màu 10 phần triệu Pb (TT) 2.5 Định lượng: 2.5.1 Định lượng Kinsenosid: Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép nối đầu dò khối phổ TripleQuad Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Hệ thống LC:  Bơm cao áp: Shimadzu LC-20AD  Buồng tiêm mẫu: Shimadzu SIL-20AC  Buồng cột: Shimadzu CT-10AS  Đầu dò: Shimadzu TripleQuad 8040 - Cột sắc ký Synergi Fussion RP C18 (150 x 4,6 mm; µm) - Cân phân tích Mettler Toledo MS - Các loại bình định mức pipet loại A - Micropipet Eppdorf 10-100 µL 100-100 µL Quy trình phân tích - Điều kiện SK:  Cột: Synergi Fussion RP C18 (150 x 4,6 mm; µm)  Pha động: Acid formic 0,1 % nước  Chuẩn nội: Tenofovir  Thể tích tiêm: µL  Điều kiện ion hóa phân mảnh Điều kiện ion hóa  Điều kiện ion hóa: ESI (+)  Nebulizing gas: 3L/phút  Drying gas: 15 L/phút  Nhiệt độ DL: 200 oC  Nhiệt độ Heatblock: 400 oC Điều kiện phân mảnh: TripleQuad Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Cấu trúc Phân mảnh Q1 (V) CE (V) Q3 (V) Tenofovir 288,15 ->176,10 -12 -27 -16 Kinsenosid 264,90 -> 103,00 -16 -7 -11 Quy trình xử lý mẫu - Dung dịch nội chuẩn: Cân khoảng 20 mg tenofovir vào bình định mức 200 ml, thêm 70 ml ethanol (TT), lắc cho tan hồn tồn, pha lỗng với ethanol vừa đủ đến vạch Pha loãng 100 lần với methanol Lọc qua màng lọc nylon 0,22 µm - Dung dịch chuẩn Kinsenosid gốc: Cân xác khoảng 22,5 mg Kinsenosid vào bình định mức 100 ml, lắc đều, thêm 70 mL methanol, lắc cho tan hồn tồn, pha lỗng với methanol vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc nylon 0,22 µm - Dung dịch thử gốc: Chính xác khoảng 370 mg mẫu thử cho vào bình định mức 25 ml Lắc siêu âm 30 phút Lọc qua màng lọc nylon 0,22 µm Pha lỗng dung dịch 10 lần với methanol - Dung dịch thử làm việc: Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn, có nồng độ 40%; 60%; 100%, 140% 160% nồng độ định lượng, cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu với hệ số pha loãng khác sau: Mức nồng độ Thể tích chuẩn Thể tích chuẩn Methanol Tổng (%) tích (µL) gốc (µL) nội (µL) (µL) thể Nồng (µg/ml) 40 40 100 860 1000 9,0 60 60 100 840 1000 13,5 100 100 100 800 1000 22,5 140 140 100 760 1000 31,5 160 160 100 740 1000 36,0 dùng làm dung dịch đường chuẩn tiêm sắc ký - Dung dịch thử: hút 100 µL dung dịch thử gốc thêm 100 µL dung dịch nội chuẩn 800 µL methanol, lắc đều, dùng làm dung dịch thử tiêm sắc ký Kiểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn độ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ Phép thử có giá trị tỉ lệ diện tích chuẩn Kinsenosid nội chuẩn có RSD ≤ 2,0 Cơng thức tính Hàm lượng (%) Kinsenosid (C10H16O8) thành phẩm tính theo cơng thức sau: X (%) = Ct x Dt /mt/1000*100 Trong  Ct (µg/mL): Nồng độ Kinsenosid (AS) xác định phương pháp chuẩn nội sử dụng tỉ số diện tích đỉnh Từ tỉ số diện tích đỉnh AS/IS thu từ sắc ký đồ mẫu thử dựa vào phương trình hồi qui tuyến tính đường chuẩn biểu thị mối tương quan nồng độ AS với tỉ số diện tích đỉnh AS/IS mẫu chuẩn tính để tính nồng độ AS mẫu thử  Dt (lần): Độ pha loãng mẫu thử  mt (mg): khối lượng mẫu thử 2.5.2 Định lượng Polysaccharid: Phương pháp phổ UV Thuốc thử: Dung dịch anthrone sulfuric acid: cân xác 0,1 g anthrone hịa tan 100 mL acid sulfuric (98%, v / v) Dung dịch chuẩn Dung dịch gốc chuẩn glucose khan, Std-Stock (120 mg/L): cân xác 12,0 mg CRS glucose khan hòa tan 100 mL nước Dung dịch chuẩn glucose khan để thử nghiệm, Std-AS: Hút xác thể tích StdStock glucose khan, pha loãng với nước để tạo dãy dung dịch 12, 24, 36, 48, 60 (mg/L) Dung dịch thử Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Cân xác 0,5 g cao cho vào bình cầu đáy trịn dung tích 250 mL, sau thêm 100 mL nước Để yên h Đun hồi lưu hỗn hợp h Làm nguội đến nhiệt độ phòng Lọc chuyển dịch lọc vào bình nón 500 mL Rửa phần cặn giấy lọc hai lần, lần 10 mL nước nóng Chuyển phần cặn giấy lọc vào bình cầu đáy trịn dung tích 250 mL Lặp lại q trình chiết thêm lần h Gộp chuyển phần dịch lọc sang đĩa bay Bay dung mơi đến khơ bếp cách thủy, hịa tan cặn mL nước Chuyển dung dịch vào bình cầu đáy trịn dung tích 250 mL thêm 75 mL ethanol Để yên hỗn hợp 4ºC 12 Chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm 100 mL Ly tâm khoảng 4000 vòng/phút 10 phút Loại bỏ phần dung dịch phía trên, hịa tan cặn nước nóng Chuyển dung dịch vào bình định mức 50 mL thêm nước đến vạch Hút xác mL dung dịch cho vào bình định mức 50 mL thêm nước đến vạch Sử dụng nước mẫu blank Hệ thống đo quang phổ tử ngoại / khả kiến: đặt bước sóng 625 nm Phương pháp đo màu Dùng pipet lấy mL dung dịch chuẩn dung dịch thử cho vào ống nghiệm 10 mL, sau dùng pipet lấy mL dung dịch acid anthron sulfuric Để yên 15 phút Làm nguội hỗn hợp nước đá 15 phút Sử dụng dung dịch acid anthron sulfuric tương ứng làm mẫu trắng Tiến hành phân tích UV / Visible bước sóng 625 nm u cầu tính phù hợp hệ thống Thực năm phép xác định lặp lại, lần sử dụng mL glucose khan StdAS (36 mg / L) phương pháp đo màu u cầu thơng số tính phù hợp hệ thống sau: RSD độ hấp thụ glucose khan khơng lớn 5,0% Đường tuyến tính Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Xác định dãy glucose khan Std-AS (mỗi loại mL) hệ thống đo quang phổ tử ngoại / khả kiến ghi lại độ hấp thụ phương pháp đo màu Vẽ đồ thị độ hấp thụ glucose khan với nồng độ tương ứng glucose khan Std-AS Xác định đường tuyến tính từ điểm chuẩn Tính tốn Đo độ hấp thụ tính nồng độ (tính miligam lít) glucose khan dung dịch thử nghiệm tính hàm lượng phần trăm polysacharid mẫu thử tính khơ kiệt 2.6 Giới hạn nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN V, phụ lục 13.6, trang PL-300 a Môi trường - Chủng vi sinh vật đối chiếu: - Tryptic soybean agar - Sabouraud dextrose agar - Tryptic soybean broth - MacConkey broth - MacConkey agar - Mossel broth - Violet red bile agar - Mannitol salt agar - Rappaport Vassiliadis - Xylose Lysine Deoxycholate agar - Đệm phosphat pH - B subtilis ATCC 6633 - C albicans ATCC 10231 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - E.coli ATCC 8739 - S aureus ATCC 6538 - Salmonella ATCC 14028 b Cách tiến hành: Lưu ý: Có thể sử dụng mơi trường thương mại bên môi trường tự pha theo hướng dẫn phần DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ MÔI TRƯỜNG Phụ lục 13.6, DĐVN V Tất môi trường dụng cụ thử nghiệm phải tiệt trùng phương pháp phù hợp trước sử dụng Thử nghiệm tiến hành điều kiện đảm bảo tránh tạp nhiễm vi sinh vật bên vào mẫu thử tủ an toàn sinh học cấp 2, đặt phòng cấp A/C Thử nghiệm tiến hành song song với đối chứng âm đối chứng dương theo hướng dẫn phần Chứng âm tính Kiểm tra phù hợp phương pháp đếm có mặt mẫu thử Phụ lục 13.6, DĐVN V Tiến hành: Xác định tổng số vi sinh vật theo phương pháp cấy trộn đĩa thạch 10 g mẫu thử hịa tan 90 ml mơi trường đệm phosphat pH (mẫu thử môi trường đệm phosphat pH 7), tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-3 Tiến hành với đĩa Petri cho loại môi trường Tryptic soybean agar Sabouraud dextrose agar nồng độ pha loãng Ủ đĩa chứa môi trường Tryptic soybean agar 30oC - 35oC ngày đến ngày ủ đĩa chứa môi trường Sabouraud dextrose agar 20oC - 25oC ngày đến ngày Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Đánh giá kết quả: tổng số vi sinh vật hiếu khí coi số khuẩn lạc đếm môi trường Tryptic soybean agar Khuẩn lạc nấm phát môi trường coi phần tổng số vi sinh vật hiếu khí Tổng số nấm coi số khuẩn lạc đếm môi trường Sabouraud dextrose agar Xác định vi khuẩn Gram âm dung nạp mật 10 g mẫu thử hòa tan 90 ml môi trường Tryptic soybean broth, lắc ủ 20oC - 25oC, từ đến không Chuyển ml dung dịch vào 100 ml môi trường Mossel broth, ủ 30oC 35oC, 24 đến 48 Sau đó, cấy chuyển lên môi trường Violet red bile agar ủ 30oC - 35oC, 18 đến 24 Mẫu thử khơng có Enterobacteria khơng thấy khuẩn lạc mọc mơi trường Violet red bile agar Trong trường hợp có khuẩn lạc đặc trưng môi trường Violet red bile agar, tiến hành Đánh giá số lượng theo hướng dẫn phần Đánh giá số lượng vi khuẩn Gram âm dung nạp mật Phụ lục 13.6, DĐVN V Xác định vi sinh vật gây bệnh khác Tìm Escherichia coli  Chuyển 10 ml dung dịch mẫu thử môi trường đệm phosphat pH (ở phần Xác định tổng số vi sinh vật) vào 90 ml môi trường Tryptic soybean broth, ủ 30oC - 35oC, 18 đến 24  Chuyển ml dung dịch vào 100 ml môi trường MacConkey broth, ủ 42oC - 44oC, 24 đến 48  Sau đó, cấy chuyển lên mơi trường MacConkey agar ủ 30oC - 35oC, 18 đến 72 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh  Mẫu thử khơng có Escherichia coli không thấy khuẩn lạc mọc môi trường MacConkey agar  Trong trường hợp có khuẩn lạc đặc trưng môi trường MacConkey agar, tiến hành thực phản ứng sinh hóa đặc trưng với Escherichia coli (nhuộm gram, phản ứng indole) để kết luận Tìm Staphylococcus aureus  Chuyển 10 ml dung dịch mẫu thử môi trường đệm phosphat pH (ở phần Xác định tổng số vi sinh vật) vào 90 ml môi trường Tryptic soybean broth, ủ 30oC - 35oC, 18 đến 24  Sau đó, cấy chuyển lên mơi trường Mannitol salt agar ủ 30oC - 35oC, 18 đến 72  Mẫu thử Staphylococcus aureus khơng thấy khuẩn lạc mọc mơi trường Mannitol salt agar  Trong trường hợp có khuẩn lạc đặc trưng môi trường Mannitol salt agar, tiến hành thực phản ứng sinh hóa đặc trưng với Staphylococcus aureus (nhuộm gram, phản ứng coagulase) để kết luận Tìm Salmonella  10 g mẫu thử hịa tan 90 ml mơi trường Tryptic soybean broth, lắc ủ 30oC - 35oC, từ 18 đến 24  Chuyển ml dung dịch vào 100 ml môi trường Rappaport Vassiliadis, ủ 30oC - 35oC, 18 đến 24  Sau đó, cấy chuyển lên mơi trường Xylose Lysine Deoxycholate agar ủ 30oC - 35oC, 18 đến 48  Mẫu thử khơng có Salmonella không thấy khuẩn lạc mọc môi trường Xylose Lysine Deoxycholate agar  Trong trường hợp có khuẩn lạc đặc trưng môi trường Xylose Lysine Deoxycholate agar, tiến hành thực phản ứng sinh hóa đặc trưng với Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Salmonella (nhuộm gram, phản ứng ngưng kết với kháng huyết đa giá O) để kết luận Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn