anthocyanin nghiên cứu tách chiết từ cây mồng tơi basella ruba l và khảo sát khả năng chống oxy hóa, nhận diện hàn the trong thực phẩm

Chỉ số IC50 của Anthocyanin mồng tơi là 1,8 µg/mL thấp hơn hẳn so với acid abscorbic là 8,4 µg/mL và acid galic 2,6 µg/mL đã chứng tỏ khả năng kháng oxy hóa của Anthocyanin rất cao, mang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ANTHOCYANIN - NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT

TỪ CÂY MỒNG TƠI BASELLA RUBA L VÀ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY-HÓA, NHẬN DIỆN HÀN THE TRONG THỰC PHẨM

MSSV: 3102836 LỚP: CNSHTT K36

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ANTHOCYANIN - NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT

TỪ CÂY MỒNG TƠI BASELLA RUBA L VÀ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY-HÓA, NHẬN DIỆN HÀN THE TRONG THỰC PHẨM

MSSV: 3102836 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 11/ 2014

DUYỆT HỘI ĐỒNG

ThS Trần Thị Xuân Mai Ngô Trần Hữu Nghĩa

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Qua quá trình học tập và nghiên cứu, đến nay tôi đã hoàn thành Luận văn Tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học Tiên tiến Trong suốt quá trình nghiên cứu, luôn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình, quý thầy cô, bạn bè đã giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ths.Trần Thị Xuân Mai và Ths Đỗ Tấn Khang đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cũng như luôn động viên, khuyến khích tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi học tập và thực hiện đề tài

Ths Phạm Thị Phương Thảo, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm Phân tích vách

tế bào và chất điều hòa sinh trưởng, Khoa nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi làm các thí nghiệm kiểm chứng hoạt tính Anthocyanin

Các bạn lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến K36 và các em: Võ Ngọc Thanh lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến K37 Trần Niên Chấn lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến K38 đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này

Ngô Trần Hữu Nghĩa

sự thay đổi màu trong các dung dịch có chứa Natriborat với pH lần lượt từ 1,0 đến 8,0 Trong nghiên cứu này, phương pháp tách chiết với dung môi nước cất trong điều kiện nhiệt độ 30 o C đạt hiệu quả cao nhất với hàm lượng Anthocyanin toàn phần thu được là 3,33% Chỉ số IC50 của Anthocyanin mồng tơi là 1,8 µg/mL thấp hơn hẳn so với acid abscorbic là 8,4 µg/mL và acid galic 2,6 µg/mL đã chứng tỏ khả năng kháng oxy hóa của Anthocyanin rất cao, mang tiềm năng lớn cho vai trò thực phẩm chức năng và bảo quản thực phẩm Thí nghiệm nhận diện hàn the cho kết quả Anthocyanin

có khả năng nhận diện hàn the trong thực phẩm; kit dung dịch 20% cho kết quả tốt nhất với khả năng nhận diện nồng độ hàn the tối thiểu là 0,05% và giấy thử anthocyanin 20% cho kết quả tối thiểu nhận biết là 0,1% hàn the Ngoài ra khả năng nhận biết và phân biệt NaOH ở các nồng độ khác nhau bằng 2 loại sản phẩm nhận diện hàn the đã khẳng định tính khả thi của các sản phẩm này trong nhận diện chất bảo quản thực phẩm

Từ khóa: Anthocyanin, mồng tơi, tách chiết, kháng oxy hóa, hàn the

MỤC LỤC

TÓM LƯỢC iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

I.Đặt vấn đề 1

II.Mục đích 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

I.Cây mồng tơi tím basella rubra l 3

1.1.Đặc điểm phân loại 3

1.2.Hàm lượng dinh dưỡng 4

1.3.Ứng dụng 4

1.3.1.Đời sống 4

1.3.2.Y học 5

II.Anthocyanin và ứng dụng 5

2.1.Nguồn Gốc và Cấu Tạo Phân Tử 5

2.2.Tính Chất Của Anthocyanin 7

2.3.1.Tính Chất Vật Lí 7

2.3.2.Tính Chất Hóa Học 9

2.3.Chức Năng Của Anthocyanin 9

2.4.Ứng Dụng Của Anthocyanin 11

2.4.1.Đối với thực vật 11

2.4.2.Đối với con người 12

2.5.Các nghiên cứu về Anthocyanin thực vật: 15

III.Các hợp chất chống oxy hóa 16

3.1 Acid Gallic 16

3.2 Vitamin E 17

3.3 Vitamin C 17

3.4.β- Carotenoid 17

3.5 Betalain 18

IV.Cơ chế của quá trình tách chiết và ứng dụng anthocyanin trong mồng tơi tím 18

3.1.Tách Chiết Anthocyanin 19

3.2.Hàm Lượng Anthocyanin 19

3.3.Nhận Biết Hàn The 20

3.4.Tính Chống Oxy Hóa 20

3.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa của Anthocyanin 20

3.4.2 Cơ chế phản ứng của DPPH 20

CHƯƠNG III.PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

I.Thời gian và địa điểm 22

II.Phương tiện nghiên cứu 22

2.1.1.Vật liệu 22

2.1.2.Dụng Cụ 22

2.1.3.Thiết Bị 22

2.1.4 Hóa Chất 22

III.Phương pháp nghiên cứu 23

3.1.Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 23

3.2.Phương pháp ly trích anthocyanin từ quả mồng tơi 23

3.3.Phương pháp xác định ẩm độ 23

3.3.1.Chuẩn bị bình hút ẩm và cốc đựng mẫu 23

3.3.2.Xác định độ ẩm 23

3.4.Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin 24

3.5.Phương pháp dựng đường chuẩn và tính chỉ số IC50 DPPH 25

3.6.Phương pháp chuẩn bị dung dịch nhận diện hàn the 25

3.7.Thu thập và xử lý số liệu 25

IV.Bố trí thí nghiệm 25

5.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và nhiệt độ đến quá trình

tách chiết anthocyanin 26

5.3.1.Xác định độ ẩm mẫu 26

5.4.Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cuả anthocyainin mồng tơi 28 5.5.Thí nghiệm 5: khảo sát khả năng nhận biết hàn the 28

5.3.1.Thí nghiệm nhận biết hàn the 28

5.3.2.Sản xuất thử dung dịch anthocyanin nhận diện hàn the 29

5.3.3.Sản xuất thử giấy tẩm anthocyanin dùng nhận diện hàn the 29

5.3.4.Thí nghiệm khảo sát khả năng nhận diện NaOH trong thực phẩm: 30

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

I.THÍ NGHIỆM 1: Nhân biết sự thay đổi màu sắc của Anthocyanin mồng tơi qua các khoảng pH 31

II.THÍ NGHIỆM 2: Xác định bước sóng hấp thụ cao nhất 32

III.THÍ NGHIỆM 3: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và nhiệt độ đến quá trình tách chiết anthocyanin 32

3.1.Xác định độ ẩm mẫu 32

3.2.Hàm lượng Anthocyanin toàn phần 33

IV.THÍ NGHIỆM 4: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 35

V.THÍ NGHIỆM 5: Khảo sát khả năng nhận diện hàn the 36

5.1.Thí nghiệm phản ứng của Anthocyanin với dung dịch di sodium tetra borate (hàn the) 36 3.2.Dung dịch nhận diện hàn the 39

5.2.Giấy Thử hàn the 40

5.3.Các thí nghiệm nhận biết NaOH 43

5.3.1.Nhận biết NaOH bằng bộ kit dung dịch 20% 43

5.3.2.Nhận biết NaOH bằng giấy thử 20% 44

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 52

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Hàm lượng các chất có trong 100 g cây mồng tơi tím (Sakakibara et al., 2003)

4

Bảng 2.Giá trị mật độ quang trong một số bộ phận của rau, củ, quả Việt Nam (Phạm Thị Thanh Nhàn, 2011) 9

Bảng 3 Hàm lượng Anthocyanin trên một số loại trái cây (World Crop,n.d) 10

Bảng 4 Hàm lượng Anthocyanin trong một số mẫu rau, củ, quả Việt Nam (Nhàn, 2011) 11 Bảng 5 Độ ẩm của quả mồng tơi 32

Bảng 6 Hàm lượng anthocyanin toàn phần từ các nghiệm thức tách chiết 33

Bảng 7 Hoạt tính kháng oxy hóa của Anthocyanin mồng tơi 35

Bảng phụ lục 1 Độ ẩm của quả mồng tơi 52

Bảng phụ lục 2 Khả năng kháng oxy hóa của Anthocyanin mồng tơi 52

Bảng phụ lục 3 Số liệu thô hàm lượng Anthocyanin trong quả mồng tơi qua các nghiệm thức tách chiết 41

Bảng phụ lục 4 Bảng Annova 42

Bảng phụ lục 5 Hàm Lượng Anthocyanin toàn phần 42

Bảng phụ lục 6 Multiple range test 42

Bảng phụ lục 7 Kết quả kháng oxy hóa 43

Bảng phụ lục 8 Bảng Anova 43

Bảng phụ lục 9 Turkey HSD 43

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cấu trúc phân tử của Anthocyanin 6

Hình 2 Chu trình tổng hợp Anthocyanin trong tế bào thực vật (Sullivan, 1998) 7

Hình 3 Sự thay đổi màu sắc của Anthocyanin theo pH 8

Hình 4 Cấu trúc phân tử acid betalamic và betacyanin đơn giản thường gặp 18

Hình 5 Quy trình thực hiện quá trình tách chiết anthocyanin 27

Hình 6 Sự thay đổi màu sắc của Anthocyanin mồng tơi trong pH 1-14 31

Hình 7 Hấp thụ quang phổ của anthocyanin mồng tơi trong bước sóng từ 450nm đến 650 nm 32

Hình 8 Sự khác nhau về hàm lượng Anthocyanin toàn phần giữa các nghiệm thức tách chiết 34

Hình 9 Màu sắc mẫu sau khi phản ứng với DPPH 35

Hình 10 Biểu đồ đường chuẩn tính kháng oxy hóa của Anthocyanin mồng tơi 36

Hình 11.Sự thay đổi màu sắc của dịch trích (a) nồng độ 10%, (b) nồng độ 20% 37

Hình 12 Dung dịch Anthocyanin tại pH = 9 38

Hình 13 (a) Kit thử hàn the 20%, (b) Kit thử hàn the 10% 39

Hình 14 Kết quả thử hàn the bằng dung dịch anthocyanin 20% 39

Hình 15 Kết quả thử hàn the bằng dung dịch anthocyanin 10% 40

Hình 16 Kết quả thử hàn the bằng giấy thử 20% 40

Hình 17 Kết quả thử hàn the bằng giấy thử 30% 41

Hình 18 Kết quả thử hàn the bằng giấy thử 40% 41

Hình 19 Kết quả thử hàn the bằng giấy thử 50% 42

Hình 20 Kết quả thử hàn the bằng giấy thử 60% 42

Hình 21 Kết quả thử hàn the của các loại giấy thử trên thị trường 43

Hình 22 Kết quả nhận biết dung dịch NaOH 44

Hình 23 Kết quả thử NaOH nồng độ 1%, (1),(2) giấy thử trên thị trường, (3) giấy thử trong nghiên cứu 44

Hình 24 Kết quả thử NaOH nồng độ 0.5%(1),(2) giấy thử trên thị trường, (3) giấy thử trong nghiên cứu 45

Hình 25 Kết quả thử NaOH nồng độ 0,05%(1),(2) giấy thử trên thị trường, (3) giấy thử trong nghiên cứu 45

TỪ VIẾT TẮT

DPPH : 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate

IC50: inhibitory concentration 50

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

I Đặt vấn đề

Anthocyanin là một trong những nhóm sắc tố quan trọng trong tế bào thực vật bậc cao bên cạnh các sắc tố lục Chlorophyll và Carotenoid, anthocyanin đóng vai trò là trong sự tạo thành hệ phức màu tự nhiên cho các loại rau, hoa, quả, hạt mà hiện tại vẫn chưa thể thay thế bằng các loại màu tổng hợp Các loại màu tổng hợp bằng kỹ thuật nhân tạo chỉ có thể đáp ứng được chức năng tạo màu cho sản phẩm và vẫn còn tồn tại một số vấn đề đáng lo ngại về sức khỏe như gây ung thư, rối loạn thần kinh, tiêu hoá hoặc ngộ độc gây tử vong .Trong khi đó Anthocyanin là một hợp chất hữu cơ tự nhiên phân cực, tan tốt trong hệ dung môi phân cực với những đặc tính chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm, ngăn ngừa bệnh tim mạch (Bertuglia,1995; Borissova,1994; Joseph,1999; Pawlowicz, 2000; Tsuda, 1998) Với tính chất tự nhiên cùng những đặc tính quý giá của anthocyanin mà chất màu tổng hợp ngày nay không thể có được đã hướng các nhà khoa học cũng như các tổ chức kinh doanh rất quan tâm nghiên cứu khai thác chất màu tự nhiên này để sử dụng trong thực phẩm giúp đảm bảo

an toàn sức khỏe cho người tiêu dùng

Mồng tơi (Basella rubra L.) là loại rau ăn được đánh giá là dễ trồng do thời gian

sinh trưởng ngắn, phương pháp trồng đơn giản, thích hợp với nhiều loại đất Lá mồng tơi được biết là rất giàu -caroten và vitamin A, thân chứa nhiều sắt, canxi và chất nhầy, thường dùng làm rau nấu canh rất được nhiều người ưa chuộng vì vừa ngon lại

có tác dụng dược liệu giúp mát gan, hoạt trường và thông đại tiểu tiện Người sản xuất thường chỉ sử dụng lá và thân mồng tơi để bán, phần quả sau thu hoạch thường không

sử dụng đến hoặc chỉ tận dụng một ít làm giống cho vụ sau Thịt quả mồng tơi có màu

đỏ tím hoặc đỏ tươi rất đẹp, các sắc tố của chúng hòa tan trong nước và đây là một nguồn tiềm năng trong chế biến các phẩm màu tự nhiên Việc sử dụng quả mồng tơi để tách chiết Anthocyanin vừa có thể giải quyết được lượng lớn quả mồng tơi sau khi thu hoạch tránh lãng phí vừa góp phần cung cấp những phẩm màu tự nhiên an toàn cho sức khỏe con người

An toàn thực phẩm không chỉ dừng lại ở các chất tạo màu mà còn ảnh hưởng bởi các chất bảo quản thực phẩm Hiện trạng một số chất bảo quản thực phẩm bị cấm sử dụng vẫn tồn tại trong thực phẩm gây lo ngại cho người tiêu dùng, cụ thể như hàn the

– một chất có tính sát khuẩn nhẹ có khả năng làm cho tinh bột, thịt, cá trở nên dai và kéo dài thời gian bảo quản Màu sắc của Anthocyanin có thể bị thay đổi theo sự thay đổi của giá trị pH, dựa vào đặc tính này có thể được sử dụng như chất chỉ thị để nhận biết sự hiện diện của Natri borate (hàn the) trong thực phẩm qua sự thay đổi màu của anthocyanin Với những lý do nêu trên, đề tài luận văn này nhằm: Nghiên cứu tách

chiết anthocyanin từ cây mồng tơi Basella ruba L và khảo sát khả năng chống

oxy-hóa, nhận diện hàn the trong thực phẩm

II Mục đích

- Nghiên cứu tách chiết Anthocyanin từ quả mồng tơi

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của Anthocyanin từ quả mồng tơi

- Bước đầu khảo sát khả năng nhận diện hàn the trong thực phẩm của

Anthocyanin từ quả mồng tơi

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I Cây mồng tơi tím Basella rubra L

1.1 Đặc điểm phân loại

Đặc điểm phân loại:

và loài B rubra Đặc tính sinh trưởng phù hợp với điều kiện địa lý vùng nhiệt đới như

có thể chịu được nhiệt độ và độ ẩm cao, sinh trưởng trong điều kiện cường độ ánh sáng mạnh Ngoài ra, loài thực vật này còn có thể sinh trưởng tốt trên nhiều loại đất kém dinh dưỡng và thoát nước nhanh như đất pha sét, đất cát pha, đất cát có độ pH từ 5.5 đến 8.0, đặc biệt mồng tơi có thể sống ở đất phèn nặng Mồng tơi ưa sáng không thích hợp trồng trong bóng râm, nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ sinh trưởng của cây Thời gian sinh trưởng của mồng tơi độ khoảng 55 ngày, thân có thể mọc dài đến 10m Khoảng thời gian sinh trưởng tốt nhất từ tháng năm đến tháng chín hàng năm vì đây là các tháng có “ngày ngắn” Mồng tơi được trồng trực tiếp bằng cách gieo hạt hoặc trồng bằng các đoạn thân dài khoảng 20 cm sẽ cho thời gian sinh trưởng và phát triển nhanh hơn (World Crop; Park Seed, n.d)

Về giải phẫu học, Basella ruba là một loài dây leo, thân mập và mọng nước Lá

hình tim mọc xen, đơn, nguyên, có cuống, gân lá màu tím; có vị dịu và nhớt Hoa lưỡng tính mọc thành cụm ở kẽ lá, có màu trắng hoặc trắng hồng Quả mọng, nhỏ, hình cầu hoặc trứng, dài khoảng 5–6 mm, màu xanh, khi chín chuyển màu tím đen

1.2 Hàm lượng dinh dưỡng

Bảng 1 Hàm lượng các chất có trong 100 g cây mồng tơi tím (Sakakibara et al., 2003)

tơi còn được nấu chung với các nguyên liệu đắt tiền như thịt cua, thịt bò, Quả mồng tơi được dùng làm phẩm nhuộm, màu thực phẩm và mực viết

1.3.2 Y học

Rất nhiều ứng dụng về dược phẩm đã được nghiên cứu và đúc kết qua nhiều thế

hệ và đến ngày nay công dụng dược liệu của cây mồng tơi đang được nghiên cứu nhằm tận dụng tối đa nguồn lợi từ loài thực vật này Có một số ứng dụng đã được chứng minh:

‒ Giảm chrolesterol trong máu thông qua ảnh hưởng của việc hấp thu chrolesterol trong thức ăn của chất nhầy rau mồng tơi, sau đó chất này sẽ thải ra qua phân

‒ Dịch ép của quả mồng tơi trị viêm kết mạc

‒ Nước cốt từ rau mùng tơi có thể làm mau lành vết bỏng, hầm mùng tơi với chân giò thêm chút rượu để ăn hàng ngày sẽ giúp trị đau nhức xương khớp

‒ Cùng với tính tính hàn, vị chua, tán nhiệt, lợi tiểu, giải độc, đẹp da, trị rôm sảy mụn nhọt hiệu quả theo đông y, mồng tơi thích hợp làm thức ăn cho những ngày nắng nóng, giúp người lao động ngoài trời nắng nóng giữ được sức khỏe, tránh trúng phải nhiệt, hàn

II Anthocyanin và ứng dụng

2.1 Nguồn Gốc và Cấu Tạo Phân Tử

Sắc tố thực vật đóng vài trò quan trọng trong quá trình quang hợp của thực vật, bao gồm sắc tố lục Chlorophyll, sắc tố vàng- cam Carotenoid, Phycobilin ở thực vật bậc thấp và Anthocyanin – sắc tố dịch bào Người ta có thể đánh giá khả năng quang hợp của thực vật và xếp chúng vào loại ưa bóng hay ưa sáng dựa vào thành phần các sắc tố Anthocyanin tồn tại trong hầu hết thực vật bậc cao và có hàm lượng cao trong các loại rau quả có màu đỏ, tím như: quả nho, quả dâu, lá tía tô, gạo lứt, gạo huyết rồng, quả việt quất, nam việt quất, mâm xôi, bắp cải tím, Ngoài ra Anthocyanin cũng xuất hiện trong rễ, bao lá mầm, thân, bề mặt cánh hoa, các vết đốm và gân lá (Stafford

et al., 1994; Francis et al., 1999; Manetas, 2006; Uyên, 2011)

Anthocyanin là những glucozit do gốc đường glucose, glactose kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin) Anthocyanidin của chúng có cấu trúc cơ bản được

mô tả trong hình 2 Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycozit.Các aglucon của anthocyanin khác nhau

chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3 (Wrolstad, 1993)

Hình 1 Cấu trúc phân tử của Anthocyanin

Anthocyanin có thể được tổng hợp bằng 2 cách từ các nguồn nguyên liệu hóa học thô trong tế bào Cả 2 lộ trình đều xuất phát từ dẫn xuất acetate (C2) từ quá trình quang hợp và diễn ra theo hai hướng Chu trình acid Shikimic cho sản phẩm phenylalanine trong khi đó lộ trình acid acetic cho sản phẩm là malonyl-Coenzyme A(C3) Trãi qua các quá trình biến đổi, cả 2 lộ trình cùng tạo ra sản phẩm là enzyme chalcone synthase (CHS) rồi chuyển thành hợp chất trung gian enzyme chalcone isomerase (CHI) Cuối cùng CHI bị oxy hóa bởi flavonoid hydroxylase và gắn các gốc đường cho ra sản phẩm là Anthocyanin (Sullivan, 1998)

Hình 2 Chu trình tổng hợp Anthocyanin trong tế bào thực vật (Sullivan, 1998)

2.2 Tính Chất Của Anthocyanin

2.3.1 Tính Chất Vật Lí

Màu sắc của Anthocyanin thay đổi mạnh khi thay đổi pH do sự phụ thuộc vào pH môi trường Ngoài ra, các sắc tố khác có mặt trong dung dịch cũng ảnh hưởng đến màu của Anthocyanin Thông thường khi pH < 7 các Anthocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 có màu xanh Ở pH= 1.0 các anthocyanin ở dạng muối oxonium hoặc flavium màu cam đến đỏ, pH= 4~5 chất này chủ yếu tồn tại dạng

muối carbinol không màu và khi pH= 7 ~ 8 trở về dạng base quinoidal anhydro có màu xanh.( Michaelis et al., 1936)

Hình 3 Sự thay đổi màu sắc của Anthocyanin theo pH

 pH = 1: Màu đỏ của cation flavynium

 pH = 24: Màu xanh của quinoidal

 pH = 56: Hai dạng không màu carbinol pseudo baz và chalcone

 pH > 7: Anthocyanin bị thoái hóa tùy vào các nhóm thế

pH = 46: Có 4 dạng cấu trúc Anthocyanin cùng tồn tại: Ion dương flavylium, quinoidal khan (cấu trúc không có nước), carbinol baz không màu và chalcone màu vàng nhạt Cân bằng giữa các dạng quinoidal baz và carbinol thông qua cation flavylium (cấu trúc D, A và E) Khi pH tăng, dạng bazơ khan tăng, trong điều kiện acid, dạng ion flavynium màu đỏ là chủ yếu

Bước sóng hấp thụ cực đại trong miền nhìn thấy của Anthocyanin vào khoảng 510 ~ 540 tùy thuộc vào anthocyanin của từng loại mẫu và từng bộ phận trên cây do nồng độ Anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh (Sullivan, 1998)

Bảng 2.Giá trị mật độ quang trong một số bộ phận của rau, củ, quả Việt Nam (Phạm Thị Thanh Nhàn, 2011)

Methanol HCl 0,1%

Methanol 0.01% HCl

Anthocyanin tinh khiết dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực

do các gốc Hyroxyl trên vòng thơm và tan tốt trong dung môi phân cực (Michaelis et al., 1936) Sự hình thành Anthocyanin bị ảnh hưởng bởi nồng độ NO3- (Bhojwani, 1996)

2.3 Chức Năng Của Anthocyanin

Anthocyanin trong thực vật đóng vai trò như sắc tố hấp thụ tia cực tím (UV) nhằm bảo vệ lục lạp khỏi bức xạ ánh sáng Ngoài ra chất này còn có tác dụng tạo điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán hạt nhờ màu sắc của hoa và quả Màu sắc này có tác dụng thu hút với côn trùng nhưng lại trở nên khó nhìn thấy đối với con người Để đáp ứng lại các kích thích từ môi trường như thay đổi nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, thực vật

sẽ sinh tổng hợp Anthocyanin ở lá cây

Bên cạnh đó người ta còn phát hiện ở Anthocyanin một số vai trò khác như ảnh

hưởng khả năng tích tụ hàm lượng molybden và tungsten ở loài Brassica sp (Bắp cải)

khi tăng hàm lượng chất màu; hay ở các mô có chứa Anthocyanin, khả năng bị tấn công bởi nấm mốc giảm đi (Hale, at al., 2001, 2002)

Ngoài ra, Anthocyanin còn có tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa và hạn chế

sự suy giảm sức đề kháng (Sullivan, 1998)

Nồng Độ Anthocyanin trong môt số loại thực vật

Thông qua một số bài báo khoa học cũng như số liệu thực nghiệm thông qua nghiên cứu Nồng độ Anthocyan trong một số thực vật đã được đánh giá bằng phương pháp pH vi sai nhằm tạo điều kiện cho việc chọn dung môi và nguyên liệu giàu Anthocyanin phù hợp để khai thác sử dụng

Bảng 3 Hàm lượng Anthocyanin trên một số loại trái cây (World Crop,n.d) Nguồn thực phẩm Hàm lượng Anthocyanin/ 100 g

Bảng 4 Hàm lượng Anthocyanin trong một số mẫu rau, củ, quả Việt Nam

(Nhàn, 2011)

STT Mẫu Hàm lượng toàn

phần (%)

Sắc tố Anthocyanin đơn tử (mg/l)

Màu đa tử (%)

và phát tán hạt giống của cây

Các nghiên cứu mới đây đã chứng minh được rằng các Anthocyanin giúp che chở các lục lạp, bảo vệ các diệp lạp chống lại cường độ ánh sáng cao, giúp ngăn sự

ức chế quá trình quang hợp Chalker-Scott (1999) đã đề ra 3 vai trò chính của Anthocyanin trong thực vật gồm:

 Hấp thụ các tia bức xạ

 Vận chuyển các monosaccharide

 Điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong các giai đoạn khô hạn và nhiệt độ thấp Ngoài ra, người ta còn phát hiện ở Anthocyanin một số vai trò khác như: Hale

et al (2001, 2002) thấy rằng khi hàm lượng chất màu tăng thì khả năng tích tụ

molybden và tungsten ở loài Brassica sp (Bắp cải) cũng tăng; hay ở các mô có

chứa Anthocyanin, khả năng bị tấn công bởi nấm mốc giảm đi (Huỳnh Thị Thanh Tuyền et al , 2011)

Anthocyanin tích tụ trong tế bào là do kết quả của sự tổn thương cơ học hay do

thiếu hụt phosphoros hoặc nitrogen (Gould et al., 2002) Nói chung, người ta tin rằng

Anthocyanin có khả năng tăng cường phản ứng chống oxy hóa của tế bào đối với các yếu tố gây stress

2.4.2 Đối với con người

2.4.2.1 Vai trò đối với sức khỏe con người

Anthocyanin sau khi được chuyển hóa có thể biểu hiện những hoạt tính như chống ung thư, chống xơ vữa động mạch, chống viêm, giảm mức độ thẩm thấu, độ vỡ của mao mạch, ức chế sự đông tụ của các tiểu huyết cầu và thúc đẩy sự tạo thành cytokine từ đó điều hòa các phản ứng miễn dịch Tất cả những hoạt tính này đều dựa trên khả năng chống oxy hóa của các Anthocyanin

*Chống ung thư:

Tất cả các căn bệnh ung thư đều do sự hình thành, tăng trưởng và suy vong của các tế bào bất bình thường Các khối u là do sự tích tụ của các tế bào với số lượng lớn hơn nhu cầu cần thiết cho sự phát triển, sửa chữa và hoạt động của các

mô Trong các nghiên cứu in-vitro và in-vivo, các hợp chất Anthocyanin đều cho thấy khả năng giảm sự tăng trưởng của các tế bào ung thư và ức chế sự hình thành khối u một cách đáng kể Cơ chế chống ung thư của Anthocyanin nói riêng và các hợp chất phenolic nói chung vẫn chưa được xác định chắc chắn, có thể liên quan đến khả năng ức chế các enzyme cyclooxygenase và hoạt tính chống oxy hóa Một số nghiên cứu về khả năng chống ung thư của Anthocyanin

‒ Các Anthocyanin trong khoai lang tím và bắp cải tím ức chế sự ung thư ruột

này, nhóm hydroxy tự do ở vị trí C3 trong dạng cấu trúc flavylium của Anthocyanidin góp phần ức chế sự phát triển cùa các dòng tế bào ung thư của người được khảo sát Trong Anthocyanin, nhóm hydroxy ở vị trí C3 luôn bị thế bởi các gốc đường, và vì vậy, các Anthocyanin không có được khả năng ức chế như trên Ngoài

ra, số nhóm hydroxyl và methoxyl trong vòng B của cyanidin cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư được nghiên cứu Hoạt tính ức chế cao nhất thuộc về maldivin, vốn có nhóm hydroxy ở vị trí 3 và 4’ và nhóm methoxy ở các

vị trí 3’ và 5’

Nghiên cứu về khả năng ức chế sự di căn của các tế bào ung thư của Anthocyanin Sự di căn đòi hỏi tế bào phải có khả năng di động, khả năng kết dính bề mặt và sự hoạt động của các protease ngoại bào như serine protease, matalloproteinase (MMPs), cathepsine, nhằm phân hủy mạng lưới ngoại bào (extracellular matrix – ECM), cho phép các tế bào di căn Trong đó, các enzyme quan trọng nhất là serine protease và MMPs MMPs là nhóm enzyme phân hủy phụ thuộc vào Zn có khả năng phân hủy các protein của mạng lưới ngoại bào như collagen, proteoglycan, fibronectin

và elastin Cả MMP – 2 và MMP – 9 đều xuất hiện nhiều trong nhiều khối u ác tính và góp phần vào sự di căn Các hợp chất cyanidin 3-rutinoside and cyanidin 3-glucoside chiết suất từ quả dâu tằm được chứng minh là có khả năng ức chế các enzyme MMP, hạn chế sư di căn của dòng tế bào ung thư được nghiên cứu

*Chống các bệnh tim mạch:

Các hợp chất flavanoid nói chung và các Anthocyanin nói riêng được cho là

có khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh động mạch vành bởi khả năng ngăn chặn

sự oxy hóa các lipoprotein có tỉ trọng thấp (LDL) trong huyết tương Sự oxy hóa các hợp chất này được xem như một bước quan trọng trong sự hình thành các khối

xơ động mạch và từ đó dẫn đến căn bệnh động mạch vành

Vai trò của Anthocyanin trong việc phòng chống các bệnh tim mạch có liên quan trực tiếp đến hoạt tính chống oxy hóa, giảm viêm, tăng độ bền và khả năng thẩm thấu của thành mạch máu, ức chế sự động tụ của các tiểu huyết cầu

quý như khả năng chống oxy hóa, chống lão hóa, ngăn ngừa ung thư, chống các tia phóng xạ Anthocyanin dễ dàng tạo màu sắc bắt mắt cho sản phẩm bởi chất có tính acid tự nhiên như nước chanh, nước cam hoặc một số chất tự nhiên có tính kiềm, các sản phẩm này có thể đảm bảo an toàn sức khỏe cho người tiêu dùng Bên cạnh các ứng dụng trên, Anthocyanin từ dịch chiết hoa, quả có thể được dùng làm chất chỉ thị màu nhằm nhận biết sự có mặt của Natriborat trong hàn the

Hiện nay, để đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng ngày càng quan tâm đến việc

sử dụng các chất màu tự nhiên hơn là sử dụng các chất màu tổng hợp, vốn có thể gây những tác dụng xấu về sức khỏe cho người sử dụng Rất nhiều loại dịch trích từ các loại rau và trái có màu sắc tạo bởi các Anthocyanin đã đươc sử dụng để tạo màu cho thực phẩm

Chất màu Anthocyanin (E163) đã được cho phép sử dụng rộng rãi trong các loại thực phẩm như đồ uống (30 – 40 ppm), mứt trái cây (20 – 60 ppm), bánh kẹo (chewing gum, kẹo cứng, kẹo mềm), yoghurt, các sản phẩm tráng miệng như xôi lá cẩm, xôi gấc, rau câu…hay các loại bột hòa tan uống liền Ngoài ra, Anthocyanin còn được dùng trong sản xuất nước giải khát, nước uống có cồn (rượu nho, bia…), rau muối chua, bảo quản thực phẩm đông lạnh, đóng hộp Thông thường, hàm lượng cho phép sử dụng của Anthocyanin không bị giới hạn và chủ yếu phụ thuộc vào từng quy trình sản xuất

Một số thực phẩm có chứa Anthocyanin và công dụng của chúng

Anthocyanin có trong gạo than tới 60,4 mg/100g, cao hơn 94,47% so với gạo trắng, giúp chống lão hóa; chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm; hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư

Dâu tây, việt quất và quả mâm xôi đều có chứa Anthocyanin giúp hoạt động não

ổn định và tốt hơn, đồng thời cũng có khả năng giúp cơ thể chống ung thư

Ngoài những vai trò sinh lý đối với thực vật, các hợp chất Anthocyanin được hấp thu vào trong dạ dày ở dạng phân tử hoặc có thể được hỗ trợ bởi một cơ chế vận

được hấp thu ở mức độ rất thấp, chỉ khoảng 0,016% đến 0,11% lượng tiêu thụ ở người (Tuyền H et al., 2011)

2.5 Các nghiên cứu về Anthocyanin thực vật:

2.5.1 Chất chống oxi hóa Anthocyanin từ trái cây ăn được

Các loại trái cây ăn được của 12 loài thực vật được trích xuất trong Methanol

và bị dung môi phân ba vùng: hexane, ethyl acetate, và dung dịch nước Phân đoạn dung dịch nước bán tinh khiết đã được tách ra trên nhựa HP-20SS Diaion để loại bỏ đường và acid ascorbic Sau đó, các phân đoạn đã được tầm soát cho hoạt động chống oxy hóa bằng cách sử dụng khảo nghiệm 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Chín trong số các phân đoạn bán tinh khiết biểu hiện khả năng chống oxy hóa cao Cyanidin-3-Ob-glucopyranoside, một chất chống oxy hóa Anthocyanin, đã được xác định từ các phân đoạn của dung dịch nước bán tinh khiết của các loài

Chrysophyllum cainito, Eugenia uniflora và Myrciaria cauliflora

Delphinidin-3-Ob-glucopyranoside đã được xác định từ Eugenia uniflora (L.S Einbond et al

2004)

2.5.2 Nghiên cứu tách chiết Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus sabdariffa- Ứng

dụng để sản xuất giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích chiết xuất chất màu

Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus, tách bỏ bớt các tạp chất để có thể thu được thành

phẩm chứa hàm lượng Anthocyanin cao nhất Sử dụng chất màu thu được để nghiên cứu sản xuất giấy chỉ thị xác định nhanh hàn the trong thực phẩm Bằng phương pháp so màu và phương pháp pH vi sai, đã xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết chất màu là dung môi Ethanol/nước: 50/50 bổ sung 1% HCl; tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 14 ml/1 gam; thời gian chiết 6 ngày Bằng phương pháp chiết phân đoạn, đã tách được chất màu thô Anthocyanin từ dịch chiết của đài hoa

Hibiscus Đã xác định được hàm lượng chất màu trong nguyên liệu khô là 15,2%

tương ứng trong nguyên liệu tươi là 1,06% Độ acid của nguyên liệu khô là 3,37 mldH+/1 gam nguyên liệu, độ acid của chất màu khô là 3,83 mldH+/1 gam chất màu, tương ứng 0,58 mldH+/1 gam nguyên liệu khô, tức là độ acid đã giảm 83%

Đã khảo sát một số điều kiện để sản suất giấy chỉ thị hàn the và đã chọn được các

thông số thích hợp với tỉ lệ pha loãng là 1gam màu khô/400ml nước cất; thời gian ngâm tẩm dịch màu lên giấy là 120 giây; thời gian tiếp xúc của giấy chỉ thị với thực phẩm (hoặc dịch thực phẩm) là 90 giây Ngưỡng phát hiện tối thiểu hàn the của giấy chỉ thị là 40 mg/1 kg thực phẩm Kết quả này có ưu điểm là phát hiện được ngưỡng tối thiểu tốt hơn so với giấy nghệ Về độ nhạy khi thử trên một số nguyên liệu thực phẩm cũng thu được kết quả tương tự (Nguyễn Thị Hiển et al., 2012)

2.5.3 Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai

Nghiên cứu này trình bày phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả (quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, trà đỏ, vỏ quả nho, vỏ quả

cà tím) bằng phương pháp pH vi sai Kết quả cho thấy độ hấp thụ cực đại của dịch chiết từ quả dâu tại bước sóng max= 513,5nm; bắp cải tím 523nm; lá tía tô 524nm; trà

đỏ (đài hoa hibicus) 519,5nm; vỏ quả nho 523,5nm; vỏ cà tím 523,5nm Hàm lượng

Anthocyanin trong quả dâu là 1,188%; bắp cải tím: 0,909%; lá tía tô: 0,397%; trà đỏ: 0,335%; vỏ quả nho: 0,564%; vỏ cà tím: 0,441% (Huỳnh Thị Kim Cúc et al, 2011)

III Các hợp chất chống oxy hóa

3.1 Acid Gallic

Acid Gallic có danh pháp quốc tế là 3,4,5-trihydroxy benzoic acid, một acid hữu cơ thuộc nhóm Acid trihydroxybenzoic (dạng Acid phenolic) Công thức hóa học là C6H2(OH)3COOH Là chất kết tinh màu trắng ít tan trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng và alcol, ether Acid Gallic có thể ở cả dạng tự do hay là một phần của tannin Khi đun nóng đến 2100C bị phân hủy thành pyrogalol

Có trong lá chè và nhiều loại thực vật khác: sồi, đinh hương, diệp hạ châu, hạt

dẻ, mâm xôi, tỏi, quả cóc…

Có tính kháng nấm và kháng khuẩn Acid Gallic hoạt động như một chất chống oxy hóa và giúp bảo vệ các tế bào khỏi nguy cơ bị oxy hóa Acid Gallic cũng

có khả năng kháng các tế bào ung thư mà không gây hại đến các tế bào khỏe mạnh

3.3 Vitamin C

Khá phổ biến trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật: rau ngót, cà chua, cà rốt, chanh, cam, bưởi, rau cải, rau mùi, rau bina…

Là chất chống oxy hóa căn bản trong huyết tương, có khả năng tiêu hóa gốc tự

do và ngăn không cho gốc này xâm nhập các phân tủ cholesterol LDH Tăng cường

sự bền bỉ của mao mạch Ngăn không cho gốc tự do xâm nhập qua màng tế bào, kìm hãm sự lão hóa của tế bào, ngăn ngừa ung thư, tăng cường chống sự nhiễm khuẩn, đẩy mạnh mau lành vết thương, kích thích sản xuất sắc tố, kháng thể, kích thích sự bảo vệ các mô, dọn sạch cơ thể, ngăn chặn tác dụng của oxygen

Vitamin C hòa tan trong nước và bài tiết khỏi cơ thể dễ dàng qua thận khi không cần thiết do đó ta không bị ngộ độc khi uống liều lượng cao

3.4 β- Carotenoid

Nhiều trong các loại rau quả thiên nhiên tính theo số miligam ăn được trong 100g thức ăn thì hàm lượng Beta-carotene cao nhất ở gấc (91,6mg%), cà rốt (5mg%), bí đỏ, rau dền, rau muống, đu đủ, xoài

Là tiền chất của vitamin A khi hấp thụ vào cơ thể được chuyển hoá thành vitamin A với tỉ lệ 1mcg beta-carotene thì được 0,167mcg vitamin A Beta-carotene

có những giá trị như vitamin A nhưng không có nhiều độc tính như vitamin A, đặc biệt beta-carotene khử các gốc tự do tốt hơn vitamin A

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh tỷ lệ beta-carotene trong thức ăn gắn liền với việc làm giảm nguy cơ của nhiều căn bệnh ung thư Ngoài ra còn làm trẻ hóa

da, giảm tử vong do bệnh tim mạch…

3.5 Betalain

Là tên gọi chung của một số sắc tố tự nhiên tan trong nước, có màu từ vàng tươi đến da cam, đỏ tươi, đỏ sẫm, hồng cho đến màu đỏ tím trong hoa, quả, lá và củ của nhiều loại thực vật khác nhau: hoa xương rồng, vỏ trái thanh long, hoa giấy, bông bụp, nếp than, rau và củ dền…

Betalain bao gồm 2 nhóm sắc tố chính:Betaxanthin và Betacyanin

Betaxanthin: Là nhóm sắc tố betalain có màu vàng đến cam Có nhiều trong các loại hoa, quả có màu vàng hoặc vỏ quả màu vàng, màu cam: thanh long vỏ vàng, hoa màu vàng, lekima

Betacyanin: Là nhóm sắc tố betalain có màu đỏ đến đỏ tím Có nhiều trong các loại hoa, quả, củ, vỏ quả có màu đỏ, tím, đỏ tím…

‒ Tùy thuộc tỷ lệ giữa 2 nhóm sắc tố này mà các bộ phận thực vật sẽ có màu vàng chanh, vàng cam, cam, đỏ, đỏ tím hay tím đỏ đặc trưng

‒ Các betalain có thể xem là dẫn xuất của acid betalamic, trong đó đầu dihydropyridin được gắn với một nhóm chức chứa Nitơ thông qua nhóm chức vinyl (Nguyễn Thị Mỹ Nương, 2012)

‒ Betacyanin đơn giản nhất là betanidin được cấu tạo từ một đơn vị phân tử acid betalamic liên kết với một phân tử cyclo-DOPA (Nguyễn Thị Mỹ Nương, 2012)

Hình 4 Cấu trúc phân tử acid betalamic và betacyanin đơn giản thường gặp

(Nguyễn Thị Mỹ Nương, 2012)

‒ Đa số các betacyanin khác được tạo thành do phản ứng glucosyl hóa một trong hai nhóm chức – OH tự do của vòng cyclo-DOPA của betanidin, trong đó thường gặp

3.2 Hàm Lượng Anthocyanin

Dựa vào bước sóng hấp thụ cực đại của Anthocyanin và sự thay đổi cấu trúc phân tử theo pH Với pH=1 các Anthocyanin tồn tại dạng muối oxonium hoặc flavium, khi pH = 4.5 chất này tồn tại dạng carbinol Thông qua mật độ quang tại pH =1 và pH= 4.5 của Anthocyanin tại các bước sóng cực đại và 700 nm ta xác định được nồng

độ Anthocyanin của mẫu Hàm lượng anthocyanin được xác định bởi chỉ số hấp thụ và

độ ẩm của mẫu

3.3 Nhận Biết Hàn The

Màu sắc của Anthocyanin thay đổi theo pH của dung dịch, qua đó ta có thể sử dụng tính chất này để làm thuốc thử đối chứng cho các dung dịch có pH tương tự nhưng có chứa một số chất cần nhận biết Natriborat trong hàn the sẽ đóng vài trò chất cần nhận biết trong các dung dịch có pH lần lượt từ 1 đến 8 và sau đó sẽ so sánh với các mẫu không để kiểm tra sự biến đổi màu sắc đặc hiệu Phản ứng thành công sẽ chỉ

ra được màu sắc đặc trưng nhận biết natriborat

3.4 Tính Chống Oxy Hóa

3.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa của Anthocyanin

Sự thiếu electron tự nhiên của các phân tử Anthocyanin giúp cho các hợp chất này đặc biệt hoạt động Một số cơ chế chống oxy hóa của Anthocyanin có được từ các nghiên cứu như sau:

 Ngăn chặn các gốc hoạt động bằng cách cho hydro

 Chelate các ion kim loại xúc tác cho các phản ứng oxy hóa

 Liên kết với các protein, tạo phức chất bền

Phản ứng thế vào 2 nhóm hydroxy nằm ở vị trí ortho trong vòng B của Anthocyanin và cyanidin đóng vai trò quan trọng giúp ổn định các gốc tự do Ngoài

ra, nhóm ortho- dihydroxy này còn có khả năng chelate các ion kim loại và từ đó ngăn chặn sự peroxy hóa lipid (Tuyền et al., 2011)

Tsuda et al đã tìm cách giải thích cơ chế chống oxy hóa của Cyanidin-3- glucoside (C3G) bằng cách cho phản ứng với gốc alkylperoxyl Dựa trên sản phẩm của phản ứng, các tác giả cho rằng C3G chống oxy hóa theo cơ chế khác với alpha-tocopherol và giả thuyết rằng C3G phá vỡ cấu trúc và quét các gốc tư do

Các hợp chất flavanoid nói chung trong đó có Anthocyanin chống oxy hóa bằng cách quét các gốc O2 tự do, hay phản ứng với các gốc peroxy tham gia vào phản ứng oxy hóa dây chuyền Nhờ vào khả năng cho các gốc tự do H+, các hợp chất này có thể ức chế được phản ứng peroxy hóa lipid (Tuyền et al., 2011)

hydro Phương pháp này đã được giới thiệu gần 60 năm trước bởi Marsden Blois, Đại học Stanford Đã có nhiều kết quả thí nghiệm chứng minh rằng phương pháp Blois phù

hợp cho việc khảo sát khả năng chống oxy hóa như nghiên cứu của Kim et al.,(2002); Zhu et al.,(2002); Nurliyana et al.,(2010); Prakash et al.,(2000); Mensor et al.,(2001)

DPPH là phân tử dạng bột có màu đen đặc trưng, có chứa gốc tự do ổn định, có màu tím đặc trưng khi hòa tan trong dung môi

Nguyên tắc của việc giảm các gốc tự do trong phương pháp DPPH là do chất chống oxy hóa phản ứng với các gốc tự do ổn định trong DPPH chuyển đổi thành DPPH-H (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazine) Trong phương pháp DPPH, các chất chống oxy hóa có thể cho đi một hydro để làm giảm các gốc tự do ổn định trong DPPH Khi các chất chống oxy hóa làm sạch các gốc tự do thì màu tím đặc trưng của DPPH sẽ nhạt dần và xuất hiện màu vàng của DPPH-H Sự biến đổi màu này tương

ứng với lượng electron kết hợp với DPPH (Ko et al., 1998; Hu and Kitts, 2000; Prakash et al., 2000; Mensor et al., 2001; Deshmukh, 2009)

Thời gian phản ứng được đề xuất đầu tiên là 30 phút (Blois,1958) và đã được tiến

hành trong các nghiên cứu khác (Kim et al.,2002) Khoảng thời gian phản ứng ngắn hơn cũng từng được đề xuất: 5 phút (Lebeau et al.,2000), 10 phút (Schwarz et

al.,2001) Tuy nhiên , thời gian phản ứng tùy thuộc vào chất chống oxy hóa vì mỗi cơ

chất có khả năng và tốc độ làm sạch DPPH khác nhau (Brand et al.,1995; Bondet et

al.,1997) Do đó, thời gian phản ứng tốt nhất là khi cơ chất đã là sạch tối đa gốc tự do

trong DPPH (Lu et al.,2000; Sanchez et al.,1999; Yepez et al.,2002)

Có nhiều bước sóng hấp thụ được đưa ra: 515nm, 516nm, 518nm, và 520nm (Nguyễn Thanh Diễm, 2012) Tuy nhiên bước sóng hấp thụ tối đa trong hầu hết các cơ

chất được các nhà khoa học chấp nhận là 517nm (Blois,1958; Zhu et al.,2002)

CHƯƠNG III.PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ tháng 06/2014 đến tháng 12/2014

Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát

triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ

II Phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Cây mồng tơi tím thu hoạch từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ và các tỉnh lân cận như Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long

2.1.2 Dụng Cụ

Bình hút, chân không bình tam giác 250ml, bình tia, bông gòn, ca nhựa có chia vạch thể tích, chai nắp xanh (500ml, 1000ml), chày, cối sứ, cốc thủy tinh (250 ml, 100ml, 50ml), cuvette, đầu cone, đèn cồn, giấy lọc, micropippet các loại (10-100l, 100-1000l), ống đong, ống nghiệm thủy tinh, ống nhựa