khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá cây lá dứa (pandanus amaryllifolius. roxb)

GIỚI THIỆU Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự phá vỡ cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do reactive oxygen species - ROS và hoạt động của các chất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA

CỦA CAO CHIẾT LÁ CÂY LÁ DỨA

(Pandanus amaryllifolius Roxb)

SINH HỌC K.35

Cần Thơ, 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Cô Ts Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu, chỉnh sửa luận văn, góp ý cách xử lý các số liệu, quan tâm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luân văn này

Hai bạn Hồ Ngọc Phụng và Nguyễn Phạm Phương Thảo sinh viên lớp cử nhân Sinh học K35 – trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Quý Thầy, Cô Bộ môn Sinh, Bộ môn Hóa – Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luân văn này

Tập thể các bạn lớp cử nhân Sinh học K35 (2009- 2013) đã chia sẻ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Quý Thầy, Cô Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển ông Nghệ Sinh Học, Ban giám hiệu trường Đai Học Cần Thơ đã giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc, chân thành đến gia đình, người thân và những người bạn đã luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập

Cần Thơ, ngày 12 tháng 12 năm 2012

Nguyễn Tường Quyên

LỜI BẢN QUYỀN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được cá nhân hay tổ chức nào công bố trong bất kì công trình nào trước đây Nếu cá nhân hay tổ chức nào muốn sử dụng tài liệu trong luận văn phải được sự đồng ý của tác giả hoặc giáo viên hướng dẫn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI BẢN QUYỀN ii

MỤC LỤC HÌNH v

MỤC LỤC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

TÓM TẮT viii

PHẦN 1 GIỚI THIỆU 1

PHẦN 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về chất chống oxy hóa 3

2.1.1 Stress oxy hóa 3

2.1.2 Khái niệm về chất chống oxy hóa 4

2.2 Đại cương về cây Lá Dứa 7

2.2.1 Khóa phân loại 7

2.2.2 Mô tả cây 7

2.2.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái của cây 8

2.3 Các nghiên cứu về cây Lá Dứa 8

2.4 Đại cương về những bệnh liên quan đến stress oxy hóa 10

2.4.1 Bệnh tiểu đường 10

2.4.1.1 Phân loại bệnh tiểu đường 10

2.4.1.2 Biến chứng bệnh tiểu đường 10

2.4.1.3 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tiểu đường .11

2.3.2 Bệnh tăng huyết áp 11

2.3.2.1 Bệnh cao huyết áp 11

2.3.2.2 Biến chứng của bệnh tăng huyết áp 12

2.3.2.3 Mối liên hệ giứa stress oxy hóa và bệnh tăng huyết áp 12

PHẦN 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Phương tiện nghiên cứu 14

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 14

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 14

3.1.3 Hóa chất và vật liệu 14

3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây Lá Dứa in vitro 15

3.2.1.1 Phương pháp trích cao cây Lá Dứa bằng dung môi ethanol 15

3.2.1.2 Khảo sát sự chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS) assay) in vitro của các cao chiết cây Lá Dứa 16

3.2.2 Thống kê phân tích số liệu 17

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Xác định độ ẩm của mẫu cây 18

4.2 Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao ethanol 18

4.3 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các cao chiết cây Lá Dứa in vitro 19

4.3.1 Khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS) assay) in vitro 19

4.3.2 Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết petroleum ether lá 21

4.3.3 Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết ethyl acetate lá 22

4.3.4 Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết n-butanol lá 22

4.3.5 Đánh giá hàm lượng chất chống oxy hóa có trong cao petroleum ether, ethyl acetate và n-butanol 23

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27

5.1 Kết luận 27

5.2 Đề nghị 27

MỤC LỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây Lá Dứa 7 Hình 3.1 Quy trình chiết các cao thô 17 Hình 4.1 Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số

in vitro của Trolox 20

Hình 4.2 Phần trăm lượng ROS còn lại sau phản ứng với chất chống oxy

hóa có trong các cao chiết lá cây Lá Dứa 25

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotic phosphate oxidase NOx: Nitơ oxidase

SOD: Superoxide dismutase

XO: Xanthine oxidase

CAT: Catalase

GPX: Glutathione peroxidase

AVEs: Advanced Glycation End product

PKC: Protein kinase C

AR: Aldose reductase

EDTA: Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate

HA: Huyết áp

OD: Mật độ quang phổ

ROS: Reactive Oxygen Species

TAS: Total Antioxidant Status

TBA: Acid thiobarbituric

TBA-RS: Thiobarbituric acid reactive substances

Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid

TÓM TẮT

Stress oxy hóa là nguyên nhân và tham gia vào sự phát triển của nhiều bệnh nguy hiểm như tiểu đường, tăng huyết áp, ung thư, lão hóa Các dược liệu dân gian được nghiên cứu khả năng chống oxy hóa để tìm ra một phương pháp chữa bệnh an toàn, hiệu quả và chi phí thấp Đề tài “ Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá cây Lá Dứa (Pandanus amaryllifolius Roxb)” được thực hiện nhằn đánh giá khả năng chống oxy hóa của cây Lá Dứa Khảo sát khả năng chống oxy hóa được thực hiện bằng phương pháp TAS (Total Antioxidant Status) Cao petroleum ether lá , cao etyl acetate lá và cao n-butanol lá được tách từ cao ethanol lá Sự làm sach gốc tự do của các cao chiết được khảo sát ở các nồng độ 2 mg/ml; 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25

mg/ml; 0,125 mg/ml; 0 mg/ml và kết quả thu được sau khi đo ở bước sóng 532 nm Kết quả nghiên cứu cho thấy cao petroleum ether, cao etyl acetate và cao n-butanol đều có khả năng chống oxy hóa cao hơn cao ethanol Khả năng chống oxy hóa của

ba loại cao lá giảm dần theo thứ tự cao n-butanol – cao petroleum ether – cao etyl acetate

Từ khóa: Tiểu đường, tăng huyết áp, ung thư, lão hóa, cây Lá Dứa, cao chiết, chống oxy hóa, TAS, cao petroleum ether, cao etyl acetate, n-butanol

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự phá vỡ cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do (reactive oxygen species - ROS) và hoạt động của các chất chống oxy hóa (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009) Theo nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy stress oxy hóa ở người tham gia vào sự phát triển của nhiều bệnh hoặc có thể làm trầm trọng thêm các triệu chứng của bệnh

(Peter et al, 1989) Những bệnh bao gồm ung thư, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer,

xơ vữa động mạch, suy tim, cơ tim nhồi máu có nguyên nhân là stress oxy hóa

(Halliwell et al, 2007; Singh, 1995) Tuy nhiên, các gốc tự do có thể có lợi, vì chúng

được sử dụng bởi miễn dịch hệ thống như là một cách để tấn công và tiêu diệt mầm

bệnh (Kennedy et al, 2005) Vì vậy tìm hiểu về tác động của chất oxy hóa đến sức

khỏe của con người đang được quan tâm nghiên cứu

Chất chống oxy hóa là một phân tử ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử khác Quá trình oxy hóa là một phản ứng hóa học chuyển electron hoặc hydro từ một chất một chất oxy hóa Phản ứng oxy hóa có thể sản xuất các gốc tự do Chất chống oxy hóa chấm dứt các phản ứng dây chuyền bằng cách loại bỏ trung gian gốc

tự do và ức chế các phản ứng oxy hóa khác (Sies et al, 1997) Chất chống oxy hóa tự nhiên hiện diện trong thực vật có khả năng làm sạch các gốc tự do có hại cho cơ thể

(Pal et al., 2011) Các hợp chất chống oxy hóa như axit phenolic, polyphenol và

flavonoid có khả năng làm sạch các gốc tự do như peroxide, hydroperoxide hoặc

lipid peroxyl và do đó ức chế cơ chế oxy hóa (Prakash et al., 2000) Theo các nghiên

cứu cho thấy tăng cường khả năng chống oxy hóa tự nhiên trong cơ thể hay bổ sung chất chống oxy hóa qua chế độ ăn uống có thể làm giảm nguy cơ của các bệnh mãn

tính và ngăn chặn tiến triển của bệnh (Pal et al., 2011) Hợp chất phenol và

polyphenol có nguồn gốc thực vật, chẳng hạn như flavonoid đã được chứng minh làm sạch các gốc oxy hóa Tuy nhiên, hàm lượng các hợp chất polyphenol trong rễ

và vỏ của hệ thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới chưa được nghiên cứu nhiều (Pal et

al., 2011)

Ở nước ta, cây Lá Dứa là một loại cây được trồng hoặc mọc hoang dại có sinh khối rất lớn Tuy nhiên, cây Lá Dứa chỉ được ứng dụng chủ yếu trong lĩnh vực thực phẩm như tạo hương, tạo màu … Ngoài ra, trong dân gian còn dùng lá dứa nấu nước uống như một vị thuốc nam để chữa trị các bệnh như lợi tiểu, hạ đường huyết… Tuy nhiên chưa có bằng chứng khoa học nào chứng minh những tác dụng chữa bệnh của cây Lá Dứa Do đó, đề tài được thực hiện nhằm khai thác tiềm năng chữa bệnh của cây Lá Dứa và quan trọng hơn góp phần tìm ra cách thức ức chế nguyên nhân của một số bệnh như tiểu đường, tim mạch … những bệnh đang phát triển với tốc độ cao trong xã hội hiện đại

Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây Lá

Dứa Khả năng chống oxy hóa của cao chiết Lá Dứa được đánh giá in vitro bằng

phương pháp TAS (Total Antioxidant Status)

Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm

- Trích các chất bằng dung môi ethanol 99% từ cây Lá Dứa

- Tách cao petroleum ether, ethyl acetate và n-butanol từ cao ethanol

- Sử dụng phương pháp TAS để xác định khả năng chống oxy hóa của cây Lá

Dứa in vitro

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về chất chống oxy hóa

2.1.1 Stress oxy hóa

Stress oxy hóa được định nghĩa là sự phá vỡ cân bằng giữa quá trình oxy hóa

và quá trình khử trong cơ thể sống (Ziyatdinova et al., 2006)

Quá trình trao đổi chất và stress oxy hóa tạo ra một số sản phẩm trung gian là các gốc tự do (ROS: Reactive oxygen species) Bên cạnh sự cần thiết cho cơ thể con người, ROS cũng tham gia vào quá trình lão hóa và sự phát triển của nhiều bệnh thoái hóa, bao gồm bệnh Alzheimer và Parkinson Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng stress oxy hóa là nguyên nhân chính của tăng đường huyết gây ra sự tạo thành các gốc tự do đóng góp vào sự phát triển và tiến trình của bệnh tiểu đường và những biến chứng phức tạp Sự hoạt động của ROS gây rối loạn chức năng nội mô dẫn đến phát triển bệnh tim mạch (Tripathi and Chandra, 2009) ROS gây nguy hiểm cho cấu trúc tế bào và phân tử chức năng (như là ADN, protein và lipid) khi các tác nhân oxy hóa hoặc các gốc tự do hoạt động mạnh (Ganske and Dell, 2006)

Các gốc tự do là các phân tử có một điện tử riêng lẻ ở lớp ngoài cùng (Riley, 1994) Cấu hình này không ổn định và luôn có xu hướng lấy điện tích của các phân

tử liền kề như protein, chất béo, carbohydrate và acid nucleic Trong hệ thống sinh học, các gốc tự do có nguồn gốc từ nitơ, oxy và các phân tử lưu huỳnh Những gốc

tự do trong nhóm này được gọi là dạng oxy phản ứng (ROS: Reactive oxygen species), dạng nitơ phản ứng (RNS: Reactive nitrogen species) và dạng lưu huỳnh phản ứng (RSS: Reactive sulfua species)

ROS bao gồm các gốc tự do như superoxide (O2), hydroxyl (-OH), nitric oxide (NO) và các loại khác như hydrogen peroxide (H2O2), acid hypochlorous (HOCl) và peroxyl nitrite (ONOO)

RNS được bắt nguồn từ NO thông qua các phản ứng với O2 để hình thành ONOO RSS có thể dễ dàng hình thành từ các phản ứng của ROS

Phần lớn các gốc tự do hoạt động mạnh và gây nhiều tổn hại cho cơ thể nhất

là ROS Oxy là nguyên tố không thể thiếu để đảm bảo sự sống, mọi tế bào đều cần oxy để chuyển hóa chất dinh dưỡng thành năng lượng Oxy mà con người hít thở hằng ngày là chất cần thiết nhưng chính nó cũng là trở thành gốc tự do ROS luôn được sinh ra trong cơ thể và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể ROS có vai trò trong biểu hiện gen và vận chuyển ion Tuy vậy, gốc tự do cũng ảnh hưởng xấu đến

cơ thể khi số lượng tăng lên quá nhiều

Chúng ta có thể thấy rõ tác hại này qua sự gỉ sét hay còn gọi là sự oxy hóa Những quá trình tương tự như vậy cũng đang xảy ra trong co thể, nó luôn tạo ra gốc

tự do Hiện tượng thực bào là hiện tượng vi khuẩn, virus bị tế bào bạch cầu trong cơ thể tiêu diệt hay là hiện tượng hô hấp trong tế bào hoặc hiện tượng giải độc ở gan đều là các hoạt động sinh ra gốc tự do Các loại phản ứng oxy hóa như superoxide (O2), hydroxyl radical (HO) Các gốc tự do được hình thành bởi quá trình giảm electron của phân tử oxy

ROS có thể được phát sinh trong quá trình chiếu xạ ánh sáng tia cực tím, tia

X và tia gamma, trong các phản ứng xúc tác kim loại, các chất ô nhiễm trong không khí, được sản xuất bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào trong quá trình viêm nhiễm và là sản phẩm của ty thể xúc tác phản ứng vận chuyển điện tử, là sản phẩm của những căng thẳng mệt mỏi, thuốc lá, dược phẩm, những thói quen ăn uống không khoa học , thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine (Candenas, 1989; Halliwell, 1991; Armstrong, 2002 )

Trong cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn, không đủ để gây hại

Vì bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hóa vô hiệu hóa các gốc tự do có hại

2.1.2 Khái niệm về chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể

(Jovanovic and Simic, 2000; Lachman et al, 2000; Singh and Rajini, 2004) Dựa

trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại là các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với gốc tự do, do đó nó kìm hãm pha khởi phát hoặc

bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe) (Singh and Rajini, 2004; Rolland, 2004)

Các chất chống oxy hóa hoạt động theo các phương thức sau:

- Các chất này trực tiếp trung hòa các gốc tự do bằng cách cho đi điện tử (e)

để kết hợp với điện tử lẻ của các gốc tự do

- Làm giảm nồng độ peroxide và sửa chữa các màng bị oxy hóa

- Tác động đến hệ thống chống oxy hóa nội sinh để làm tăng hoạt động chống oxy hóa của cơ thể

Ở mức độ tế bào, chất chống oxy hóa có thể làm giảm gốc tự do bằng cách làm giảm hoạt động của các enzyme tạo ra gốc tự do như nicotinamide adenine dinucleotic phosphate oxidase, nitơ oxidase và xanthine oxidase hoặc bằng cách tăng cường các hoạt động và biểu hiện của các enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase, catalase và glutathione peroxidase Tế bào đông vật có chứa enzyme SOD có thể chuyển đổi O2 thành H2O2 và O2 Tiếp theo đó H2O2 được enzyme catalase chuyển đổi thành H2O2 và O2 Các chất chống oxy hóa có thể phản ứng trực tiếp với các gốc tự do và phá hủy chúng, sau đó các chất chống oxy hóa sẽ trở thành các gốc tự do mới nhưng hoạt động ít hơn và ít nguy hiểm hơn so với các gốc tự do mà nó đã vô hiệu hóa (Berger, 2005)

Chất chống oxy hóa hiệu quả nhất trong cơ thể là các enzyme như:

glutathione peroxidase, catalase và superoxide dismutase (Mates et al., 1999)

Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người có nguồn gốc từ bên ngoài (chất chống oxy hóa ngoại sinh) và bên trong (chất chống oxy hóa nội sinh) Các chất chống oxy hóa nội sinh bao gồm các protein (ferritine, tranaferrine, albumine)

và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde diamutase, glutathion peroxydase) Các

chất chống oxy hóa ngoại sinh là các phân tử nhỏ được đưa vào cơ thể, bao gồm

vitamin E, Vitamin C, các carotenoid và các hợp chất phenolic (Niki et al., 1995; Pincemail et al., 1998; Lachman et al., 2000; Vanaant et al., 2004)

Hợp chất chống oxy hóa trong thực phẩm đóng vai trò quan trọng như một yếu tố bảo vệ sức khỏe Bằng chứng khoa học cho thấy chất chống oxy hóa làm

giảm nguy cơ các bệnh mãn tính như ung thư và bệnh tim (Prakash et al, 2000; Deshmukh, 2009), viêm và lão hóa (Uttara et al, 2009) Nguồn chính của chất chống

oxy hóa tự nhiên là ngũ cốc, trái cây và rau quả Thực phẩm chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật như vitamin C, vitamin E, caroten, axit phenolic, phytate và estrogen thực vật đã được chứng minh có khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh

(Prakash et al., 2000)

Đặc điểm chính của chất chống oxy hóa là khả năng phục hồi các gốc tự do

Có một số nghiên cứu cho thấy rằng các chất chống oxy hóa trong trái cây, chè, rau quả và rượu vang làm giảm tỉ lệ mắc các bệnh mãn tính như bệnh tim và một số

bệnh ung thư (Prakash et al, 2000) Thực vật là nguồn chống oxy hóa tiềm năng của

tự nhiên Thực vật có thể chống lại ROS nhờ tạo thành các hợp chất chống oxy hóa Như vậy, chất chống oxy hóa không chỉ bảo vệ thực phẩm mà còn bảo vệ các tế bào

chống lại thiệt hại do oxy hóa (Zin et al., 2002)

Ngày nay các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên được quan tâm sử dụng rộng rãi trên thế giới vì tính hiệu quả, an toàn và ít bị ô nhiễm hơn các sản phẩm nhân tạo

Vì vậy, việc điều tra và xác định các chất chống oxy hóa tự nhiên từ thực vật là quan

trọng và cần thiết (Zin et al., 2002)

2.2 Đại cương về cây Lá Dứa

2.2.1 Khóa phân loại

Giới: Plantae

Bộ: Pandanales Họ: Pandanaceae Giống: Pandanus Loài: P amaryllifolius

Cây Lá Dứa thuộc cây thân bụi, có đời sống lâu năm Đường kính thân cây

1-3 cm, cây cao đến 1 m, thân rộng, thân cây có màu xanh đậm chia ra nhiều nhánh

Lá có dạng lá đơn, láng, mọc thành cụm hình hoa thị Lá dài và có hình dạng giống mũi mác mép lá không có gai, mặt dưới lá có màu nhạt Lá dứa có mùi thơm dịu, không có lông, lá xếp theo hình máng xối, dài khoảng 40-50 cm, rộng 3-4 cm, lá có nhiều gân cách nhau 1 mm, không thấy có hoa Lá dứa có mùi thơm như mùi cơm

nếp mà các loài Pandanus khác không có

2.2.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái của cây

Cây Lá Dứa được phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các châu lục Cây thường được trồng và sử dụng như một loại cây gia vị được dùng trong ẩm thực vì nó có mùi thơm và màu xanh đặc trưng

Ở Việt Nam, cây Lá Dứa được trồng và mọc hoang phổ biến Trên thế giới cây Lá Dứa được trồng nhiều ở miền nhiệt đới Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Philippines (Phạm Hoàng Hộ, 2003)

2.4 Các nghiên cứu về cây Lá Dứa

Hiện nay trong công nghiệp thực phẩm lá dứa thơm được dùng để tạo mùi thơm cho gạo, tạo hương thơm nếp cho các loại bánh kẹo và các loại nước uống giải

khát (Buttery et al., 1983) Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hàm

lượng acid amin có trong lá dứa như 2-acetyl-1-pyrrolin gồm có proline và ornithine

được sử dụng trong thực phẩm để làm các loại bánh (Weenen et al., 1997)

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trên rễ cây Lá Dứa (Heimsch et al.,

2008) Những nghiên cứu đã chứng minh rằng gốc rễ và thân rễ của cây Lá Dứa có

hiệu quả trong điều trị bệnh tiểu đường trên chuột (Phongboonrod et al., 1976)

Theo sách y học của Philippine, rễ cây Lá Dứa được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường (Michael, 1980)

Một số nghiên cứu đã chứng minh được hợp chất 4-hydroxybenzoic acid có

tác dụng làm hạ đường huyết trên chuột (Peungvicha et al., 1998) Hợp chất này chủ

yếu tập trung ở rễ cây Lá Dứa

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khảo sát các thành phần hóa học khác có trong lá dứa như hợp chất alkaloids, thành phần có trong hợp chất này là pandamarilactonine-A, pandanmarilactone-1, pandanamine, pandamarilactonine-

B,norpandamarilactonine A và norpandamarilactonine-B (Takayama et al., 2001)

Từ rễ của cây Lá Dứa hợp chất alkaloids mới tiếp tục nghiên cứu và đặt tên

pandamarilactonine-H (Mario et al., 2010) Nhiều hợp chất khác có trong lá dứa được nghiên cứu như 2-acetyl-1-pyrroline (Buttery et al., 1983; Kantilal et al.,

2009), phenol, sterol và terpenoit (Mohsin et al., 2008), palmitic acid, linoleic acid, steric acid (Chong et al., 2010)

Rễ cây Lá Dứa chứa các hợp chất phân cực, tan đều trong nước có khả năng làm giảm đường huyết Cơ chế hoạt động tương tự insulin hoặc thông qua sự tiết

insulin từ tuyến tụy (Peungvicha et al., 1996; Limviwakill et al., 2001)

Dịch chiết lá dứa có khả năng ức chế khối u (Meyer et al., 1982) Theo y học

hiện đại lá dứa có phytosterol tác dụng làm giảm hiệu ứng và giảm bệnh tim mạch

vành (Ling et al., 1995; Tapiero et al., 2003) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng

phytosterol có thể có khả năng chống lại hoạt động của khối u, sterol thực vật có khả

năng chống lại tế bào ung thư, đặc biệt đối với các tế bào ung thư vú (Awad et al.,

2000)

Theo nghiên cứu của Yan et al (2010) khảo sát hoạt động chống oxy hóa trên

phản ứng DPPH của lá dứa tươi và bột lá dứa, cho thấy lá dứa có khả năng chống oxy hóa

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu hiện nay khảo sát được từ cây Lá Dứa tìm ra

nhiều hợp chất mới, an toàn hơn để kháng khuẩn (Kaiser et al., 2011)

Theo các tác giả Đào Hùng Cường và Nguyễn Thị Thanh Tú (2010) đã khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây Lá Dứa Thành phần dễ bay hơi một số chất gây mùi chính của cây là 2-acetyl-1-pyrrolin (17,7%), Limone (5,5%); 3-methyl-2(5H)furanone (4,83%); 2,4,4 trimethylbut-2-enolide (1,28%) có mùi thơm giống như gạo nếp

Trong dịch chiết có một số chất gây mùi thơm có nhiệt độ sôi trên 100C nằm trong dịch chiết đó là các ester và aldehyl như 9-octadecen-12-noic acid, methyl, bicyclo 3.3.1 nonan-2-one và 9-isopropylidene Ngoài ra, nghiên cứu còn phân lập được một chất thuộc họ alkaloid có tên gọi là Padamarilactonine-A

Trong rễ và lá cây Lá Dứa có chứa chất chống oxy hóa (Nguyễn Tường Quyên và Nguyễn Phạm Phương Thảo, 2012)

2.5 Đại cương về những bệnh liên quan đến stress oxy hóa

2.5.1 Bệnh tiểu đường

2.5.1.1 Phân loại bệnh Tiểu Đường

Bệnh tiểu đường thường được chia làm hai loại là bệnh tiểu đường tuýp 1 và bệnh tiểu đường tuýp 2

Bệnh Tiểu Đường tuýp 1 chủ yếu do sự tiêu hủy để tự miễn dịch qua trung gian của các tế bào β tại các tiểu đảo ở tuyến tụy (đảo tụy), dẫn đến tình trạng thiếu

insulin tuyệt đối (Zimmet et al., 2001) Những người bị tiểu đường tuýp 1 phải sử

dụng insulin ngoại sinh để ngăn chặn sự phát triển của các thể keto (ketoacidosis) (Zimmet., 2001) Bệnh tiểu đường tuýp 1 chiếm tỉ lệ khoảng 5- 10% trong tổng số người mắc bệnh tiểu đường Bệnh tiểu đường tuýp 1 thường được phát hiện trước 40 tuổi Đa số các trường hợp được chẩn đoán bệnh tiểu đường tuýp 1 thường là người

có thể trạng gầy Người bị bệnh tiểu đường sẽ có đời sống phụ thuộc insulin hoàn toàn (Nguyễn Thị Bay, 2007)

Bệnh tiểu đường tuýp 2 được đặc trưng bởi sự kháng insulin (Zimmet et al.,

2001) nghĩa là đối với tiểu đường tuýp 2 insulin vẫn tiết bình thường nhưng cơ thể không sử dụng được Những người bị bệnh tiểu đường không phụ thuộc vào insulin

ngoại sinh (Zimmet et al., 2001) Phần lớn người bị bệnh tiểu đường thuộc tuýp 2 chiếm khoảng 90% trong tổng số người mắc bệnh (Zimmet et al., 2001) và thường

được phát hiện sau 40 tuổi

2.5.1.2 Biến chứng bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường thường có những biến chứng sau: biến chứng tim, hoại tử do bệnh tiểu đường, hôn mê, biến chứng thần kinh, biến chứng mắt, biến chứng thận, biến chứng răng, biến chứng ngoài da…

2.5.1.3 Mối liên quan của stress oxy hóa và bệnh tiểu đường

Stress oxy hóa được xem là nguyên nhân chính của bệnh tiểu đường Tăng đường huyết có thể gây ra stress oxy hóa thông qua hình thành AVEs (Advanced Glycation End product- AGEs), gia tăng sự hoạt hóa protein kinase C (PKC) và gia tăng sự vận chuyển các dẫn xuất axit amin của đường hexose (Tripathi and Chandra,

2009)

Khi đường huyết tăng các gốc superoxide trong chuỗi dẫn truyền điện tử ở ty thể tăng là nguyên nhân gây ra stress oxy hóa Sự hình thành superoxide và tiếp theo

là sự gia tăng stress oxy hóa có thể dẫn đến rối loạn chức năng nội mạc và cuối cùng

là các bệnh tim mạch thông qua một số cơ chế khác nhau (Tripathi and Chandra, 2009) Bệnh tiểu đường làm thay đổi hoạt động của các enzyme có vai trò trong sự chống oxy hóa và làm giảm lượng Gutathion (Gutathion được biết có khả năng chống lại stress oxy hóa)

AGEs có thể sản sinh ra ROS, gắn vào thụ thể thúc đẩy stress oxy hóa và kích hoạt các cơ chế sản sinh ra chất oxy hóa trong nội bào Sự gia tăng vận chuyển đường đa trong sự tăng đường huyết là do tăng hoạt động của enzyme phân giải đường aldose (Aldose reductase- AR) trong mô tim AR được chứng minh gia tăng chuyển hóa Glutathione do đó làm giảm Glutathione và tiếp đó là gia tăng stress oxy hóa (Tripathi and Chandra, 2009)

Sự hoạt động của ROS dẫn đến rối loạn chức năng nội mô , một tiền chất để phát triển các bệnh tim mạch Vì vậy kiểm soát hoạt động của ROS được xem là cách tiếp cận hợp lí để chống lại các biến chứng mạch máu phức tạp của bệnh tiểu đường

2.5.2 Bệnh tăng huyết áp

2.5.2.1 Bệnh cao huyết áp

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh do tăng huyết áp là nguyên nhân gây tử vong cao nhất trên thế giới (WHO, 2002) Tăng huyết áp hoặc huyết áp cao ảnh

hưởng đến ít nhất một tỷ người trên toàn thế giới (Kearney et al., 2005) Cao huyết

áp là một rối loạn phổ biến ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của cộng đồng.Bệnh cao huyết áp thường không có triệu chứng và được phát hiện khi kiểm tra sức khỏe định

kì hoặc sau khi xảy ra các biến chứng như một cơn đau tim hoặc đột quỵ (Lip, 2003) Hơn 95% bệnh nhân tăng huyết áp có nguyên nhân thiết yếu hoặc vô căn và chỉ có một tỷ lệ nhỏ có một nguyên nhân nhận dạng (tăng huyết áp thứ cấp)

Theo lời khuyên của các chuyên gia của Mỹ và Châu Âu, huyết áp vượt trên

mức huyết áp tối ưu dù nhỏ thì cũng làm gia tăng biến cố tim mạch (Chobanian et

al, 2003; Mancia et al., 2007) Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tác hại của tăng

huyết áp trên các hệ thống tim mạch, thận, não Cao huyết áp là yếu tố nguy cơ chính gây bệnh tim và đột quỵ và nguy cơ tim mạch tăng gấp đôi với mỗi độ tăng

huyết áp 20/10mmHg HA tâm thu và tâm trương (Lewington et al, 2002)

2.5.2.2 Biến chứng của bệnh tăng huyết áp

Bệnh cao huyết áp thường dẫn đến các biến chứng về tim mạch như cơ tim phì đại, tai biến mạch máu não, nhũn não, thiếu máu não, hẹp động mạch Ngoài ra còn dẫn đến biến chứng về thận như hư màng lọc của các tế bào thận, hẹp động mạch thận, suy thận…

2.5.2.3 Mối liên quan của stress oxy hóa và bệnh tăng huyết áp

Nghiên cứu cho thấy, stress oxy hóa là nguyên nhân của bệnh tăng huyết

áp, một yếu tố nguy cơ chính cho tỷ lệ tử vong bệnh tim mạch (Rodrigo et al.,

2007) ROS có ảnh hưởng đến mạch máu và sự phát triển của tăng huyết áp (Lassègue, Griendling, 2004; Touyz, Schiffrin, 2004)

Stress oxy hoá có thể làm rối loạn chức năng nội mô và là hậu quả của tăng

huyết áp (John, Schmieder, 2003) Nghiên cứu cho thấy, ROS làm tăng huyết áp và

hình thành superoxide trong mạch máu được cải thiện nhờ chất chống oxy hóa ngoại

sinh được nghiên cứu trên mô hình động vật (Chen et al., 2001; Hoagland et al., 2003) và tăng huyết áp trên người (Duffy et al, 2001; Boshtam M et al., 2002) Một

số nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa và ROS là nguồn gốc của tăng huyết

áp.Nghiên cứu cho thấy tăng huyết áp thúc đẩy sản xuất của ROS trong não, thận, mạch máu (Harrison, 2009)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm thực hiện :

Phòng Thí Nghiệm Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên

Phòng Sinh Học Phân tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển CNSH

Thời gian thực hiện: từ tháng 8/2012 đến tháng 12/2012

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị

Sử dụng máy móc và thiết bị liên quan đến nghiên cứu hiện có tại Bộ môn Sinh học và Hóa học – Khoa Khoa học tự nhiên và Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ

Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm máy cô quay chân không Heidolph (Đức), máy ly tâm lạnh Mikro 220R (Đức), máy đo pH Metler Toledo, máy ủ, máy đo quang phổ, máy khuấy từ, máy vortex, cân phân tích AB104 (Switzerland), bình lắng (Trung Quốc) Một số dụng cụ hỗ trợ trong các thí nghiệm như eppendorf, pipette, đầu côn, kim mũi giáo, cân điện tử, ống đong, bình tam giác, găng tay, giấy bạc và tủ sấy

Vật liệu thí nghiệm là 3 kg lá của cây Lá Dứa được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây

Lá Dứa in vitro

3.2.1.1 Phương pháp trích cao cây Lá Dứa bằng dung môi ethanol

Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm lá của cây Lá Dứa

(Pandanus amaryllifolius Roxb) được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long Mẫu sau khi thu

dựa vào các đặc điểm hình thái của thực vật như rễ, lá,… và tham khảo tài liệu từ bộ sách cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (2003) để định danh Mẫu lá của cây Lá Dứa, chỉ lấy những lá màu xanh bóng, không sử dụng những lá quá non hay quá già

Mẫu được rửa sạch bằng nước với trọng lượng mẫu tươi là 3 kg Mẫu cây được cắt nhỏ, phơi khô cho đến khi trọng lượng không đổi và cân lại lần nữa để xác định trọng lượng mẫu khô Độ ẩm của nguyên liệu là sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô và được tính theo công thức sau:

Mẫu sau khi phơi cho vào túi nylon sạch, ghi nhãn, bảo quản ở nhiệt độ phòng để sử dụng cho nghiên cứu

Lá của cây Lá Dứa khô (250g) được ngâm trong dung môi ethanol 99% trong

7 ngày ở nhiệt độ phòng Sau 7 ngày phần nước ngâm mẫu được lọc và cô cạn bằng

hệ thống máy cô quay để loại bỏ dung môi ethanol

Quy trình chiết cao được trình bày như trong Hình 3.1

Trọng lượng tươi – Trọng lượng khô

Trọng lượng tươi

100 %



3.2.1.2 Khảo sát sự chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS)

assay) in vitro của các cao chiết cây Lá Dứa

TAS được xác định theo phương pháp của Koracevic et al., (2000) có hiệu

chỉnh như sau: 10µL cao ethanol rễ cây Lá dứa được pha loãng trong 490 µL dung dịch đệm phosphate natri 100 mM pH 7,4 được cho vào hỗn hợp gồm 0,5 mL dung dịch benzoate natri 10 mM với 0,2 mL Fe – EDTA (2 mL Fe – EDTA được pha từ 2

mM dung dịch EDTA với 2 mM dung dịch Fe(NH4)2(SO4)2) Sau đó 0,2 mL H2O2

Chiết với 20mL n-BuOH ( 10 lần) Loại dung môi dưới áp suất kém

LÁ CÂY LÁ DỨA KHÔ

CAO EtOH

Chiết với 20mL EA ( 10 lần) Loại dung môi dưới áp suất kém

Hình 3.1: Quy trình chiết các cao thô

10 mM được cho vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều và ủ ở 37C trong 60 phút Sau khi

ủ, 1 mL acid acetic 20% và TBA (thiobarbituric acid) 0,8% trong NaOH được thêm vào ống nghiệm Hỗn hợp phản ứng sau khi ủ ở 100C trong 30 phút được để nguội

ở nhiệt độ phòng Độ hấp thu quang phổ OD của phản ứng được đo ở bước sóng 532

nm

3.2.2 Thống kê phân tích số liệu

Kết quả được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA bằng phần mềm minitab 16.0

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định độ ẩm của mẫu cây

Độ ẩm của các mẫu cây chính là lượng nước có trong mẫu cây được tính toán dựa trên sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu Độ ẩm của mẫu lá cây Lá Dứa được thể hiện trong Bảng 4.1 Kết quả trình bày trong bảng 4.1 cho thấy lá cây Lá Dứa có độ ẩm là 81.5%

Bảng 4.1 Độ ẩm của mẫu cây

Tên mẫu Trọng lượng tươi

(g)

Trọng lượng khô

4.2 Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao ethanol

Năm gram cao ethanol được hòa tan trong một ít nước nóng, khuấy mạnh để tạo thành hỗn hợp sệt Hỗn hợp này được lắc chiết với petroleum ether (PE), thu lấy dịch petroleum ether và cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được 1 g cao thô, ký hiệu cao PE

Pha nước còn lại sau khi hiết với petroleum ether được chiết tiếp với ethyl acetate, thu lấy dịch ethyl acetate, cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được 1,5 g cao thô, ký hiệu cao EA

Pha nước còn lại sau khi lắc chiết với ethyl acetate được lắc tiếp với butanol, thu lấy dịch n-butanol cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được 0,9 g cao thô, ký hiệu cao BuOH

n-Pha nước còn lại được loại dung môi dưới áp suất thấp thu được 0,15 g cao nước, ký hiệu cao W

4.3 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các cao chiết cây Lá Dứa in vitro

4.3.1 Khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status

(TAS) assay) in vitro

Phương pháp đo lường khả năng chống oxy hóa tổng số TAS có thể xác định được lượng chất chống oxy hóa hiện diện trong một mẫu Tuy nhiên, TAS có thể

thay đổi do stress oxy hóa (Erejuwa et al., 2011) Stress oxy hóa gây ra sự tạo thành

gốc tự do thông qua quá trình oxy hóa glucose, phân giải và làm suy thoái protein

Sự mất cân bằng giữa lượng gốc tự do tạo thành và chất chống oxy hóa có sẵn gây ảnh hưởng đến các bào quan của tế bào, các enzyme, làm gia tăng sự peroxide hóa

lipid và phát triển kháng insulin

Phản ứng TAS trong thí nghiệm này được thực hiện theo nguyên tắc tạo ra các gốc tự do để đánh giá sự hiện diện của chất chống oxy hóa có trong cao lá của cây

Lá Dứa Dung dịch benzoate natri kết hợp với Fe(NH4)2(SO4)2 tạo ra các O2(superoxide) Nếu trong lá của cây Lá Dứa có hiện diện các chất chống oxy hóa thì

-sẽ kết hợp với các superoxide Lượng superoxide còn lại -sẽ kết hợp với TBA để thành lập TBA – RS (thiobarbituric acid reactive substances) được đo ở bước sóng

532 nm Khả năng chống oxy hóa trong cây Lá Dứa của các nghiệm thức tính theo đường chuẩn mM Trolox được thể hiện trong Hình 4.1 và Bảng 3 (phụ lục 1)

Hình 4.1: Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số in

vitro của Trolox