BO GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HQC CAN THO KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
cát)
LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHÓNG OXY HÓA
CUA CAO CHIET LA CAY LA DUA
(Pandanus amaryllifolius Roxb)
CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN
TS DAI THI XUAN TRANG NGUYEN TUONG QUYEN
BO MON SINH - KHOA KHTN MSSV: 3092367 SINH HQC K.35
Trang 2LOI CAM ON
Để hoàn thành luận văn nay, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cô Ts Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu, chỉnh sửa luận văn, góp ý cách xử lý các số liệu, quan tâm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luân văn này
Hai bạn Hồ Ngọc Phụng và Nguyễn Phạm Phương Thảo sinh viên lớp cử nhân Sinh học K35 - trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong q
trình thực hiện đề tài
Quý Thay, Cô Bộ môn Sinh, Bộ mơn Hóa — Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học — Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành ln văn này
Tập thể các bạn lớp cử nhân Sinh học K35 (2009- 2013) đã chia sẻ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn
Quý Thay, Cô Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển ông Nghệ Sinh Học, Ban giám hiệu trường Đai Học Cần Thơ đã giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập
Tơi xin gửi lời tri ân sâu sắc, chân thành đến gia đình, người thân và những người bạn đã luôn động viên và tạo điều kiện cho tơi trong, suốt q trình học tập
Cần Thơ, ngày 12 tháng 12 năm 2012
Trang 3LOI BAN QUYEN
Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi đưới sự hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được cá nhân hay tổ chức nào công bồ trong bắt kì cơng trình nào trước đây Nếu cá nhân hay tổ chức nào muốn sử dụng tài liệu trong luận văn phải được sự
đồng ý của tác giả hoặc giáo viên hướng dẫn
Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận văn
Ts Đái Thị Xuân Trang Nguyễn Tường Quyên
Trang 4MUC LUC
089) 00 ảAáẬặẬệH i
LOT BAN QUYEN 0 ccsssssesssssessssssessssssessssecsssvvscssssecsssssssssssessssseessssseesssiesssseesssseeeess ii MUC LUC HIN icccccscsssssssseesssssssssssssssssssivssseserssssssuisusseessesesssssssniesessseesssssssseseeess v
)/00/9000/96:7.90 C0 -Ã vi
DANH MUC CAC TU VIET TẮTT 222222cc++t222222221121221 EE.tErrrkkx vii (000V ‡444 viii PHAN 1 GIOT THIEU o cccccsssssssssssssssssssssssssssseessssssssessssssseesesssssssusesssssivessesssseeseesssss 1 PHAN 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 2222222+222EEE22+e222EEEetrtrEEErrerrrrrree 3
2.1 Sơ lược về chất chống oxy hóa - 22+ 22222++t2222211212221112 21122212 cee 3 2.1.1 Stress OXY NO oe 3
2.1.2 Khái niệm về chất chống oxy hóa 52222222vcccrtrtrrrrrrrrrrrrree 4 2.2 Đại cương về cây Lá Dứa . -222222221222111122721711122.2 1.1 E1 erree 7
P4 00 non ố 7
; 8: .A ,), .,., 7 2.2.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái của cây 8
2.3 Cac nghién ctru về cây Lá Dứa
2.4 Đại cương về những bệnh liên quan đến stress oxy hóa - 10
2.4.1 Bệnh tiểu đường ©2222222z22221112222111102212111121.11 2 cee 10 2.4.1.1 Phân loại bệnh tiểu đường, - -22222222222c+rrstttEEEExkrvrrerrree 10 2.4.1.2 Biến chứng bệnh tiểu đường . . -: -©2222+cevcvvvzvcerrrrrrrecree 10 2.4.1.3 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tiểu đường 11 2.3.2 Bệnh tang Huyét Ap os eccccccccccssssssesessssscceceessssnuneeeseeecessssnsnuneesseecessnseet 11 2.3.2.1 Bémh cao HUyét Api ccccccccsssssssessssssseeessssssssessessssseesssssssssesssestsssessessssnees 11 2.3.2.2 Biến chứng của bệnh tăng huyết áp -+-22222vcccrerrrreecee 12
2.3.2.3 Mối liên hệ giứa stress oxy hóa và bệnh tăng huyết áp 12
PHẢN 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1 Phương tiện nghiÊn CỨU -¿ 5£ S+2St++2EEE #11 14 3.1.1 Địa điểm và thời Qian thyrc HiGt eee 14
Trang 53.1.2 Dụng cụ và thiết bị - 2222222: 22211212222111.2121111 121111 ce 14
3.1.3 Ha ác an 14
ENAIin s80 i63) 2i 0u 0n 15
3.2.1 Phương pháp kháo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây Lá Dứa h1 15
3.2.1.1 Phương pháp trích cao cây Lá Dứa bằng dung môi ethanol 15
3.2.1.2 Khảo sát sự chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS) assay) in vitro của các cao chiết cây Lá Dứa . -:22222cccvcvcvereerrrrkrrkreecce 16 3.2.2 Thống kê phân tích số liệu ¿¿+2V2+++++E222++++ztttzzvsecee 17 PHAN 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN . 222222222222ccttrrrrrrrkrrecres 18 4.1 Xác định độ âm của mẫu cây . 22222++22222++zrtstEEEkrrrrrrrrrkrrrrrre 18 4.2 Phân lập va tinh chế các hợp chất từ cao ethanol - + 18
4.3 Khảo sát khá năng chống oxy hóa của các cao chiét cay La Dita in vitro .19
4.3.1 Khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status VU 7 19
4.3.2 Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết petroleum ether lá 21
4.3.3 Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết ethyl acetate lá 22
4.3.4 Khả năng chống oxy hóa tong số cao chiết n-butanol lá 22 4.3.5 Đánh giá hàm lượng chất chống oxy hóa có trong cao petroleum ether, ethy] acetate và n-bufaInOÌ - ¿+ kề HT TH HH HH HH HT HH 23
PHẢN 5 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ , 22-2 22+ 212111122111 22111 2.1 ccee 27 5.1 Kết luận .-¿ .2+2+222215t1211112 1111211111221 200 11 T0 21 g1 ceee 27 5.2 Đề nghị, 2-2222: 22222222122222111222721112 2.2210.110 cee 27
Trang 6Hinh 2.1 Hinh 3.1 Hinh 4.1 Hinh 4.2
MUC LUC HINH
0) 40.09 11 7
Quy trình chiết các cao thô -22222222vcecrrrerrrrrrrkes 17
Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số
Trang 7Bang 4.1 Bang 4.2 Bang 4.3
MUC LUC BANG
Độ ẩm của mẫu cây . ::-:©222++++22Cvvvrrrttrrrrrrrrrrrrker 19 Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết petroleum ether, etyl acetat và n-butanol từ lá cây Lá Dứa +<+++x<s2 21 So sánh khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết petroleum ether, etyl acetat và n-butanol từ lá cây Lá Dứa 24
Trang 8DANH MUC CAC TU VIET TAT
NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotic phosphate oxidase NOx: Nito oxidase
SOD: Superoxide dismutase XO: Xanthine oxidase CAT: Catalase
GPX: Glutathione peroxidase
AVEs: Advanced Glycation End product PKC: Protein kinase C
AR: Aldose reductase
EDTA: Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate HA: Huyét ap
OD: Mat 46 quang phé
ROS: Reactive Oxygen Species TAS: Total Antioxidant Status TBA: Acid thiobarbituric
TBA-RS: Thiobarbituric acid reactive substances
Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid
Trang 9TOM TAT
Stress oxy hóa là nguyên nhân và tham gia vào sự phát triển của nhiều bệnh nguy hiểm như tiểu đường, tăng huyết áp, ung thư, lão hóa Các dược liệu dân gian được nghiên cứu khả năng chống oxy hóa để tìm ra một phương pháp chữa bệnh an toàn, hiệu quả và chỉ phí thấp Đề tài “ Khao sát khá năng chống oxy hóa của cao chiết lá
cây Lá Dứa (Pandanus amaryllifolius Roxb}” được thực hiện nhằn đánh giá khả năng
chống oxy hóa của cây Lá Dứa Khảo sát khả năng chống oxy hóa được thực hiện bằng phương pháp TAS (Total Antioxidant Status) Cao petroleum ether 14 , cao etyl acetate 14 va cao n-butanol la duge tach ttr cao ethanol 14 Su lam sach gốc tự do của các cao chiết được khảo sát ở các nồng độ 2 mg/ml; 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0 mg/ml và kết quả thu được sau khi đo ở bước sóng 532 nm Kết quả nghiên cứu cho thấy cao petroleum ether, cao etyl acetate và cao n-butanol đều có khá năng chống oxy hóa cao hơn cao ethanol Khả năng chống oxy hóa của ba loại cao lá giảm dần theo thứ tự cao n-butanol — cao petroleum ether — cao etyl
acetate
Từ khóa: Tiểu đường, tăng huyết áp, ung thư, lão hóa, cây Lá Dứa, cao chiết, chống oxy hóa, TAS, cao petroleum ether, cao etyl acetate, n-butanol
Trang 11CHUONG 1 GIOI THIEU ©
Stress oxy hóa là hiện tượng xuât hiện trong cơ thê sinh vật khi có sự phá vỡ cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do (reactive oxygen species - ROS) và hoạt động của các chất chống oxy hóa (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009) Theo nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy stress oxy hóa ở người tham gia vào sự phát triển của nhiều bệnh hoặc có thể làm trầm trọng thêm các triệu chứng của bệnh (Peter / ai, 1989) Những bệnh bao gồm ung thư, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch, suy tim, cơ tim nhồi máu có nguyên nhân là stress oxy hóa (Halliwell et al, 2007; Singh, 1995) Tuy nhién, cac gốc tự do có thể có lợi, vì chúng được sử dụng bởi miễn dịch hệ thống như là một cách để tấn công và tiêu diệt mầm bénh (Kennedy et al, 2005) Vi vay tim hiểu về tác động của chất oxy hóa đến sức khỏe của con người đang được quan tâm nghiên cứu
Chất chống oxy hóa là một phân tử ức chế q trình oxy hóa của các phân tử khác Quá trình oxy hóa là một phản ứng hóa học chuyển electron hoặc hydro từ một chất một chất oxy hóa Phản ứng oxy hóa có thể sản xuất các gốc tự do Chất chống oxy hóa chấm dứt các phản ứng dây chuyền bằng cách loại bỏ trung gian gốc tự do và ức chế các phản ứng oxy hóa khác (Sies e¿ al, 1997) Chất chống oxy hóa tự nhiên hiện diện trong thực vật có khả năng làm sạch các gốc tự do có hại cho cơ thể (Pal et al., 2011) Các hợp chất chống oxy hóa như axit phenolic, polyphenol và flavonoid có khả năng làm sạch các gốc tự do như peroxide, hydroperoxide hoặc lipid peroxyl va do dé tre chế cơ chế oxy hóa (Prakash et al., 2000) Theo các nghiên cứu cho thay tăng cường khả năng chống oxy hóa tự nhiên trong co thé hay bé sung chất chống oxy hóa qua chế độ ăn uống có thể làm giảm nguy cơ của các bệnh mãn
tính và ngăn chặn tiến triển của bệnh (Pal e¡ ai, 2011) Hợp chất phenol va
polyphenol có nguồn gốc thực vật, chang hạn nhu flavonoid đã được chứng minh làm sạch các gốc oxy hóa Tuy nhiên, hàm lượng các hợp chất polyphenol trong rễ và vỏ của hệ thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới chưa được nghiên cứu nhiều (Pal et
Trang 12Ở nước ta, cây Lá Dứa là một loại cây được trồng hoặc mọc hoang dại có sinh khối rất lớn Tuy nhiên, cây Lá Dứa chỉ được ứng dụng chủ yếu trong lĩnh vực thực phẩm như tạo hương, tạo màu Ngoài ra, trong dân gian còn dùng lá đứa nau nước uống như một vị thuốc nam để chữa trị các bệnh như lợi tiểu, hạ đường huyết Tuy nhiên chưa có bằng chứng khoa học nào chứng minh những tác dụng chữa bệnh của cây Lá Dứa Do đó, dé tai được thực hiện nhằm khai thác tiềm năng chữa bệnh của cây Lá Dứa và quan trọng hơn góp phần tìm ra cách thức ức chế nguyên nhân của một số bệnh như tiểu đường, tim mạch những bệnh đang phát triên với tốc độ cao trong xã hội hiện đại
Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây Lá Dứa Khả năng chống oxy hóa của cao chiết Lá Dứa được đánh gia in vitro bang phuong phap TAS (Total Antioxidant Status)
Nội dung nghiên cứu cúa đề tài bao gồm
- Trích các chất bằng dung môi ethanol 99% từ cây Lá Dứa
- Tach cao petroleum ether, ethyl acetate va n-butanol ttr cao ethanol
- Sử dụng phương pháp TAS để xác định khả năng chống oxy hóa của cây Lá Dua in vitro
Trang 13CHUONG 2 LUQC KHAO TAI LIEU
2.1 Sơ lược về chất chống oxy hóa 2.1.1 Stress oxy hóa
Stress oxy hóa được định nghĩa là sự phá vỡ cân bằng giữa q trình oxy hóa và quá trình khử trong cơ thé séng (Ziyatdinova et al., 2006)
Quá trình trao đối chất và stress oxy hóa tạo ra một số sản phẩm trung gian là các gốc tự do (ROS: Reactive oxygen species) Bên cạnh sự cần thiết cho cơ thể con người, ROS cũng tham gia vào q trình lão hóa và sự phát triển của nhiều bệnh thối hóa, bao gồm bệnh Alzheimer và Parkinson Một vài nghiên cứu đã chứng minh rang stress oxy héa là nguyên nhân chính của tăng đường huyết gây ra sự tạo thành các gốc tự do đóng góp vào sự phát triển và tiễn trình của bệnh tiêu đường và những biến chứng phức tạp Sự hoạt động của ROS gây rối loạn chức năng nội mô dẫn đến phát trién bénh tim mach (Tripathi and Chandra, 2009) ROS gây nguy
hiểm cho cấu trúc tế bào và phân tử chức năng (như là ADN, protein và lipid) khi
các tác nhân oxy hóa hoặc các gốc tự do hoạt động mạnh (Ganske and Dell, 2006) Các gốc tự do là các phân tử có một điện tử riêng lẻ ở lớp ngoài cùng (Riley, 1994) Cầu hình này không ổn định và ln có xu hướng lấy điện tích của các phân tử liền kề như protein, chất béo, carbohydrate va acid nucleic Trong hệ théng sinh học, các gốc tự do có nguồn gốc từ nitơ, oxy và các phân tử lưu huỳnh Những gốc tự do trong nhóm này được gọi là dạng oxy phản ứng (ROS: Reactive oxygen species), dang nito phan tmg (RNS: Reactive nitrogen species) va dang luu huynh phan tmg (RSS: Reactive sulfua species)
ROS bao gồm các gốc tự do như superoxide (O;®—), hydroxyl (-OH), nitric oxide (NO) va cdc loại khác như hydrogen peroxide (H;O;), acid hypochlorous (HOC) va peroxyl nitrite (ONOO)
RNS được bắt nguồn từ NO thông qua các phản ứng với O;°— dé hình thành ONOO RSS có thể dễ dàng hình thành từ các phản ứng của ROS
Trang 14Phần lớn các gốc tự do hoạt động mạnh và gây nhiều tốn hại cho cơ thể nhất
là ROS Oxy là nguyên tố không thể thiếu để đảm bảo sự sống, mọi tế bào đều cần
oxy để chuyển hóa chất dinh dưỡng thành năng lượng Oxy mà con người hít thở hằng ngày là chất cần thiết nhưng chính nó cũng là trở thành gốc tự do ROS luôn được sinh ra trong cơ thể và cũng có vai trị tích cực đối với cơ thể ROS có vai trị trong biểu hiện gen và vận chuyền ion Tuy vậy, gốc tự do cũng ảnh hưởng xấu đến cơ thể khi số lượng tăng lên quá nhiều
Chúng ta có thể thấy rõ tác hại này qua sự gỉ sét hay còn gọi là sự oxy hóa Những quá trình tương tự như vậy cũng đang xảy ra trong co thé, nó luôn tạo ra gốc tự do Hiện tượng thực bào là hiện tượng vi khuẩn, virus bị tế bào bạch cầu trong cơ thé tiêu diệt hay là hiện tượng hô hấp trong tế bào hoặc hiện tượng giải độc ở gan
đều là các hoạt động sinh ra gốc tự do Các loại phản ứng oxy hóa như superoxide
(O°—), hydroxyl radical (HO*) Cac gốc tự do được hình thành bởi quá trình giảm electron của phân tử oxy
ROS có thể được phát sinh trong quá trình chiếu xạ ánh sáng tia cực tím, tia X và tia gamma, trong các phản ứng xúc tác kim loại, các chất ô nhiễm trong khơng khí, được sản xuất bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào trong quá trình viêm nhiễm và là sản phẩm của ty thể xúc tác phản ứng vận chuyên điện tử, là sán phẩm của những căng thắng mệt mỏi, thuốc lá, dược phẩm, những thói quen ăn uống không khoa học , thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiéu chlorine (Candenas, 1989; Halliwell, 1991; Armstrong, 2002 )
Trong cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn, khơng đủ đề gây hại Vì bên cạnh các gốc tự do ln có hệ thống các chất chống oxy hóa vơ hiệu hóa các gốc tự do có hại
2.1.2 Khái niệm về chất chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đáo ngược q trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic and Simic, 2000; Lachman et al, 2000; Singh and Rajini, 2004) Dua
Trang 15trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại là các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với gốc tự do, do đó nó kìm hãm pha khởi phát hoặc be gay dây chuyén phản ứng của quá trình oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe) (Singh and Rajini, 2004; Rolland, 2004)
Các chất chống oxy hóa hoạt động theo các phương thức sau:
- Các chất nay trực tiếp trung hòa các gốc tự do bằng cách cho đi điện tử (e) để kết hợp với điện tử lẻ của các gốc tự đo
- Làm giảm nồng độ peroxide và sửa chữa các màng bị oxy hóa
- Tác động đến hệ thống chống oxy hóa nội sinh để làm tăng hoạt động chống oxy hóa của cơ thé
Ở mức độ tế bào, chất chống oxy hóa có thê làm giảm gốc tự do bằng cách làm giảm hoạt động của các enzyme tạo ra gốc tự do như nicotinamide adenine dinucleotic phosphate oxidase, nitơ oxidase và xanthine oxidase hoặc bằng cách tăng cường các hoạt động và biểu hiện của các enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase, catalase va glutathione peroxidase Tế bào đông vật có chứa
enzyme SOD có thể chuyển đổi O2*— thành HạO; và O;¿ Tiếp theo đó H;ạO; được
enzyme catalase chuyền đổi thành HạO; và O2 Các chất chống oxy hóa có thé phan ứng trực tiếp VỚI các gốc tự do và phá hủy chúng, sau đó các chất chống oxy hóa sẽ trở thành các gốc tự do mới nhưng hoạt động ít hơn và ít nguy hiểm hơn so với các gốc tự do mà nó đã vơ hiệu hóa (Berger, 2005)
Chất chống oxy hóa hiệu quả nhất trong cơ thể là các enzyme như: glutathione peroxidase, catalase va superoxide dismutase (Mates et al., 1999)
Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người có nguồn gốc từ bên ngoài (chất chống oxy hóa ngoại sinh) và bên trong (chất chống oxy hóa nội sinh) Các chất chống oxy hóa nội sinh bao gồm các protein (ferritine, tranaferrine, albumine) và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde diamutase, glutathion peroxydase) Các
Trang 16chat chống oxy hóa ngoại sinh là các phân tử nhỏ được đưa vào cơ thể, bao gồm
vitamin E, Vitamin C, các carotenoid và các hợp chất phenolic (Niki et al., 1995; Pincemail et al., 1998; Lachman et al., 2000; Vanaant et al., 2004)
Hop chất chống oxy hóa trong thực phẩm đóng vai trò quan trọng như một yếu tố bảo vệ sức khỏe Bằng chứng khoa học cho thấy chất chống oxy hóa làm giảm nguy cơ các bệnh mãn tính như ung thư và bệnh tim (Prakash et al, 2000;
Deshmukh, 2009), viêm và lão héa (Uttara et al, 2009) Nguồn chính của chất chống
oxy hóa tự nhiên là ngũ cốc, trái cây và rau quả Thực phẩm chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật như vitamin C, vitamin E, caroten, axit phenolic, phytate va estrogen thyc vat di duoc chimg minh cé kha nang lam giam nguy co mic bénh (Prakash et al., 2000)
Đặc điểm chính của chất chống oxy hóa là khả năng phục hồi các gốc tự do Có một số nghiên cứu cho thấy rằng các chất chống oxy hóa trong trái cây, chè, rau quả và rượu vang làm giảm tỉ lệ mắc các bệnh mãn tính như bệnh tim và một số bệnh ung thu (Prakash et al, 2000) Thực vật là nguồn chống oxy hóa tiềm năng của tự nhiên Thực vật có thể chống lại ROS nhờ tạo thành các hợp chất chống oxy hóa Như vậy, chất chống oxy hóa không chỉ bảo vệ thực phẩm mà còn báo vệ các tế bào chống lại thiệt hại do oxy hóa (Zin et al., 2002)
Ngày nay các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên được quan tâm sử dụng rộng rãi trên thế giới vì tính hiệu quả, an toàn và ít bị ô nhiễm hơn các sản phẩm nhân tạo Vì vậy, việc điều tra và xác định các chất chống oxy hóa tự nhiên từ thực vật là quan
trọng và cần thiét (Zin er al., 2002)
Trang 172.2 Đại cương về cây Lá Dứa 2.2.1 Khóa phân loại
Giới: Plantae Bộ: Pandanales Họ: Pandanaceae Giống: Pandanus Lồi: P amaryllifolius 2.2.2 Mơ tả cây Hình 2.1: Cây Lá Dứa (Nguồn: http://www.tinmoi.vn/vuon-hoa-toa-sac-09921244.html) Theo Đỗ Tắt Lợi (1982), cây Lá Dứa (Pandanus amaryllifolius Roxb) thuộc họ Pandanceae
Cây Lá Dứa thuộc cây thân bụi, có đời sống lâu năm Đường kính thân cay 1- 3 cm, cây cao đến 1 m, thân rộng, thân cây có màu xanh đậm chia ra nhiều nhánh Lá có dạng lá đơn, láng, mọc thành cụm hình hoa thị Lá dài và có hình dạng giống mũi mác mép lá khơng có gai, mặt dưới lá có màu nhạt Lá dứa có mùi thơm dịu, khơng có lơng, lá xếp theo hình máng xối, dài khoảng 40-50 cm, rộng 3-4 cm, lá có nhiều gân cách nhau 1 mm, khơng thấy có hoa Lá dứa có mùi thơm như mùi cơm nếp mà các lồi Pandanus khac khơng có
Trang 182.2.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái của cây
Cây Lá Dứa được phân bồ chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các
châu lục Cây thường được trồng và sử dụng như một loại cây gia vị được dùng trong âm thực vì nó có mùi thơm và màu xanh đặc trưng
Ở Việt Nam, cây Lá Dứa được trồng và mọc hoang phổ biến Trên thế giới cây Lá Dứa được trồng nhiều ở miền nhiệt đới Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Philippines (Phạm Hoàng Hộ, 2003)
2.4 Các nghiên cứu về cây Lá Dứa
Hiện nay trong công nghiệp thực phẩm lá đứa thơm được dùng để tạo mùi thơm cho gạo, tạo hương thơm nếp cho các loại bánh kẹo và các loại nước uống giải
khat (Buttery et al., 1983) Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về hàm
lượng acid amin co trong lá dứa như 2-acetyl-I-pyrrolin gồm có proline va ornithine
được sử dụng trong thực phẩm đề làm các loại bánh (Weenen er ai., 1997)
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trên rễ cây Lá Dứa (Heimsch e/ al.,
2008) Những nghiên cứu đã chứng minh rằng gốc rễ và thân rễ của cây Lá Dứa có hiệu quả trong điều trị bệnh tiêu đường trên chuột (Phongboonrod e/ al., 1976) Theo sách y học của Philippine, rễ cây Lá Dứa được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường (Michael, 1980)
Một số nghiên cứu đã chứng minh được hợp chất 4-hydroxybenzoic acid có tác dụng làm hạ đường huyết trên chuột (Peungvicha er al., 1998) Hop chất này chủ
yêu tập trung ở rễ cây La Dita
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khảo sát các thành phần hóa học khác có trong lá dứa như hợp chất alkaloids, thành phần có trong hợp chất này là pandamarilactonine-A, pandanmarilactone-1, pandanamine, pandamarilactonine- B,norpandamarilactonine A va norpandamarilactonine-B (Takayama et al., 2001)
Từ rễ của cây Lá Dita hop chat alkaloids mdi tiép tục nghiên cứu và đặt tên
pandamarilactonine-H (Mario e¿ ai, 2010) Nhiều hợp chất khác có trong lá dứa được nghiên cứu như 2-acetyl-l-pyrroline (Buttery e/ ai., 1983; Kantilal ef al.,
Trang 192009), phenol, sterol va terpenoit (Mohsin et al., 2008), palmitic acid, linoleic acid, steric acid (Chong et al., 2010)
Rễ cây Lá Dứa chứa các hợp chất phân cực, tan đều trong nước có khả năng làm giảm đường huyết Cơ chế hoạt động tương tự insulin hoặc thông qua sự tiết insulin ttr tuyén tuy (Peungvicha et al., 1996; Limviwakill et al., 2001)
Dịch chiết lá đứa có khả năng ức chế khối u (Meyer ¿/ al., 1982) Theo y học
hiện đại lá dứa có phytosterol tác dụng làm giảm hiệu ứng và giảm bệnh tim mạch
vành (Ling er al., 1995; Tapiero e: ai., 2003) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng
phytosterol có thể có khả năng chống lại hoạt động của khối u, sterol thực vật có khả năng chống lại tế bào ung thư, đặc biệt đối với các tế bao ung thu va (Awad er al., 2000)
Theo nghiên cứu của Yan e¿ ai (2010) khảo sát hoạt động chống oxy hóa trên phản ứng DPPH của lá dứa tươi và bột lá dứa, cho thấy lá dứa có khả năng chống oxy hóa
Ngồi ra, nhiều nghiên cứu hiện nay khảo sát được từ cây Lá Dứa tìm ra nhiều hợp chất mới, an toàn hon dé khang khuan (Kaiser et al., 2011)
Theo các tác giả Đào Hùng Cường và Nguyễn Thị Thanh Tú (2010) đã khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây Lá Dứa Thành phần dễ bay hơi một số chất gây mùi chính của cây là 2-acetyl-I-pyrrolin (17/7%), Limone (5,5%); 3- methyl-2(5H)furanone (4,83%); 2,4,4 trimethylbut-2-enolide (1,28%) có mùi thơm
giống như gạo nếp
Trong dịch chiết có một số chất gây mùi thơm có nhiệt độ sôi trên 100°C nằm trong dịch chiết đó là các ester và aldehyl như 9-octadecen-12-noic acid, methyl, bicyclo 3.3.1 nonan-2-one va 9-isopropylidene Ngoài ra, nghiên cứu còn phân lập được một chất thuộc họ alkaloid có tên gọi là Padamarilactonine-A
Trong rễ và lá cây Lá Dứa có chứa chất chống oxy hóa (Nguyễn Tường Quyên và Nguyễn Phạm Phương Thảo, 2012)
Trang 202.5 Đại cương về những bệnh liên quan đến stress oxy hóa
2.5.1 Bệnh tiểu đường
2.5.1.1 Phân loại bệnh Tiếu Đường
Bệnh tiểu đường thường được chia làm hai loại là bệnh tiểu đường tuýp 1 và
bệnh tiểu đường tuýp 2
Bệnh Tiểu Đường tuýp I chủ yếu do sự tiêu hủy để tự miễn dịch qua trung gian của các tế bào B tai cac tiểu đảo ở tuyến tụy (đảo tụy), dẫn đến tình trạng thiếu insulin tuyét đối (Zimmet et al., 2001) Những người bị tiêu đường tuýp 1 phải sử dụng insulin ngoại sinh để ngăn chặn sự phát triển của các thể keto (ketoacidosis)
(Zimmet., 2001) Bệnh tiểu đường tuýp 1 chiếm tỉ lệ khoảng 5- 10% trong tổng số người mắc bệnh tiểu đường Bệnh tiểu đường tuýp 1 thường được phát hiện trước 40
tuổi Đa số các trường hợp được chắn đoán bệnh tiểu đường tuýp 1 thường là người có thể trạng gầy Người bị bệnh tiểu đường sẽ có đời sống phụ thuộc insulin hoàn
toàn (Nguyễn Thị Bay, 2007)
Bệnh tiểu đường tuýp 2 được đặc trưng bởi sự khang insulin (Zimmet et al., 2001) nghĩa là đối với tiểu đường tuýp 2 insulin vẫn tiết bình thường nhưng cơ thé không sử dụng được Những người bị bệnh tiểu đường không phụ thuộc vào insulin ngoai sinh (Zimmet et al., 2001) Phần lớn người bị bệnh tiểu đường thuộc tuýp 2
chiếm khoảng 90% trong tổng số người mắc bệnh (Zimmet ai., 2001) và thường được phát hiện sau 40 tuôi
2.5.1.2 Biến chứng bệnh tiếu đường
Bệnh tiểu đường thường có những biến chứng sau: biến chứng tim, hoại tử do
bệnh tiểu đường, hôn mê, biến chứng thần kinh, biến chứng mắt, biến chứng thận, biến chứng răng, biến chứng ngoài da
Trang 212.5.1.3 Mối liên quan của stress oxy hóa và bệnh tiếu đường
Stress oxy hóa được xem là nguyên nhân chính của bệnh tiểu đường Tăng đường huyết có thể gây ra stress oxy hóa thơng qua hình thành AVEs (Advanced Glycation End product- AGEs), gia tăng sự hoạt hóa protein kinase C (PKC) và gia tăng sự vận chuyển các dẫn xuất axit amin của đường hexose (Tripathi and Chandra,
2009)
Khi đường huyết tăng các gốc superoxide trong chuỗi dẫn truyền điện tử ở ty thể tăng là nguyên nhân gây ra stress oxy hóa Sự hình thành superoxide và tiếp theo là sự gia tăng stress oxy hóa có thê dẫn đến rối loạn chức năng nội mạc và cuối cùng là các bệnh tim mạch thông qua một số cơ chế khác nhau (Tripathi and Chandra, 2009) Bệnh tiểu đường làm thay đối hoạt động của các enzyme có vai trò trong sự chống oxy hóa và làm giảm lượng Gutathion (Gutathion được biết có khả năng chống lại stress oxy hóa)
AGEs có thể sản sinh ra ROS, sắn vào thụ thể thúc đây stress oxy hóa và kích hoạt các cơ chế sản sinh ra chất oxy hóa trong nội bào Sự gia tăng vận chuyển đường đa trong sự tăng đường huyết là do tăng hoạt động của enzyme phân giải đường aldose (Aldose reductase- AR) trong mô tim AR được chứng minh gia tăng chuyển hoa Glutathione do đó làm giam Glutathione và tiếp đó là gia tăng stress oxy hóa (Tripathi and Chandra, 2009)
Sự hoạt động của ROS dẫn đến rối loạn chức năng nội mô , một tiền chất để phát triển các bệnh tim mạch Vì vậy kiểm soát hoạt động của ROS được xem là cách tiếp cận hợp lí để chống lại các biến chứng mạch máu phức tạp của bệnh tiểu đường
2.5.2 Bệnh tăng huyết áp
2.5.2.1 Bệnh cao huyết áp
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh do tăng huyết áp là nguyên nhân gây tử vong cao nhất trên thế giới (WHO, 2002) Tăng huyết áp hoặc huyết áp cao ảnh
Trang 22hưởng đến ít nhất một tỷ người trên toàn thế giới (Keamey et al., 2005) Cao huyết áp là một rối loạn phổ biến ảnh hướng lớn đến sức khỏe của cộng đồng Bệnh cao huyết áp thường khơng có triệu chứng và được phát hiện khi kiểm tra sức khỏe định kì hoặc sau khi xảy ra các biến chứng như một cơn đau tim hoặc đột quy (Lip,
2003) Hơn 95% bệnh nhân tăng huyết áp có nguyên nhân thiết yếu hoặc vô căn và chỉ có một tỷ lệ nhỏ có một nguyên nhân nhận dạng (tăng huyết áp thứ cấp)
Theo lời khuyên của các chuyên gia của Mỹ và Châu Âu, huyết áp vượt trên mức huyết áp tối ưu dù nhỏ thì cũng làm gia tăng biến cơ tìm mạch (Chobanian e al, 2003; Mancia e ai., 2007) Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tác hại của tăng huyết áp trên các hệ thống tim mạch, thận, não Cao huyết áp là yếu tố nguy cơ chính gây bệnh tim và đột quy và nguy cơ tim mạch tăng gấp đôi với mỗi độ tăng huyết áp 20/10mmHg HA tâm thu và tâm trương (Lewington e¿ al, 2002)
2.5.2.2 Biến chứng cúa bệnh tăng huyết áp
Bệnh cao huyết áp thường dẫn đến các biến chứng về tim mạch như cơ tim phì đại, tai biến mạch máu não, nhữn não, thiếu máu não, hẹp động mạch Ngồi ra cịn dẫn đến biến chứng về thận như hư màng lọc của các tế bào thận, hẹp động mạch thận, suy thận
2.5.2.3 Mối liên quan của stress oxy hóa và bệnh tăng huyết áp
Nghiên cứu cho thấy, stress oxy hóa là nguyên nhân của bệnh tăng huyết áp, một yếu tố nguy cơ chính cho tỷ lệ tit vong bénh tim mach (Rodrigo et al., 2007) ROS có ảnh hưởng đến mạch máu và sự phát triển của tăng huyết áp (Lasségue, Griendling, 2004; Touyz, Schiffrin, 2004)
Stress oxy hố có thể làm rối loạn chức năng nội mô và là hậu quả của tăng huyết áp (John, Schmieder, 2003) Nghiên cứu cho thấy, ROS làm tăng huyết áp và hình thành superoxide trong mạch máu được cải thiện nhờ chất chống oxy hóa ngoại sinh được nghiên cứu trén mé hinh dong vat (Chen et al., 2001; Hoagland et al., 2003) và tăng huyết áp trên ngwoi (Duffy et al, 2001; Boshtam M et al., 2002) Mot số nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa và ROS là nguồn gốc của tăng huyết
Trang 23áp.Nghiên cứu cho thay tăng huyết áp thúc đây sản xuất của ROS trong não, thận, mạch máu (Harrison, 2009)
Trang 24CHUONG 3 PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm thực hiện :
Phịng Thí Nghiệm Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Phòng Sinh Học Phân tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển CNSH Thời gian thực hiện: từ tháng 8/2012 đến tháng 12/2012
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
Sử dụng máy móc và thiết bị liên quan đến nghiên cứu hiện có tại Bộ mơn Sinh học và Hóa hoc — Khoa Khoa học tự nhiên và Viện Nghiên cứu & Phat triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ
Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm máy cô quay chân không Heidolph (Đức), máy ly tâm lạnh Mikro 220R (Đức), máy đo pH Metler Toledo, máy ủ, máy đo quang phổ, máy khuấy từ, máy vortex, cân phân tích ABI04 (Switzerland), bình lắng (Trung Quốc) Một số dụng cụ hỗ trợ trong các thí nghiệm như eppendorf, pipette, đầu côn, kim mũi giáo, cân điện tử, ống đong, bình tam giác, găng tay, giấy bạc và tủ sấy
3.1.3 Hóa chất và vật liệu
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm gồm ethanol (Viét Nam), hydrogen peroxide (H,02) (Merck ), acid acetic (Merck),
disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate (EDTA) (Merck), ammonium iron (II) sunfate hexahydrate (Fe(NH4)2(SO4)2) (Merck —), sodium benzoate (Trung Quéc), acid thiobarbituric (TBA) (Merck), Trolox (Denmark), methanol (Trung Quéc), ethanol 99° (Trung Quéc), n-butanol (Trung Quéc), ethyl acetate (Trung Quốc), petroleum ether (Trung Quốc)
Trang 25Vat ligu thi nghiém 1a 3 kg 14 cua cay La Dứa được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long 3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa cúa cao chiết cây La Dita in vitro
3.2.1.1 Phương pháp trích cao cây Lá Dứa bằng dung môi ethanol
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm lá của cây Lá Dứa (Pandanus amaryllifolius Roxb) được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long Mẫu sau khi thu dựa vào các đặc điểm hình thái của thực vật như rễ, lá, và tham khảo tài liệu từ bộ sách cây có Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (2003) để định danh Mẫu lá của cây Lá Dita, chỉ lấy những lá màu xanh bóng, khơng sử dụng những lá quá non hay quá già
Mẫu được rửa sạch bằng nước với trọng lượng mẫu tươi là 3 kg Mẫu cây
được cắt nhỏ, phơi khô cho đến khi trọng lượng không đổi và cân lại lần nữa dé xác
định trọng lượng mẫu khô Độ âm của nguyên liệu là sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khơ và được tính theo công thức sau:
Trọng lượng tươi — Trọng lượng khô
X 100 %
Trọng lượng tươi
Mẫu sau khi phơi cho vào túi nylon sạch, ghi nhãn, bảo quản ở nhiệt độ phòng để sử dụng cho nghiên cứu
Lá của cây Lá Dứa khô (250g) được ngâm trong dung môi ethanol 99% trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng Sau 7 ngày phần nước ngâm mẫu được lọc và cô cạn bằng hệ thống máy cô quay để loại bỏ dung môi ethanol
Quy trình chiết cao được trình bày như trong Hình 3.1
Trang 26LA CAY LA DUA KHO
Chiết ngâm dầm với ethanol 96°
Lọc DỊCH CÒN BÃ
Loại dung môi dưới áp suất kém CAO EtOH
Chiét voi 20mL PE (x 10 lần)
Loại dung môi dưới áp suât kém
ma
CAO PE PHA NƯỚC
Chiết với 20mL EA (< 10 lần)
Loại dung môi dưới áp suât kém
CAO EA PHA NƯỚC
Chiết với 20mL n-BuOH ( 10 lan)
Loại dung môi dưới áp suât kém
CAO BuOH
Hình 3.1: Quy trình chiết các cao thơ
3.2.1.2 Khảo sát sự chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS)
assay) in vitro cia cac cao chiét cây La Dita
TAS được xác định theo phương pháp của Koracevic e/ ai., (2000) có hiệu chỉnh như sau: 10uL cao ethanol rễ cây Lá dứa được pha loãng trong 490 uL dung dich dém phosphate natri 100 mM pH 74 được cho vào hỗn hợp gồm 0,5 mL dung dịch benzoate natri 10 mM với 0,2 mL Fe —- EDTA (2 mL Fe - EDTA được pha từ 2 mM dung dịch EDTA với 2 mM dung dịch Fe(NH,);(SO,¿);) Sau đó 0,2 mL H;O;
Trang 2710 mM được cho vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều và ủ 6 37°C trong 60 phút Sau khi u, | mL acid acetic 20% va TBA (thiobarbituric acid) 0,8% trong NaOH dugc thém vào ống nghiệm Hỗn hợp phản ứng sau khi ủ & 100°C trong 30 phút được đề nguội ở nhiệt độ phòng Độ hấp thu quang phổ OD của phản ứng được đo ở bước sóng 532
nm
3.2.2 Thống kê phân tích số liệu
Kết quả được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA bằng phần mềm
minitab 16.0
Trang 28CHUONG 4 KET QUA VA THAO LUAN
4.1 Xác định độ ấm của mẫu cây
Độ ẩm của các mẫu cây chính là lượng nước có trong mẫu cây được tính tốn dựa trên sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu Độ ẩm của mẫu lá cây Lá Dứa được thể hiện trong Báng 4.1 Kết quá trình bày trong bảng
4.1 cho thấy lá cây Lá Dứa có độ âm là 81.5% Bảng 4.1 Độ Âm của mẫu cây
~ Trọng lượng tươi Trọng lượng khô „
Tên mầu Độ âm (%)
(g) (g)
Lá cây Lá Dứa 3000 555 81,5
4.2 Phân lập và tỉnh chế các hợp chất từ cao ethanol
Năm gram cao ethanol được hòa tan trong một ít nước nóng, khuấy mạnh để tạo thành hỗn hợp sệt Hỗn hợp này được lắc chiết với petroleum ether (PE), thu lay dich petroleum ether và cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được l g cao thé, ky hiệu cao PE
Pha nước còn lại sau khi hiết với petroleum ether được chiết tiếp với ethyl acetate, thu lay dich ethyl acetate, cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được 1,5 g cao thô, ký hiệu cao EA
Pha nước còn lại sau khi lắc chiết với ethyl acetate được lắc tiếp với n- butanol, thu lay dịch n-butanol cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được 0,9 g cao thô, ký hiệu cao BuOH
Trang 294.3 Khao sat khá năng chống oxy hóa của các cao chiét céy La Dita in vitro 4.3.1 Khao sat kha nang chéng oxy héa tong s6 (Total Antioxidant Status (TAS) assay) in vitro
Phương pháp đo lường khả năng chống oxy hóa tổng số TAS có thể xác định
được lượng chất chống oxy hóa hiện diện trong một mẫu Tuy nhiên, TAS có thể
thay đối do stress oxy héa (Erejuwa et al., 2011) Stress oxy hóa gây ra sự tạo thành gốc tự do thơng qua q trình oxy hóa glucose, phân giải và làm suy thoái protein Sự mất cân bằng giữa lượng gốc tự do tạo thành và chất chống oxy hóa có sẵn gây ảnh hưởng đến các bào quan của té bao, các enzyme, lam gia tang su peroxide héa lipid va phat trién khang insulin
Phản ứng TAS trong thí nghiệm này được thực hiện theo nguyên tắc tạo ra các gốc tự do để đánh giá sự hiện diện của chất chống oxy hóa có trong cao lá của cây Lá Dứa Dung dịch benzoate natri kết hợp với Fe(NH¿)z(SO¿); tạo ra các Oz (superoxide) Nếu trong lá của cây Lá Dứa có hiện diện các chất chống oxy hóa thì sẽ kết hợp với các superoxide Lượng superoxide còn lại sẽ kết hop voi TBA dé thành lap TBA — RS (thiobarbituric acid reactive substances) được đo ở bước song 532 nm Khả năng chống oxy hóa trong cây Lá Dứa của các nghiệm thức tính theo đường chuẩn mM Trolox được thể hiện trong Hình 4.1 và Bảng 3 (phụ lục 1)
y = -0.7585x + 1.0233 R? = 0.9846 Gia tri OD ° S = > 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Nồng độ Trolox (mM)
Hình 4.1: Đường chuẩn khảo sát khá năng chống oxy hóa tống số in
vifra của Tralnv
Trang 30Khi nồng độ Trolox càng thấp giá trị OD đo được càng cao và ngược lại
Theo kết quả Hình 4.1 giá trị OD đo được tỷ lệ nghịch với nồng độ Trolox Điều này
chứng minh khi nồng độ Trolox thấp, lượng chất chống oxy hóa hiện diện thấp do đó các superoxide con lai nhiéu sé két hop voi TBA tao ra nhiều TBA — RS vi thé
làm tăng giá trị OD và ngược lại Kết quả phân tích thống kê cho thấy, giá trị OD đo được ở các nồng độ Trolox đều khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (P<0,05)
Bảng 4.2: Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết petroleum ether, ethyl acetate va n-bufanol từ lá cây Lá Dứa
Nồng độ cao
chiét (mg/ml)
Cao Petroleum ether
Cao ethyl acetate Cao n-Butanol
Trang 31Trolox 1,1746°+40,1130 1,1046*®+0,0117 1,25602+0,0124
Ghỉ chú: Các chữ cái theo sau trong cùng cột khác nhau sẽ khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% tính theo cột OD: Mật độ quang phổ đo ở 532 nm Trolox (Vitamin E) : Hoạt chất chống oxy hóa tự nhiên có trong cao chiét trong duong mM Trolox
Khả năng chống oxy hóa tổng số ở các nồng độ của cao petroleum ether, cao ethyl acetate và cao n-butanol được tính tốn dựa theo phương trình đường chuẩn
y = -0,7585x+ 1,0233 (R?= 0,9846) (Hình 4.1) Kết quá ở bảng 4.2 cho thay
khi nồng độ cao chiết tăng thì giá trị Trolox tương ứng cũng tăng theo
4.3.2 Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiét petroleum ether lá cây
Lá Dứa
Qua thực nghiệm (Bảng 4.2) cho thấy cao petroleum ether lá cây Lá Dứa hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương Trolox tăng dần từ 0,4177 + 0,0075 mM Trolox ở nồng độ là 0,125mg/ml lên 1,1746 + 0,1130 mM Trolox ở nồng độ là 2
mg/ml Trong đó, tăng mạnh nhất từ 0,5981 + 0,0241 mM Trolox ở nồng độ 0,25 mg/ml lên 0,9143 + 0,0022 mM Trolox ở nồng độ 0,5 mg/ml Hàm lượng chất
chống oxy hóa tương đương Trolox giữa các nồng độ của cao petroleum ether lá đều có khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (P<0,05)
Khi so sánh hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương Trolox của cao petroleum ether với cao ethanol lá cây Lá Dứa (Nguyễn Tường Quyên và Nguyễn
Phạm Phương Thảo, 2012) cho thấy cao ethanol lá ở nồng độ 1 mg/ml hàm lượng chất chống oxy hóa tăng từ 0,4999 + 0,0107 mM Trolox và 0,6616 + 0,0029 mM
Trolox ở nồng độ 2 mg/ml Trong khi đó ở cao petroleum ether 6 nồng độ 1 mg/ml và 2 mg/ml hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương theo Trolox lần lượt là 1,0432 +0,0149 mM và I,1746 + 0,1130 mM Qua đó cho thấy cao petroleum ether lá có hàm lượng chất chống oxy hóa cao hơn so với cao ethanol lá ở cùng nồng độ
Trang 324.3.3 Khá năng chống oxy hóa tổng số cao chiết ethyl acetate lá cây Lá Dứa
Từ kết quả thực nghiệm (Bảng 4.1) cho thấy hàm lượng chất chống oxy hố tính tương đương Trolox của cao ethyl acetate lá cây Lá Dứa tăng dần từ 0,1290 + 0,0015 mM Trolox ở nồng độ 0,125 mg/ml lên 1,1046 + 0,0117 mM Trolox ở nồng
độ 2 mg/ml Trong đó, tăng mạnh nhất là 0.2763 + 0.0224 mM Trolox ở nồng độ
0,25 mg/ml lên 0,6188 + 0,0162 mM Trolox ở nồng độ 0,5 mg/ml Tat ca các giá trị tương đương mM Trolox giữa các nồng độ của cao ethyl acetate lá đều có sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (P<0.05)
Khi so sánh hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương theo mM Trolox của cao ethyl acetate lá với cao ethanol lá cây Lá Dứa (Nguyễn Tường Quyên và Nguyễn Phạm Phương Tháo, 2012) cho thấy cao ethanol lá ở nồng độ 1 mg/ml và
2mg/ml hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương lần lượt là 0.4999 + 0,0107
mM và 0,6616 + 0,0029 mM Trolox ở nồng độ 2 mg/ml Trong khi đó ở cao ethyl acetate lá hàm lượng chất chống oxy hóa 0,8704 + 0,0076 mM Trolox ở nồng độ 1
mg/ml va 1,1046+ 0,0117 mM Trolox ở nồng độ 2 mg/ml Qua dé cho thay cao
ethyl acetate lá có hàm lượng chất chống oxy hóa cao hơn cao ethanol lá ở cùng nồng độ
4.3.4 Khá năng chống oxy hóa tổng số cao chiết n-butanol lá cây Lá Dứa
Từ kết quả thực nghiệm (Bảng 4.1) cho thấy cao n-butanol lá cây Lá Dứa có hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương Trolox tăng dần từ 0,3947 + 0,0110 mM Trolox ở nồng độ cao 0,125 mg/ml lên 1,2560 + 0,0124 mM Trolox ở nồng độ
2 mg/ml Tăng mạnh nhất từ 0,3947 + 0,0110 mM Trolox ở nồng độ 0,125 mg/ml
lên 0,8328 + 0,0136 mM Trolox ở nồng do 0,25 mg/ml Tất cả các gia tri trong đương mM Trolox giữa các nông độ của cao n-butanol lá đều có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (P<0,05)
Trang 33Khi so sánh hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương theo mM Trolox của cao n-butanol lá với cao ethanol lá cây Lá Dứa (Nguyễn Tường Quyên và Nguyễn Phạm Phương Thảo, 2012) cho thấy cao ethanol lá ở nồng độ 1 mg/ml và
2mg/ml hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương lần lượt là 0.4999 + 0.0107
mM và 0,6616 + 0,0029 mM Trolox ở nồng độ 2 mg/ml Trong khi đó ở cao n- butanol lá hàm lượng chất chống oxy hóa tăng từ 1,2098 + 0,0069 mM Trolox ở
nồng độ 1 mg/ml và 1,2560+ 0,0124 mM Trolox ở nồng độ 2 mg/ml
4.3.5 Đánh giá hàm lượng chất chống oxy hóa có trong cao petroleum ether, ethyl acetate va n- butanol
Bảng 4.3: So sánh khả năng chống oxy hóa tong số cao chiết petroleum ether, ethyl acetat và n-butanol từ lá cây Lá Dita
Nồng độ cao Cao Petrolium Cao ethyl acetate Cao n-Butanol
Trang 342 OD 0.1324°+ 0.0086 0.1855*+0.0088 — 0.0706° + 0.0094
Trolox 1.1746+0.1130 1.1046°+0.0117 1.2560°+0.0124
Ghi chú: Các chữ cái theo sau trong cùng một hàng khác nhau sẽ khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% tinh theo hang OD: Mật độ quang phổ đo ở 532 nm Trolox (Vitamin E) : Hoat chat chong oxy hóa tự nhiên có trong cao chiết tương đương mÌM Trolox
Ở nồng độ 0,125 mg/ml cao petroleum ether lá có khả năng chống oxy hóa tổng số TAS mạnh nhất, tiếp theo là cao n-butanol lá và thấp nhất là cao ethyl acetate lá Nồng độ chất chống oxy hóa có trong các cao chiết tính tương đương mM Trolox cao nhất là cao petroleum ether (0,4177 + 0,0075 mM Trolox), tiép theo 1a cao n-butanol (0,3947 + 0,0110 mM Trolox) va thap nhất là cao ethyl acetate (0,1290 + 0,0015 mM Trolox)
Ở nồng độ 0,25 mg/ml cao n-butanol có khả năng chống oxy hóa tổng số TAS mạnh nhất, tiếp theo là cao petroleum ether và thấp nhất là cao ethyl acetate Nồng độ chất chống oxy hóa có trong các cao chiết tính tương đương mM Trolox cao nhất là cao n-butanol (0,8328 + 0,0136 mM Trolox), tiếp theo 1a cao petroleum ether (0,5981 + 0,0241 mM Trolox) va thap nhất là cao ethyl acetate (0,2763 + 0,0224 mM Trolox)
O néng d6 0,5 mg/ml cao n-butanol có khả năng chống oxy hóa tổng số TAS mạnh nhất, tiếp theo là cao petroleum ether và thấp nhất là cao ethyl acetate Nồng độ chất chống oxy hóa có trong các cao chiết tính tương đương mM Trolox cao nhất la cao n-butanol (1,0700 + 0,0081 mM Trolox), tiép theo là cao petroleum ether (0,9143 + 0,0022 mM Trolox) và thấp nhất là cao ethyl acetate (0,6188 + 0,0162 mM Trolox)
Ở nông độ I mg/ml cao n-butanol có khả năng chống oxy hóa tổng số TAS mạnh nhất, tiếp theo là cao petroleum ether và thấp nhất là cao ethyl acetate Nong
Trang 35độ chất chống oxy hóa có trong các cao chiết tính tương đương mM Trolox cao nhất là cao n-butanol (1,2098 + 0,0069 mM Trolox), tiép theo 1a cao petroleum ether (1,0432 + 0,0149 mM Trolox) va thap nhất là cao ethyl acetate (0,8704 + 0,0076 mM Trolox)
Ở nồng độ 2 mg/ml cao n-butanol có khả năng chống oxy hóa tổng số TAS mạnh nhất, tiếp theo là cao petroleum ether và thấp nhất là cao ethyl acetate Nong độ chất chống oxy hóa có trong các cao chiết tính tương đương mM Trolox cao nhất 1a cao n-butanol (1,2560 + 0,0124 mM Trolox), tiép theo là cao petroleum ether
(1,1746 + 0,1130 mM Trolox) va thap nhat 1a cao ethyl acetate (1,1046 + 0,0117
mM Trolox)
Do đó, ở nồng độ 0,25; 0,5; 1; 2 mg/ml cao n-butanol 14 c6 kha nang chéng
oxy hóa tổng số TAS mạnh nhất, tiếp theo 1a cao petroleum ether 14 va thap nhất là cao ethyl acetat 14 (Bang 2- phu luc 1)
Phần trăm lượng gốc tự do còn lại sau khi kết hợp với chất chống oxy hóa trong các cao chiết lá cây Lá Dứa được trình bày trong Hình 4.2 và Bảng 3- phụ lục
1) 5 5 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Cao petroleum ether © Cao ethyl acetate
O Cao n-butanol Lương ROS còn lại sau phản ứng ° Đối chứng 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0 Nồng độ cao chiét (mg/ml)
Hình 4.2 Phần trăm lương ROS còn lại sau phán ứng với chất chống oxy hóa có trong các cao chiết lá cây Lá Dứa
Theo kết quá ở Hình 4.2 và Bảng 3- phụ lục 1 cho thay phan trăm gốc tự do còn lại sau khi kết hợp với chất chống oxy hóa tỉ lệ nghịch với nồng độ cao chiết
Trang 36Điều này chứng minh rằng khi nồng độ cao chiết càng cao thì chất chống oxy hóa hiện diện trong cao chiết càng nhiều Do đó, chất chống oxy hóa này sẽ kết hợp với các supperoxide Lượng supperoxide cịn lại ít sẽ kết hợp tạo ra ít TBA- RS vì thế làm giảm giá trị OD và ngược lại Vì vậy, phần trăm lượng gốc tự do còn lại sau khi kết hợp với chất chống oxy hóa càng giảm và ngược lại Như vậy, phần trăm lượng gốc tự do còn lại sau khi kết hợp với chất chống oxy hóa càng thấp thì lượng chất chơng oxy hóa càng nhiêu
Khi so sánh hàm lượng chất chống oxy hóa của ba loại cao lá với cao ethanol
lá cây Lá Dứa (Nguyễn Tường Quyên và Nguyễn Phạm Phương Tháo, 2012) cho
thay ham luong chat chéng oxy héa cé trong cao petroleum ether, ethyl acetate và n- butanol déu cao hon so véi cao ethanol lá Cụ thế, hàm lượng chất chống oxy hóa có trong cao ethanol lá cây Lá Dứa ở nồng độ 2 mg/ml là 0,6616 + 0,0029, ở cao petroleum ether 1a 1,1746 + 0,1130, ở cao ethyl acetate là 1,1046 + 0,01 17 và ở cao
n-butanol là 1,2560 + 0,0124
Từ kết quá nghiên cứu cho thấy khi cao ethanol được tiếp tục tách ở những dung môi nhu petroleum ether, ethyl acetate va n-butanol thì hàm lượng chất chống oxy hóa hiện diện trong một đơn vị kháo sát nhiều hơn ở cao ethanol Từ kết quả nghiên cứu cho thấy trong ba loại cao chiết có chứa nhiều chất chống oxy hóa Đây cũng là cơ sở khoa học bổ sung thêm giá trị cho nguồn tài nguyên cây Lá Dứa
Trang 37PHAN 5 KET LUAN VA DE NGHI 1 Kết luận
Cao petroleum ether, cao ethyl acetate va cao n-butanol từ lá cây Lá Dứa đều có tác dụng chống oxy hóa Hàm lượng chất chống oxy hóa có trong ba loại cao lá này giảm theo thứ tự n-butanol lá - petroleum ether lá - ethyl acetate lá
Khi tách cao ethanol lá với các dung môi hữu cơ ít phân cực hơn ethanol thì thu được cao có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn so với cao ethanol lá
2 Đề nghị
Thứ nghiệm khá năng chống oxy hóa trên các mơ hình sinh vật
Trang 38TAI LIEU THAM KHAO * Tài liệu tiếng Việt
Đào Hùng Cường và Nguyễn Thị Thanh Tú 2010 Nghiên cứu và xác định thành phần hóa học của cây La Dita ở huyện Đại Lộc — Quang Nam DH Da Nẵng
D6 Tat Loi 2003 Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam Nhà xuất bản y học Hà
Nội
Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư (2009), “Stress oxi hóa hóa và các chất chống Oxi hóa tự nhiên”, Tạp chí Khoa hoc va Phat Triển, 667- 677
Nguyễn Tường Quyên và Nguyễn Phạm Phương Thảo 2012 Khảo sát khả năng
chống oxy hóa của cây Lá Dứa sử dụng đối tượng ruồi giám
Phạm Hoàng Hộ 2003 Cây cỏ Việt Nam — Quyền III Nhà xuất bản trẻ Hà Nội e_ Tài liệu tiếng Anh
Armstrong, D., 2002 Oxidants and Antioxidants, Ultrastructure and Molecular Biology Protocols, Humana Press, 2002, Volume 196, 3-12
Awad, A.B., Tagle Hernandez, A.Y., Fink, C.S., and Mendel, S.L 2000 Effect of dietary phytosterols on cell proliferation and protein kinase C activity in rat colonic mucosa Nutrition and Cancer (27): 2, 210-215
Boshtam M, Rafiei M, Sadeghi K, Sarraf-Zadegan N: Vita-min E can reduce blood pressure in mild hypertensives IntJ Vitam Nutr Res 2002; 72 : 309-314 Buttery, R G., Juliano, B O., And Ling, L C 1983 Identification of rice aroma
compound 2-acetyl-1-pyrroline in pandan leaves Chem Ind (London), 23, 478 capitulums in streptozocin-induced-diabetic rats J Ethnopharmacol., 109: 54- 59
Cadenas 1989 Biochemistry of oxygen toxicity, 79- 110
Trang 39Chen X, Touyz RM, Bae Park J, Schiffrin EL: Antioxidant effects of vitamins C and E are associated with altered acti-vation of vascular NADPH oxidase and superoxide dismu-tase in stroke-prone SHR Hypertension 2001; 38 : 606-611 Chobanian AV et al Seventh report of the Joint National Committee on Prevention,
Detective, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure Hypertension 2003;42:1206-52
Chong, H.Z Asmah., Abdah, R., Md, A., Norjahan Banu, M.A., Fauziah, O., and Gwendoline Ee C.L (2010) Chemical analysis of Pandanus amaryllifolius, International journal of natural product and pharmaceutical sciences, 1: 7-10 Deshmukh, S.R., (2009) Antioxidant activity of Morinda citrifolia cultures:
Prevention for major diseases Awishkar SGB Amravati University Journal 1: 6-9
Duffy SJ, Gokce N, Holbrook M, et al : Effect of ascorbic acid treatment on conduit vessel endothelial dysfunction in patients with hypertension Am J Physiol Heart Circe Phys-iol 2001; 280 : H528-H534
Edeas M (2006) Les antioxydants dans la tourmente Newletter de Société franaise des antioxydants, 9, p 1-2
Ganske, F., Dell, EJ (2006) ORAC Assay on the FLUOstar OPTIMA to Determine Antioxidant Capacity Application Note 148 Rev 12/2006
Kennedy G, Vance A Spence, Margaret McLaren, Alexander Hill, Christine Underwood & Jill J F Belch (September 2005) "Oxidative stress levels are raised in chronic fatigue syndrome and are associated with clinical symptoms" Free radical biology & medicine 39 (5): 584-589 doi:10.1016/j.freeradbiomed.2005.04.020 PMID 16085177
Trang 40Hu, C., and Kitts, D.D (2000) Antioxidant acticity of Echinacea root extract J Agric Food Chem 48, 1466-1472
Halliwell, Barry (2007) "Oxidative stress and cancer: have we moved forward?" Biochem J 401 (1): 1-11 doi:10.1042/BJ20061131 PMID 17150040 http://www.biochemj.org/bj/401/0001/4010001 pdf
Hoagland KM, Maier KG, Roman RJ: Contributions of 20-HETE to the antihypertensive effects of Tempol in Dahlsalt-sensitive rats
Hypertension 2003; 41 (3 Pt 2): 697-702
John S, Schmieder RE: Potential mechanisms of impaired endothelial function in arterial hypertension and hypercho- lesterolemia Curr Hypertens Rep 2003; 5 : 199-207
Jovanovic, S V and Simic, M G (2000) Antioxidants in Nutrition Annals of the New York Academy of Sciences, 899: 326-334
Kantilal V Wakte., Ratnakar J Thengane., Narendra Jawali and Altafhusain B Nadaf (2009) Optimization of HS-SPME condition for quantification of 2- acetyl-1-pyrroline and study of other volatiles in Pandanus amaryllifolius Roxb., Food Chemistry, Volume 121, Issue 2, 15 July 2010, 595-600
Kaiser Hamid, Kaniz Fatima Urmi, Monika Rani Saha, Abu Hasanat Md Zulfiker, Muhammad Mukhlesur Rahman 2011 Screening of dfferent parts of the plant Pandanus odorus for its Cytotoxic and antimicrobial activity, J.Pharm Sci.& Res Vol.3(1), 1025-1028
Kearney PM, Whelton M, Reynolds K, Muntner P, Whelton PK, He J (2005) "Global burden of hypertension: analysis of worldwide data" Lancet 365 (9455): 217-23 doi : 10.1016/S0140-6736(05)17741-1 PMID 15652604