Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của cà gai leo (solanum hainanensehance) in vitro và khảo sát khả năng chống oxi hóa của cao chiết từ rễ cây

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG .iv DANH MỤC HÌNH v MỤC LỤC .vi ĐẶT VẤN ĐỀ I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu Cà gai leo I.1.1 Sơ lược họ Solanaceae I.1.2 Vị trí phân loại Cà gai leo I.1.3 Đặc điểm hình thái Cà gai leo I.2 Hợp chất thứ cấp I.2.1 Giới thiệu I.2.2 Ứng dụng công nghệ tế bào thu nhận hợp chất thứ cấp I.2.3 Những yếu tố ảnh hưởng đến tạo hợp chất thứ cấp 10 I.2.4 Alkaloid 12 I.3 Nuôi cấy mô 13 I.3.1 Vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật 13 I.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô 14 I.3.3 Mô sẹo 16 I.3.4 Sự phát sinh hình thái 17 I.4 Sự kháng ôxi hóa 19 I.4.1 Khái niệm gốc tự 19 I.4.2 Lợi ích gốc tự thể 20 I.4.3 Tác hại gốc tự thể 20 I.5 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 21 I.5.1 Nguyên tắc 22 vi II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 23 II.1 Vật liệu 23 II.1.1 Địa điểm thời gian thực 23 II.1.2 Đối tượng nghiên cứu 23 II.1.3 Thiết bị dụng cụ 23 II.1.4 Môi trường nuôi cấy 24 II.1.5 Điều kiện nuôi cấy 24 II.1.6 Hoá chất dùng nuôi cấy mô 24 II.1.7 Hóa chất khảo sát khả kháng oxy hóa 24 II.2 Phương pháp nghiên cứu 25 II.2.1 Tạo rễ bất định Cà gai leo Solanum hainanense Hance 25 II.2.2 Khảo sát tạo rễ bất định từ 28 II.2.3 Khảo sát khả chống oxy hóa dịch chiết cao thô từ rễ Cà gai leo 30 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 III.1 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA 33 III.1.1 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân 33 III.1.2 Khảo sát hình thành rễ bất định từ 35 III.2 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA 36 III.2.1 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân 37 III.2.2 Khảo sát hình thành rễ bất định từ 39 III.3 Khảo sát khả chống oxy hóa cao chiết từ rễ Cà gai leo 42 III.4 Thảo luận 44 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 IV.1 Kết luận 46 IV.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC i vii ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, song song với phát triển đất nước vấn đề đáng lo ngại tình trạng sức khỏe người bị đe dọa cách nghiêm trọng vấn nạn ô nhiễm môi trường hay nóng lên toàn cầu Trước mối nguy hại này, bệnh tật người ngày gia tăng, số ca bệnh liên quan đến nhóm bệnh truyền nhiễm (như nhiễm trùng đường hô hấp, cúm, viêm phổi …) tăng lên cách rõ rệt Nhằm đảm bảo sức khỏe điều trị nhu cầu sử dụng thuốc ngày gia tăng Tuy nhiên, loại thuốc sử dụng có nguồn gốc tổng hợp phương pháp hóa học nên nhiều mang lại tác dụng phụ không mong muốn cho người sử dụng Đặc biệt, việc tổng hợp hóa học phải tốn nhiều thời gian, trải qua nhiều công đoạn nhiều phản ứng tổng hợp để có hợp chất có tính dược lý trị bệnh Do đó, phương pháp tách chiết dược liệu có nguồn gốc tự nhiên nghiên cứu để khắc phục nhược điểm Thực vật nguồn dược liệu quý có sẵn tự nhiên, cung cấp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ứng dụng việc sản xuất dược phẩm Những hợp chất coi chất trao đổi thứ cấp diện với hàm lượng nhỏ Trong tự nhiên, hợp chất có vai trò việc chống lại tác nhân ngoại xâm vi sinh vật động vật (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011) Trong năm gần đây, việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật trở thành vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu Vấn đề đặt nơi sống tự nhiên loài thuốc bị biến nhanh chóng biến động điều kiện môi trường, địa lý khai thác bừa bãi người Kết dẫn đến cạn kiệt nguồn dược liệu thiên nhiên (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011) Một giải pháp cho việc khắc phục vấn đề ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật, coi thay trì nguồn nguyên liệu cung cấp cho việc thu nhận hợp chất thứ cấp cho việc sản xuất sinh dược phẩm Việc lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều ưu điểm (1) Cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết hoạt chất theo quy mô công nghiệp mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; (2) Các nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật cho thấy hàm lượng hoạt chất sinh học tích lũy tế bào thường cao nhiều lần so với quan tích lũy chúng tự nhiên Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuốc quý, phân bố nhiều Việt Nam Trung Quốc, rễ chúng thường dùng làm thuốc chữa bệnh phong thấp, đau nhức xương, ho, rắn cắn,… (Đỗ Tất Lợi, 2004) Gần đây, nhiều tác dụng dược lý khác Cà gai leo phát chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế tạo thành xơ gan, hạn chế phát triển khối u, làm bất hoạt virus gây bệnh mụn giộp người Herpes simplex, Herpes zoster Herpes genitalis, bảo vệ chuột chống lại xâm nhiễm vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol máu (Nguyễn Hoàng Lộc cs, 2010) Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu khả tạo rễ bất định Cà gai leo in vitro Vì vậy, thực đề tài: “Nghiên cứu khả tạo rễ bất định Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) in vitro khảo sát khả chống oxy hóa cao chiết từ rễ cây” nhằm tìm môi trường thích hợp để tạo nhiều rễ Từ tạo nguồn nguyên liệu thu nhận hợp chất thứ cấp alkaloid để sản xuất dược phẩm Đồng thời, bước đầu khảo sát khả chống oxi hóa cao chiết có rễ I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu Cà gai leo Cây Cà gai leo thuộc họ Cà (Solanaceae) loại thân bụi ưa nắng, sống nhiều năm, thường trồng nước nhiệt đới I.1.1 Sơ lược họ Solanaceae [3] Họ Solanaceae gồm thân cỏ, sống một, hai năm hay nhiều năm bụi; gỗ nhỏ, gỗ to Lá mọc cách, kèm Hoa đều, lưỡng tính, mẫu Quả mọng mang đài lại nang Hạt nhiều, có nội nhũ, mầm cong hay thẳng Ở Việt Nam có 16 chi: Atrichodendron, Browallia, Brugmasia, Capsicum, Cestrum, Cyphomandra, Datura, Lycianthes, Lycium, Lycopersicon, Nicotiana, Petunia, Physalis, Solanum, Tubocapsicum; gần 50 loài I.1.2 Vị trí phân loại Cà gai leo [2] Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Solanales Họ: Solanaceae Chi: Solanum Loài: Solanum hainanense Hance Tên đồng nghĩa: Solanum procumbens Lour Hình I.1: Cây Cà gai leo Tên thông thường: Cà gai dây, Cà vạnh, Cà quýnh, Cà lù, gai cườm, chẻ nam (Tày), b’ rongoon (Ba Na) I.1.3 Đặc điểm hình thái Cà gai leo [1], [7], [19] I.1.3.1 Đặc điểm hình thái Cà gai leo nhỏ leo, sống nhiều năm, dài khoảng 1m hay Thân hóa gỗ gốc, nhẵn, phân cành nhiều; cành non tỏa rộng, phủ đầy lông tơ màu trắng, hai mặt có gai gân mặt trên, cuống có gai Hoa màu tím mọc thành xim 2-5 hoa kẽ lá, 7-9, đài có lông, xẻ thành thùy tam giác nhọn, không gai; tràng có thùy hình trái xoan nhọn; nhị màu vàng, nhị phình gốc Quả mọng, hình cầu nhẵn, có cuống dài, màu vàng sau đỏ, đường kính 5-7 mm; hạt hình thận màu vàng Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 7-9 I.1.3.2 Sinh thái, sinh trưởng phát triển Cà gai leo phân bố chủ yếu vùng đồng trung du, không thấy miền núi Vùng phân bố tương đối phong phú Việt Nam bao gồm tỉnh ven biển từ Hải Phòng đến Bình Thuận Cà gai leo thấy vài nước nhiệt đới Châu Á khác Campuchia, Thái Lan, đảo Hải Nam – Trung Quốc Cà gai leo ưa ẩm, ưa sang chịu bóng, thường mọc tập trung nhiều cá thể, lẩn lùm bụi thưa quanh làng, bãi hoang, kể bụi tre gai Cây mọc chỗ nhiều ánh sáng, sinh trưởng phát triển tốt, nhiều hoa quả, Cà gai leo có khả tái sinh hạt từ phần thân gốc lại sau chặt Ngoài ra, từ đoạn than cành trồng vào mùa xuân mọc thành Nguồn Cà gai leo Việt Nam tương đối phong phú, tỉnh ven biển miền trung, từ Thanh Hóa trở vào khai thác năm vài chục nguyên liệu để làm thuốc I.1.3.3 Bộ phận dùng Rễ cành Cà gai leo thu hái quanh năm, rửa sạch, thái nhỏ, phơi bày hay sấy khô, có dùng tươi I.1.3.4 Thành phần hóa học Rễ Cà gai leo mọc Việt Nam có cholesterol, β – sitosterol, lanosterol, dihydrolanosterol Ngoài ra, rễ chứa 3β – hydroxyl - 5α – pregnan -16 – on, rễ có solasodenon Hai chất solasodine neoclorogenin thu sau thủy phân dịch chiết rễ (Hoàng Thanh Hương, 1980) Viện Dược liệu phân tích thành phần hóa học thấy có alkaloid, glycoalcaloid, saponin, flavonoid, acid amin sterol, nhân glycoalkaloid có tỷ lệ nhiều (Âu Văn Yên – Phạm Kim Mãn) I.1.3.5 Tác dụng dược lý Hình 1.2: Công thức cấu tạo α-solasonine - Trong mô hình gây phù thực nghiệm chân chuột kaolin tạo nên giai đoạn cấp tính phản ứng viêm tương ứng với biến đổi mạch máu gây thoát huyết tương khoảng tế bào, rễ thân Cà gai leo có tác dụng ức chế phù rõ rệt (rễ với liều 13,5kg thân với liều 22,5kg trở lên) - Đối với giai đoạn bán cấp phản ứng viêm tương ứng với tạo thành tổ chức hạt, mô hình gây u hạt thực nghiệm với amian, rễ thân Cà gai leo có tác dụng ức chế rõ rệt (rễ với liều 5g/kg thân từ 10g/kg chuột trở lên) - Tuyến ức có vai trò quan trọng hình thành hệ thống miễn dịch thể, rễ thân Cà gai leo có tác dụng gây thu teo tuyến ức chuột cống non rõ rệt (rễ với liều 7,5g/kg thân với liều 15g/kg chuột trở lên) - Chỉ số tán huyết rễ Cà gai leo xác định phương pháp Brunel 13 Cà gai leo tỏ không độc thí nghiệm độc tính cấp bán cấp - Sơ đồ nghiên cứu định lượng sinh học hoạt lực chống viêm thấy 1g rễ Cà gai leo khô tương ứng với 2,5mg hydrocortisone, 1g thân Cà gai leo tương ứng 1,3mg hydrocortisone Rễ Cà gai leo chống độc lực nọc rắn cobra chuột nhắt trắng thấy Cà gai leo có tác dụng bảo vệ chuột thí nghiệm chống độc lực liều cao nọc rắn, làm tăng cách có ý nghĩa tỷ lệ chuột sống sót với chuột đối chứng không uống Cà gai leo Các nghiên cứu thăm dò khả chống co thắt phế quản số thuốc chữa hen cổ truyền phương pháp khí dung histamine armitage thấy Cà gai leo có tác dụng kéo dài thời gian chịu đựng chuột uống thuốc đặt buồng khí dung, làm thời gian triệu chứng khó thở chậm so với chuột đối chứng không uống Cà gai leo Việc nghiên cứu thăm dò khả ngăn chặn tiến triển xơ Cà gai leo mô hình gây xơ gan thực nghiệm Maros cho thấy sau tháng gây xơ gan chuột cống trắng, xơ gan hình thành rõ rệt, thể tiêu hóa sinh tổ chức học Ở thời điểm tuần, trình bệnh lý tiến triển tới giai đoạn thoái hóa mô gan, chưa có gia tăng rõ rệt collagen Nhưng xơ gan giai đoạn hoàn chỉnh, song song với biến đổi tổ chức học, hàm lượng collagen gan xơ tăng cao gấp 2,5 lần so với bình thường Cà gai leo với liều cho uống hàng ngày 6g/kg thể trọng chuột, không ngăn chặn hoàn toàn trình xơ hóa, có tác dụng làm chậm tiến triển xơ Hàm lượng collagen gan lô chuột dùng Cà gai leo 7,1% so với lô chuột chứng gây xơ không dùng thuốc Thí nghiệm cho thấy toàn chuột lô chứng gây xơ bị xơ nặng vừa, lô dùng Cà gai leo hầu hết xơ nhẹ không xơ I.2 Hợp chất thứ cấp [4], [5], [6], [8] I.2.1 Giới thiệu Ở thực vật có chất đóng vai trò quan trọng việc cấu trúc nên thể, chất gọi hợp chất sơ cấp Gồm polysaccharide, đường, protein chất béo Ngoài chất ra, có hợp chất khác có nồng độ có cấu trúc khác nhau, diện rải rác thực vật, động vật vi sinh vật Trong nhiều trường hợp, vai trò hợp chất thể sinh vật tạo chúng (sinh vật chủ) chưa biết đến Những hợp chất gọi hợp chất thứ cấp, gồm có alkaloid, terpenoid, phenolic, steroid flavonoid Cho đến nay, người ta tìm thấy gần 100.000 hợp chất thứ cấp thực vật khác nhau, năm số lượng lớn chất phát thêm Nguồn gốc chất thứ cấp điểm cuối trình biến dưỡng, với chức chuyên biệt (Harborne 1978, Harbornr & Tomas-Barberan 1991) Các hợp chất thứ cấp sản xuất loại tế bào đặc biệt tế bào tuyến tiết, lông tơ biểu mô, v.v… nơi mà chúng tiết có chức chất xua đuổi hay dẫn dụ Một chức dễ nhận thấy chất thứ cấp có vai trò sinh hóa chế bảo vệ thể chống lại tác nhân gây bệnh xâm hại Các chất trao đổi thứ cấp xếp ba nhóm alkaloid, tinh dầu glycoside Các alkaloid có dạng tinh thể hợp chất chứa nitrogen, phổ biến thực vật, ngày biết khoảng 6000 alkaloid từ 5000 loài Chúng có hoạt tính sinh lý tất động vật sử dụng công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine morphine Một số loài thực vật chứa nhiều alkaloid như: thuốc phiện (họ Papaveraceae); canh-ki-na (họ Rubiaceae); cà độc dược, thuốc khoai tây (họ Solanaceae) Người ta thường gặp tập hợp alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống Đôi toàn chứa alkaloid, tập trung (thuốc lá, chè, cacao), (thuốc phiện), vỏ (canh-ki-na), rễ (cây phụ tử, cà độc dược) Trong tùy theo phận mà tạo alkaloid khác (họ Taxaceae) Các alkaloid có hoạt tính sinh học khác biệt, số tác dụng lên hệ thần kinh (caffein, atropin, strychnin…), số tác dụng lên (veratrin, atropine…), số tác dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrine…), số khác tác dụng lên máy hô hấp (morphin…) Alkaloid thường độc với liều lượng lớn với liều lượng nhỏ, chúng sử dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994) Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, sử dụng chất mùi, chất thơm dung môi Giống lipid khác, terpenoid không tan nước Terpenoid xây dựng từ đơn vị carbon thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene, ví dụ monoterpene chứa đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa đơn vị isoprene, diterpene chứa đơn vị isoprene (Lee, 2001) Các glycoside bao gồm hợp chất phenol flavonoid, saponin cyanogenic glycoside, số chúng sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm dược phẩm (Lee 2001) thành cụm chồi nguyên nhân IAA (hormone thực vật nội sinh) nhạy cảm với nhiệt dễ bị phân hủy trình hấp tiệt trùng dẫn đến nồng độ IAA giảm thời gian nuôi cấy IAA sau cảm ứng mẫu kích thích tạo chồi phôi hàm lượng mô giảm dần (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Ở nghiệm thức bổ sung NAA 0,4 mg/l vào môi trường nuôi cấy số rễ trung bình, chiều dài trung bình rễ cao so với nghiệm thức lại mẫu hình thành mô sẹo Nguyên nhân hình thành mô sẹo NAA hormone thực vật tổng hợp bền với nhiệt, không bị biến tính môi trường nuôi cấy, mô thực vật hấp thụ tốc độ phân tách xảy nhanh chóng, hoạt động gián tiếp mô thực vât (Nguyễn Đức Lượng, 2006) kết hoạt động gián tiếp hình thành mô sẹo Theo Bùi Trang Việt, auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ, cản tăng trưởng sơ khởi Trong tạo rễ, auxin cần phối hợp với vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid cholorogenic) với kết hợp cho thấy IAA NAA kích thích tạo rễ mẫu Cà gai leo, làm hình thành rễ bất định so với đối chứng không tạo rễ Sự hình thành rễ bất định ẩn giấu biến đổi sâu sắc hoạt động mô học, tế bào chung tổ chức tách khỏi kiểm soát vào chức cho phép hình thành cấu trúc đỉnh sinh trưởng sơ khởi (Võ Thị Bạch Mai, 2004) Sự biến đổi thấy quan sát kính hiển vi, phẫu thức cho thấy tượng tạo rễ bất định từ Cà gai leo gồm hai giai đoạn điều phù hợp với kết nghiên cứu Bùi Trang Việt, 2000; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1980: Giai đoạn một: hình thành sơ khởi rễ, tế bào hoạt hóa bó mạch với kích thước lớn, chứa thông tin di truyền cần thiết cho phân chia tế bào xảy mạnh mẽ để hình thành tế bào mô phân sinh rễ Auxin kích thích mạnh phân chia tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe – mộc) Giai đoạn hai: giai đoạn kéo dài tế bào sơ khởi Sự kéo dài rễ bao gồm kéo dài tế bào sẵn có tiếp tục phân chia tế bào sơ khởi rễ Giai đoạn hoạt hóa tế bào cần auxin nồng độ cao, giai đoạn kéo dài lại cần nồng độ auxin thấp (Bùi Trang Việt, 2000) Như rễ bất định khởi từ nhóm tế 45 bào sơ khởi nhỏ, nhóm tế bào phân chia, kéo dài phân ranh thành vùng cô lập với nhu mô bó dẫn truyền Vitamine tiến hành chọn làm đối chứng, vitamin nhiều công trình nghiên cứu khẳng định hoạt tính kháng oxy hóa, chẳng hạn theo công trình nghiên cứu Mammadov cs Về mẫu thử nghiệm, kết thu từ phương pháp bẫy gốc oxy hóa tự cho thấy cao methanol rễ Cà gai leo có khả kháng oxy hóa cao hoạt tính kháng oxy hóa vitamin C Khả kháng oxy cà gai leo Việt Nam nghiên cứu nhiều nhóm tác giả khác, chẳng hạn, Nguyen Quang Vinh cs, (năm 2011) công kết kháng oxy hóa với %I đạt 9.937% So sánh với kết này, kết kháng oxy thí nghiệm đạt 36,42% cao gấp gần lần kết Nguyen Quang Vinh cs Điều giải thích rằng, thực nghiệm chúng tôi, mẫu thử nghiệm thu nhận mẫu rễ bất định từ nuôi cấy in vitro, Nguyen Quang Vinh cs nghiên cứu mẫu thí nghiệm toàn Hơn nữa, theo nghiên cứu Srinivas K cs (2007) công bố hợp chất chủ yếu Cà gai leo solasodine Hợp chất thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh thành phần khác Điều đáng ghi nhận hợp chất solasodine lại tập trung vào phần rễ nhiều có khả tan cồn Do đó, mẫu thí nghiệm rễ bất định chứa phần lớn hợp chất nên hoạt tính kháng oxy hóa cao so với công bố Nguyen Quang Vinh cs Tuy nhiên, kết ban đầu nghiên cứu này, việc định lượng xác hàm lượng thành phần solasodine chưa thực Đây hướng tiếp cận để phát triển khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa đặc tính khác hợp chất solasodine thu nhận từ rễ bất định Cà gai leo nuôi cấy theo phương pháp in vitro IV IV.1 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết thu qua thí nghiệm, rút kết luận sau: Lá tách từ chồi in vitro Cà gai leo có khả tạo rễ bất định tốt môi trường có bổ sung IAA 5,0 mg/l Hầu hết mẫu nuôi cấy môi trường 46 phân hóa tạo rễ bất định với nhiều rễ nhánh Rễ thu từ mẫu nuôi cấy đạt trung bình 17 rễ với chiều dài 5,115 cm Ngoài ra, mẫu hình thành cụm chồi, dùng cụm chồi để làm nguyên liệu cho việc nhân giống in vitro sử dụng để tiếp tục tạo rễ bất định, nhân sinh khối rễ để làm nguồn dược liệu Rễ bất định Cà gai leo hình thành in vitro trải qua giai đoạn giai đoạn hình thành sơ khởi rễ giai đoạn kéo dài Rễ bất định phát sinh từ tầng phát sinh libe-mộc Lá tách từ chồi in vitro Cà gai leo có khả tạo rễ bất định tốt môi trường có bổ sung NAA 0,4 mg/l Hầu hết mẫu nuôi cấy môi trường phân hóa tạo rễ bất định Rễ thu từ mẫu nuôi cấy đạt trung bình 17 rễ với chiều dài 1,962 cm Rễ bất định môi trường bổ sung NAA có kích thước lớn rễ nhánh, chiều dài ngắn Ngoài hình thành rễ mẫu hình thành mô sẹo với sinh khối lớn Cao chiết cồn từ rễ Cà gai leo in vitro có khả kháng oxi hóa phương pháp bẫy gốc tự DPPH với % ức chế 36,42 IV.2 Đề nghị Nếu có điều kiện, tiếp tục nghiên cứu: Thực quy trình tách chiết hợp chất solasodine từ rễ Cà gai leo Khảo sát khả chống oxi hóa solasodine 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ môn dược liệu, (2010), Giáo trình nhận thức dược liệu, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh [2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, NXB Khoa học kỹ thuật [3] Trương Thị Đẹp, (2011), Thực vật dược, NXB Giáo dục Việt Nam [4] Nguyễn Hoàng Lộc, (2010), “Nghiên cứu khả tích lũy số hoạt chất sinh học có giá trị từ nuôi cấy tế bào thực vật”, Bản tin khoa học công nghệ tỉnh Thừa Thiên Huế, trang 9-12 [5] Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Hữu Thuần Anh, (2014), “Công nghệ sinh khối giàu hoạt chất”, Hợp tác khoa học công nghệ phát triển bền vững nông nghiệp Lâm Đông-Tây Nguyên, trang 219-225 [6] Nguyễn Hoàng Lộc, (2006), Sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật, Viện tài nguyên khoa học công nghệ môi trường, Đại học Huế [7] Đỗ Tất Lợi, (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 546 [8] Nguyễn Đức Lượng, (2011), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [9] Võ Thị Bạch Mai, (2004), Sự phát triển chồi rễ, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [10] Nguyễn Kim Phi Phụng, (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐH Quốc Gia TP HCM [11] Võ Thị Phước, Nguyễn Trần Đông Phương, (2013), Nhân giống in vitro định tính anthraquinon Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb), Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Mở TP.HCM 48 [12] Lê Thanh Tâm, (2010), Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa độc tính tế bào số hợp chất Lignan Stilbene, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh [13] Ngô Văn Thu, (2011), Bài giảng dược liệu , tập I, Trường đại học Dược Hà Nội [14] Mai Trần Ngọc Tiếng cs, (1980), Kích Thích Tố Giâm Cành, Phần II: Cơ chế tạo rễ bất định, Thông báo khoa học số 4, Đại học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh, Trang 93-98 [15] Nguyễn Văn Uyển, (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh [16] Bùi Trang Việt, (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển, NXB Đại học Quốc gia, TP Hồ Chí Minh [17] Amin I., Norazaidah Y., Hainida K.I., (2006), “Antioxidant Activity and Phenolic Content of Raw and Blanched Amaranthus Species”, Food Chem, 94, p47 [18] Connan S., Delisle F., Deslandes E., Gall A.E., (2006), “Intra-Thallus Phlorotannins content and antioxidant activity in phaeophyceae of temperate waters”, Bot Mar, 49, p39 [19] Donald Armstrong, (2002), “ Oxidants and Antioxidants”, Ultrastructure and Molecular Biology Protocols, Humana Press, Volume 196, 3-12 [20] Diouf P.N., Stevanovic T., Cloutier A., (2009) , “Antioxidant and AntiInflammatory Activities of Hot Water Extract from Picea Mariana Bark and Its Proanthocyanidin-Rich Fractions”, Food Chem, 113, p 897 [21] Gálvez M., Cordero C.M., Houghton P.J, Ayuso M.J, (2005), “Antioxidant Activity of Plantago bellardi”, All Phytother Res, 19, p 1074 [22] Hallibene B., (1991), “Reactive oxygen species in living systems”, Am.J.Med, 91: 14S [23] Jenifer Burns, Takao Yokota, Hiroshi Ashihara, Michael E J Lean, Alan Crozier, (2002), “Plant Foods and Herbal Sources of Resveratrol”, J Agric Food Chem, 50, p3337-3340 [24] Mammadov, Ramazan, Ili, Pinar, Ertem Vaizogullar, Havser, (2011), “Antioxidant Activity and Total Phenolic Content of Gagea fibrosa and Romulea ramiflora”, Faculty of Science and Art, Vol 30, No [25] Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Doan Huu Nhat Binh, Moon-Sik Yang, Tae-Geum Kim, (2010), “Production of glycoalkaloid from callus 49 cultures of Solanum hainanense Hance”, Journal of Plant Biotechnology, 37, p96101 [26] Nguyen Hoang Loc, Le Thi Ha Thanh, (2011), “Solasodine production from cell culture of Solanum hainanense Hance”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16, p581-586 [27] Nguyen Hoang Loc, Huynh Van Kiet, (2011), “Micropropagation of Solanum hainanense Hance”, Annals of Biological Research ,2(2), p394-398 [28] Paul M Dewick, (2009), Medicinal natural products, John Wiley & Sons, Ltd ISBN: 978-0-470-74168-9, p270 [29] Patrick C., Eklund, Otto K., L’angvik, Johan P., W’arn A., Tapio O., Salmi, Stefna M., Willf , Rainer E., SJ’ OHOLM, (2005), “Chemical studies on antioxidant mechanisms and free radical scavenging properties of lignans”, Org Biomol Chem, (3), 3336-3347 [30] Quang Vinh Nguyen, Jong-Bang Eun, (2011), “Antioxidant activity of solvent extracts from Vietnamese medicinal plants”, Journal of Medicinal Plant Research, vol 5(13), p 2798-2811 [31] Srinivas Koduru, F.O Jimoh, D.S Grierson, A.J.Afolayan, (2007), “Antioxidant activity of two steroid alkaloids extracted from Solanum aculeastrum”, Journal of Pharmacology and Toxicology, (2), p160-167 [32] Tejas Sharma, Vishal Airao, Nimesh Panara, Devendra Vaishnav, Vishavas Ranpariya, Navin Sheth, Sachin Parmar, (2014), “Solasodine protects rat brain against ischemia/reperfusion injury through its antioxidant activity”, European journal of Pharmacology, 725, p40-46 [33] Turkmen N., Velioglu Y.S., Sari F., (2007), “Effect of extraction condition on Measured total Polyphenol Contents and antioxidant and antibacterial activities of Black Tea”, Molecules, 12, p484 50 PHỤ LỤC I Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog) BẢNG 1: THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN (mg/l) Skoog I Skoog II Skoog III NH4NO3 1650,00 KNO3 1900,00 KH2PO4 170,00 MgSO4.7H2O 370,00 CaCl2.2H2O 440,00 Na2EDTA 37,30 FeSO4.7H2O 27,80 Mn2SO4.4H2O 22,30 H3BO3 6,20 ZnSO4.7H2O 8,60 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 BẢNG 2: THÀNH PHẦN VITAMIN CỦA MOREL (mg/l) Morel’s Vitamin Pirydoxine (B6) 1,00 Biotin (II) 0,01 Meso-inositol 100,00 Nicotinic Acid (P.P) 1,00 Thiamin-HCl (B1) 1,00 Pantotheate-Ca 1,00 i II Phân tích thống kê ANOVA II.1 Kết xử lý thống kê thí nghiệm tạo rễ bất định Cà gao leo môi trường MS bổ sung IAA II.1.1 Thống kê số rễ từ đoạn thân Cà gai leo môi bổ trường MS sung IAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for so luong re by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1080.99 216.197 6.56 0.0000 Within groups 2373.85 72 32.9701 Total (Corr.) 3454.83 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for so luong re by nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 13 2.46154 1.59253 0.216713 4.70636 13 1.23077 1.59253 -1.01406 3.47559 13 1.23077 1.59253 -1.01406 3.47559 13 2.84615 1.59253 0.601329 5.09098 13 11.2308 1.59253 8.98594 13.4756 doi chung 13 0.0 1.59253 -2.24483 2.24483 -Total 78 3.16667 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for so luong re by nghiem thuc -Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -doi chung 13 0.0 X 13 1.23077 X 13 1.23077 X 13 2.46154 X 13 2.84615 X 13 11.2308 X -Contrast Difference -1 - 1.23077 ii II.1.2 Thống kê chiều dài rễ từ đoạn thân Cà gai leo môi trường MS bổ sung IAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for chieu dai re by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 184.211 36.8423 2.39 0.0462 Within groups 1110.6 72 15.425 Total (Corr.) 1294.81 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for chieu dai re by nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 13 3.34615 1.08928 1.8107 4.8816 13 2.24615 1.08928 0.710704 3.7816 13 0.846154 1.08928 -0.689296 2.3816 13 2.82308 1.08928 1.28763 4.35853 13 4.62308 1.08928 3.08763 6.15853 doi chung 13 0.0 1.08928 -1.53545 1.53545 -Total 78 2.3141 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for chieu dai re by nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -doi chung 13 0.0 X 13 0.846154 XX 13 2.24615 XXX 13 2.82308 XXX 13 3.34615 XX 13 4.62308 X -Contrast Difference +/- Limits iii II.1.3 Thống kê số lượng rễ từ Cà gai leo môi trường MS bổ sung IAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for so luong re by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5722.87 1144.57 6.55 0.0000 Within groups 12588.9 72 174.846 Total (Corr.) 18311.8 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for so luong re by nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 13 25.1538 3.66738 19.9843 30.3234 13 16.3077 3.66738 11.1382 21.4772 13 7.69231 3.66738 2.52278 12.8618 13 4.15385 3.66738 -1.01568 9.32337 13 17.0 3.66738 11.8305 22.1695 doi chung 13 0.0 3.66738 -5.16952 5.16952 -Total 78 11.7179 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for so luong re by nghiem thuc -Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -doi chung 13 0.0 X 13 4.15385 X 13 7.69231 XX 13 16.3077 XX 13 17.0 XX 13 25.1538 X iv II.1.4 Thống kê chiều dài rễ từ Cà gai leo môi trường MS bổ sung IAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for chieu dai re by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 245.036 49.0073 3.08 0.0141 Within groups 1144.33 72 15.8935 Total (Corr.) 1389.37 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for chieu dai re by nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 13 3.87692 1.1057 2.31833 5.43551 13 4.86923 1.1057 3.31064 6.42782 13 4.66923 1.1057 3.11064 6.22782 13 2.71538 1.1057 1.15679 4.27398 13 5.11538 1.1057 3.55679 6.67398 doi chung 13 0.0 1.1057 -1.55859 1.55859 -Total 78 3.54103 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for chieu dai re by nghiem thuc -Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -doi chung 13 0.0 X 13 2.71538 XX 13 3.87692 X 13 4.66923 X 13 4.86923 X 13 5.11538 X v II.2 Kết xử lý thống kê thí nghiệm tạo rễ bất định Cà gao leo môi trường MS bổ sung NAA II.2.1 Thống kê số rễ từ đoạn thân Cà gai leo môi bổ trường MS sung NAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for SO LUONG RE by NGHIEM THUC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2562.72 512.544 5.75 0.0002 Within groups 6414.62 72 89.0919 Total (Corr.) 8977.33 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for SO LUONG RE by NGHIEM THUC with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NGHIEM THUC Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0.2 13 18.0 2.61787 14.3099 21.6901 0.4 13 10.6154 2.61787 6.92526 14.3055 0.6 13 5.46154 2.61787 1.77141 9.15167 0.8 13 3.53846 2.61787 -0.151667 7.22859 1.0 13 6.38462 2.61787 2.69449 10.0747 DOI CHUNG 13 0.0 2.61787 -3.69013 3.69013 -Total 78 7.33333 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for SO LUONG RE by NGHIEM THUC -Method: 95.0 percent Duncan NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -DOI CHUNG 13 0.0 X 0.8 13 3.53846 XX 0.6 13 5.46154 XX 1.0 13 6.38462 XX 0.4 13 10.6154 X 0.2 13 18.0 X -Contrast Difference vi II.2.2 Thống kê chiều dài rễ từ đoạn thân Cà gai leo môi bổ trường MS sung NAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 215.093 43.0187 11.80 0.0000 Within groups 262.545 72 3.64645 Total (Corr.) 477.638 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NGHIEM THUC Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0.2 13 3.41538 0.529619 2.66884 4.16193 0.4 13 4.59231 0.529619 3.84576 5.33886 0.6 13 2.05385 0.529619 1.3073 2.80039 0.8 13 1.01538 0.529619 0.268837 1.76193 1.0 13 0.292308 0.529619 -0.45424 1.03886 DOI CHUNG 13 0.0 0.529619 -0.746548 0.746548 -Total 78 1.89487 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC -Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -DOI CHUNG 13 0.0 X 1.0 13 0.292308 X 0.8 13 1.01538 XX 0.6 13 2.05385 XX 0.2 13 3.41538 XX 0.4 13 4.59231 X vii II.2.3 Thống kê số lượng rễ từ Cà gai leo môi bổ trường MS sung NAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for SO LUONG RE by NGHIEM THUC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2981.03 596.205 3.56 0.0062 Within groups 12041.8 72 167.248 Total (Corr.) 15022.9 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for SO LUONG RE by NGHIEM THUC with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NGHIEM THUC Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0.2 13 3.38462 3.58681 -1.67133 8.44057 0.4 13 17.0 3.58681 11.944 22.056 0.6 13 14.0769 3.58681 9.02097 19.1329 0.8 13 14.3846 3.58681 9.32867 19.4406 1.0 13 8.69231 3.58681 3.63636 13.7483 DOI CHUNG 13 0.0 3.58681 -5.05595 5.05595 -Total 78 9.58974 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for SO LUONG RE by NGHIEM THUC -Method: 95.0 percent Duncan NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -DOI CHUNG 13 0.0 X 0.2 13 3.38462 X 1.0 13 8.69231 XX 0.6 13 14.0769 X 0.8 13 14.3846 X 0.4 13 17.0 X viii II.2.4 Thống kê chiều dài rễ từ Cà gai leo môi bổ trường MS sung NAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 74.756 14.9512 9.54 0.0000 Within groups 112.794 72 1.56658 Total (Corr.) 187.55 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NGHIEM THUC Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0.2 13 0.376923 0.34714 -0.112404 0.86625 0.4 13 1.96154 0.34714 1.47221 2.45087 0.6 13 2.8 0.34714 2.31067 3.28933 0.8 13 1.49231 0.34714 1.00298 1.98163 1.0 13 0.561538 0.34714 0.0722117 1.05087 DOI CHUNG 13 0.0 0.34714 -0.489327 0.489327 -Total 78 1.19872 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC -Method: 95.0 percent Duncan NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -DOI CHUNG 13 0.0 X 0.2 13 0.376923 X 1.0 13 0.561538 XX 0.8 13 1.49231 XX 0.4 13 1.96154 XX 0.6 13 2.8 X ix ... đề tài: Nghiên cứu khả tạo rễ bất định Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) in vitro khảo sát khả chống oxy hóa cao chiết từ rễ cây nhằm tìm môi trường thích hợp để tạo nhiều rễ Từ tạo nguồn... 28 II.2.3 Khảo sát khả chống oxy hóa dịch chiết cao thô từ rễ Cà gai leo 30 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 III.1 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường... II.1.7 Hóa chất khảo sát khả kháng oxy hóa 24 II.2 Phương pháp nghiên cứu 25 II.2.1 Tạo rễ bất định Cà gai leo Solanum hainanense Hance 25 II.2.2 Khảo sát tạo rễ bất định từ