nghiên cứu tổng hợp hai dẫn xuất imine curcumin và khảo sát hoạt tính chống oxi hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư của chúng

CHỷÔNG TRÌNH VỷÔửN ỷÔM SAÙNG TAỳO KHOA HOỳC VAử COÂNG NGHEẢ TREỹ *** BAÙO CAÙO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC đã ựược chỉnh sửa theo góp ý của Hội ựồng nghiệm thu ngày 27/01/2010 * đỀ

CHỷÔNG TRÌNH VỷÔửN ỷÔM SAÙNG TAỳO KHOA HOỳC VAử COÂNG NGHEẢ TREỹ

***

BAÙO CAÙO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

(đã ựược chỉnh sửa theo góp ý của Hội ựồng nghiệm thu ngày 27/01/2010)

* 

đỀ TÀI KHOA HỌC::

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HAI DẪN XUẤT IMINE CURCUMIN

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HÓA, KHÁNG NẤM,

KHÁNG KHUẨN, KHÁNG UNG THƯ CỦA CHÚNG

Chuũ nhieảm ựeà taụi: ThS LEÂ XUAÂN TIEÁN

Cô quan chuũ trì: TRUNG TAÂM PHAÙT TRIEĂN

KHOA HOỳC & COÂNG NGHEẢ TREỹ

STT HỌ VÀ TÊN CƠ QUAN GHI CHÚ

01 ThS Lê Xuân Tiến BM KT Hữu cơ-Khoa KT Hoá học Chủ nhiệm ñề tài

(Theo góp ý của Hội ựồng nghiệm thu ngày 27/01/2010)

Tên ựề tài: Nghiên cứu tổng hợp 2 dẫn xuất imine curcumin và khảo sát hoạt tắnh

kháng oxi hoá, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư của chúng

Chủ nhiệm ựề tài: ThS Lê Xuân Tiến

Cơ quan chủ trì ựề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

1 Bổ sung tổng quan về phương

pháp tổng hợp các dẫn xuất imine

4 Hiệu chỉnh bảng 3.6, thiếu Cg đã hiệu chỉnh, bổ sung 33

5 Cách ghi hỗn hợp dung môi cho

sắc ký cột

đã hiệu chỉnh

CƠ QUAN CHỦ TRÌ Giám ựốc

CHỦ TỊCH HỘI đỒNG

(Ký tên)

TÓM TẮT

Curcumin – thành phần màu vàng chính trong củ nghệ Curcuma longa L – có nhiều hoạt

tính sinh học như hoạt tính kháng oxi hoá, kháng viêm, kháng ung thư… Nhiều nghiên cứu gần ñây ñã cải thiện hoạt tính sinh học của curcumin bằng cách biến ñổi cấu trúc của

nó Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp 2 dẫn xuất của curcmin - isoxazolcurmin

và 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin (dẫn xuất mới), xác ñịnh cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất này

ABSTRACT

Curcumin, the main yellow constituent of Curcuma longa L rhizome, possesses a wide

range of pharmacological activities, including antioxidant, anti-inflammatory and anticancer properties Recently, numerous studies hoped to achieve improved biological activities of curcumin by structural modifications In this study, we synthesized two curcumin derivatives, including isoxazolcurcumin and 2-hydrazinobenzothiazolcurcumin (a novel curcumin derivative), determined their structures and investigated some biological activities.

MỤC LỤC

TÓM TẮT 1

MỤC LỤC 1

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT 3

DANH SÁCH CÁC HÌNH 4

DANH SÁCH CÁC BẢNG 5

PHẦN MỞ đẦU 6

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 8

1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực ựề tài 8

1.1.1 Ngoài nước 8

1.1.2 Trong nước 14

1.2 Tắnh cấp thiết của ựề tài 15

1.3 Ý nghĩa và tắnh mới về khoa học và thực tiễn 16

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 17

2.1 Nội dung nghiên cứu 17

2.2 Cô lập curcumin 17

2.3 Tổng hợp các dẫn xuất imine curcumin 17

2.3.1 Tổng hợp isoxazolcurcumin (IOZ) 17

2.3.2 Tổng hợp dẫn xuất của 2-hydrazinobenzothiazole và curcumin (HBTC) 19

2.4 Khảo sát hoạt tắnh sinh học 21

2.4.1 đánh giá hoạt tắnh kháng oxy hoá in vitro Ờ phương pháp DPPH 21

2.4.2 đánh giá hoạt tắnh kháng oxy hoá tiền in vivo Ờ phương pháp MDA 23

2.4.3 đánh giá hoạt tắnh kháng nấm, kháng khuẩn Ờ phương pháp MIC 23

2.4.4 đánh giá hoạt tắnh kháng ung thư 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.2 Tổng hợp các dẫn xuất imine curcumin 27

3.2.1 Tổng hợp isoxazolcurcumin (IOZ) 27

3.2.1.1 Tắnh chất vật lý ựặc trưng của isoxazolcurcumin 27

3.2.1.2 Biện luận cấu trúc của isoxazolcurcumin (phụ lục 1) 28

3.2.2 Tổng hợp HBTC 31

3.2.2.1 Tắnh chất vật lý ựặc trưng của HBTC 31

3.2.2.2 Biện luận cấu trúc của HBTC (phụ lục 2) 32

3.3 Kết quả khảo sát hoạt tắnh sinh học (phụ lục 3) 35

3.3.1 Hoạt tắnh kháng oxi hoá 35

3.3.1.1 đánh giá hoạt tắnh kháng oxy hoá in vitro Ờ phương pháp DPPH 35

3.3.1.2 đánh giá hoạt tắnh kháng oxy hoá tiền in vitro Ờ phương pháp MDA 37

3.3.2 Hoạt tắnh gây ựộc tế bào 39

3.3.3 Hoạt tắnh kháng khuẩn, kháng nấm 40

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

HTCO : Hoạt tính kháng oxi hoá

IC50 : Nồng ñộ hoạt chất ñể ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc

gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration)

IC70 : Nồng ñộ hoạt chất ñể ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc

gốc tự do

MIC : Nồng ñộ thấp nhất của chất thử nghiệm có khả năng ngăn cản sự phát

triển của vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration)

HPLC : Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography)

IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MS : Khối phổ (Mass spectroscopy)

NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance

spectroscopy)

TLC : Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

Hình 2.3: Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá 22

Hình 3.2: Isoxazolcurcumin (A) và TLC của Isoxazolcurcumin (B) 28

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.3: Tính chất vật lý ñặc trưng của isoxazolcurcumin 28

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá theo phương pháp DPPH 35

Bảng 3.8: Hoạt tính kháng oxy hoá của vitamin C theo phương pháp DPPH 36

Bảng 3.9: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH 37

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá theo phương pháp MDA 37

Bảng 3.11: Hoạt tính kháng oxy hoá của trolox theo phương pháp MDA 38

Bảng 3.12: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA 39

Bảng 3.13: Kết quả xác ñịnh giá trị IC50 trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của

Bảng 3.13: Nồng ñộ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml môi trường) của IOZ, HBTC và

PHẦN MỞ ðẦU

Tên ñề tài/dự án: Nghiên cứu tổng hợp 2 dẫn xuất imine curcumin và khảo sát

hoạt tính kháng oxi hoá, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư của chúng

Chủ nhiệm ñề tài/dự án:ThS Lê Xuân Tiến

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện: 11/2008-11/2009

Kinh phí ñược duyệt: 80.000.000 VNð

Nội dung:

− Cô lập curcumin từ hỗn hợp curcuminoid trích ly từ củ nghệ vàng

− Nghiên cứu tổng hợp hai dẫn xuất imine curcumin

− Tinh chế và xác ñịnh cấu trúc của các dẫn xuất imine curcumin

− Khảo sát hoạt tính sinh học của imine curcumin và curcumin như khả năng quét gốc DPPH, kháng quá trình peroxyde hóa lipid, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư.

Sản phẩm của ñề tài/dự án:

− Báo cáo khoa học về kết quả nghiên cứu tổng hợp imine curcumin và hoạt tính sinh học của chúng

− Khoảng 250 mg mẫu isoxazole curcumin

− Khoảng 250mg mẫu một dẫn xuất imine curcumin chưa ñược công bố trên các tạp chí và hội nghị khoa học trong và ngoài nước

Chương 1:

TỔNG QUAN

Củ nghệ vàng Curcuma longa L từ lâu ñã ñược biết ñến là một phương thuốc dân gian

hiệu quả trong ñiều trị các vết thương ngoài da như phỏng, mụn nhọt, các bệnh rối loạn tiêu hóa, ñau dạ dày, viêm gan, vàng da, viêm khớp Thành phần hoạt tính chính trong

củ nghệ vàng là curcumin (hay curcuminoid) (hình 1) và tinh dầu nghệ Cho ñến nay, nhiều nghiên cứu ñã chứng minh curcumin có hoạt tính sinh học cao và ña dạng như kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng ñông máu, kháng khuẩn, kháng virus… và ñặc biệt kháng ñột biến, kháng ung thư hiệu quả [1, 2]

R1HO

Curcumin có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, mạnh hơn so với vitamin E [3] Curcumin

có khả năng ức chế in vitro và in vivo hiệu quả với sự tạo thành các dạng oxygene hoạt

ñộng (ROS) trong cơ thể như các anion superoxide, H2O2, gốc nitrite [4,5,6] Các ROS

tham gia vào các cơ chế gây bệnh khác nhau trong cơ thể [7,8], do vậy thông qua hoạt tính kháng oxy hóa , curcumin có khả năng khống chế sự phát triển nhiều loại bệnh tật

và các tác nhân gây hại khác nhau Curcumin thể hiện khả năng ức chế mạnh với những thương tổn gây ra do H2O2 trong tế bào sừng, tế bào fibroblast và các tế bào NG

108 [9,10] Curcumin ngăn chặn sự peroxy hóa lipid trong vi lạp thể gan , màng hồng cầu và dịch ñồng thể não chuột [11] nhờ duy trì hoạt ñộng của những enzyme kháng oxy hóa như SOD, catalase và glutathione peroxidase [12] Curcumin và các dẫn xuất cũng là những tác nhân kháng viêm hiệu quả [13], giảm phù nề gây ra do carageenin ở chuột Các bệnh nhân bị thấp khớp sau khi uống curcumin ñã cho thấy những triệu chứng cải thiện ñáng kể [14] Curcumin cũng thể hiện khả năng kháng viêm thông qua

sự ức chế hoạt ñộng của NF B [15], nhờ ñó ñiều tiết ức chế (downregulate) các enzyme COX-2 và iNOS [16,17]

Nhiều nghiên cứu cũng ñã chứng tỏ khả năng của curcumin trong việc ñiều trị ung thư, trong ñó tác dụng gây tự hủy diệt tế bào theo chương trình (apoptosis) ñóng vai trò quan trọng trong hoạt tính kháng ung thư của curcumin Curcumin gây ra apoptosis và ngăn chặn tiến trình của chu kỳ tế bào, do ñó ức chế sự phát triễn các tế bào ung thư ở

cơ trơn ñộng mạch chủ ở chuột [18] Curcumin gây apoptosis do sai hỏng DNA trong một số dòng tế bào ung thư ở người TK-10, MCF-7 và UACC-62 với vai trò như là chất ñầu ñộc men topoisomerase II Curcumin gây ra apoptosis trong các tế bào bạch cầu HL-60 ở người [19], và ức chế ung thư tế bào biểu mô ruột kết [20], tế bào biểu mô ngực theo nhiều cơ chế khác nhau [21]

Một trong những hướng nghiên cứu ñang ñược quan tâm nhằm làm thay ñổi hoạt tính của curcumin, ñó là biến ñổi cấu trúc curcumin bằng cách tạo các dẫn xuất imine như curcuminoxime, curcuminsermicarbazone, curcuminthiosermicarbazone [22,23], hydrazinocurcumin [24,26,27], hydrazinobenzoylcurcumin [24,27], các dẫn xuất pyrazole và isoxazole curcumin [25,26,27]

Cấu trúc β-diketon cho phép curcumin thực hiện phản ứng ngưng tụ với các amine tạo imine Cơ chế phản ứng như sau:

Trong cơ chế phản ứng này, pH của hỗn hợp phản ứng có ảnh hưởng hết sức quan trọng ñến hiệu suất imine hoá Hiệu suất imine hoá kém khi pH hỗn hợp phản ứng quá acid vì amine bị proton hoá, không tham gia phản ứng ái nhân trong giai ñoạn 1 hoặc khi pH hỗn hợp phản ứng quá base vì không ñủ H3O+ cho giai ñoạn tách nước ra khỏi chất trung gian trong giai ñoạn 2 pH phản ứng tối ưu nằm trong khoảng pH=4-6

Các dẫn xuất dị vòng pyrazole và isoxazole của curcumin ñược tổng hợp bằng phản ứng giữa curcumin và amine, hydroxylamine tương ứng trong dung môi methanol, ethanol…, ñiều chỉnh pH bằng các acid yếu hoặc base yếu như acetic acid, triethylamine, potassium carbonate , phản ứng ñược thực hiện trong khoảng nhiệt ñộ phòng cho ñến nhiệt ñộ sôi của dung môi [24-26]

Nghiên cứu của Sabari Dutta và các cộng sự [23] cho thấy curcuminsemicarbazone (hình 1.2) thể hiện hoạt tính kháng quá trình peroxy hóa lipid của microsome gây ra

bởi bức xạ γ trong thử nghiệm TBARS (Thiobarbiturate reactive substances) tương tự như curcumin Cả curcumin và curcuminsemicarbazone ñều thể hiện hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa này ở mọi liều dùng Kết quả thử nghiệm khả năng khử proton và khử electron thông qua phản ứng với các gốc azide (khả năng khử electron), gốc methyl, peroxyhalocarbon (khả năng khử proton) cho thấy curcumin có tốc ñộ quét các gốc tự do này nhanh hơn curcuminsemicarbazone ðiều này có thể là do sự hiện hiện của nhóm thế hút ñiện tử semicarbazone làm thế oxy hóa của nhóm phenolic trong semicarbazone cao hơn trong curcumin

c

Hình 1.2: Cơ chế bắt gốc tự do của curcuminsemicarbazone

Mặc dù khả năng kháng oxi ở mức ñộ in vitro của curcuminsemicarbazone có phần

thấp hơn curcumin tuy nhiên khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư tuyến vú dòng MCF-7 mạnh gấp 3 lần so với curcumin (theo phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)) [23]

R•

R• = gốc tự do Azide, methyl, halocarbon peroxyl

OH OCH3

OH OCH3

Nhóm nghiên cứu của Joong Sup Shim và các cộng sự [24] ñã tổng hợp một số dẫn xuất hydrazinocurcumin (hình 1.3) và hydrazinobenzoylcurcumin (hình 1.4)

Hình 1.3: Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcuminoid

Hình 1.4: Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcuminoid

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hydrazocurcurcumin có hoạt tính ức chế tế bào BAEC (bovine aortic endothelial cell), ngăn chặn tiến trình angiogenesis (một trong các tiến trình phát triển của ung thư) cao hơn 30 lần so với curcumin (curcumin: IC50=15µM) Hydrazinocurcumin có tác dụng ức chế ngay ở nồng ñộ nanomolar (hydrazinocurcumin: IC50=520nM) và không gây ñầu ñộc các tế bào lành khác Các dẫn xuất hydrazinobenzoylcurcuminoid cũng thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào BEAC tốt hơn các curcuminoid ban ñầu, nhưng kém hơn so với hydrazinocurcumin Ngoài ra, hydrazinocurcumin còn có khả năng ức chế các loại tế bào ung thư khác như NIH3T3 (fibroblast), Chang

Nhóm nghiên cứu của Daniele Simoni và các cộng sự [25] ñã tổng hợp một số dẫn xuất imine của curcumin (hình 1.5) và nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển các tế bào

ung thư ña kháng thuốc của chúng ở mức ñộ in vitro

Hình 1.5: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine của curcumin

Kết quả cho thấy dẫn xuất (8) và dẫn xuất (7) có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư gan ña kháng thuốc HA22T/VGH, tế bào ung thư vú MCF-7, dòng tế bào ung thư vú ña kháng thuốc MCF-7R cao hơn curcumin (bảng 1) Trong ñó, dẫn xuất (8) có khả hủy diệt tế bào ung thư cao hơn cả

Bảng 1.1: Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư (theo phương pháp MTS

24.6±1.8 18.3±1.7 8.4±0.6

29.3±1.7 13.1±1.6 7.1±0.2

51.7±2.2 23.2±2.9 9.2±0.6

26.2±1.6 12.0±2.0 9.3±1.7

46.2±3.9 24.7±2.7 12.9±1.9

Nghiên cứu của C Selvam và các cộng sư [26] cho thấy các dẫn xuất hydrazynocurcuminoid và isoxazole curcumin (dẫn xuất (7) hình 1.5) có hoạt tính

kháng oxi hóa ở mức ñộ in vitro (quét gốc DPPH), ở mức ñộ tiền in vivo (trên ñộng

vật), ức chế cyclooxygenase (COX1/COX2), kháng viêm cao hơn các curcuminoid tương ứng

Nghiên cứu của Satyendra Mishra và các cộng sự [27] cho thấy pyrazole curcumin và

3-nitrophenylpyrazole curcumin có khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium falciparum (ký sinh trùng gây bệnh sốt rét) cao hơn nhiều lần so với curcumin, thể hiện

hoạt tính này ngay ở nồng ñộ nanomolar (curcumin: CQ-S (chloroquine-sensitive: ức chế ký sinh trùng nhạy với thuốc chloroquine) IC50=3.25±0.6µM, CQ-R (chloroquine-resistant: ức chế ký sinh trùng kháng thuốc chloroquine) IC50=4.21±0.8µM; pyrazole curcumin: CQ-S IC50=0.48±0.04µM, CQ-R IC50=0.45±0.07µM; 3-nitrophenylpyrazole curcumin CQ-S IC50=0.87±0.07µM, CQ-R IC50=0.89±0.10µM)

Theo kiến thức của chúng tôi, các nghiên cứu trong nước về curcuminoid chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học và ứng dụng của curcuminoid trong y dược

và thực phẩm, chưa có nhiều nghiên cứu về các dẫn xuất của curcuminoid đặt biệt là dẫn xuất imine của curcuminoid, ựến nay có rất ắt nghiên cứu về lĩnh vực này ựược công bố tại Việt Nam

Nghiên cứu về việc trắch ly curcumin từ củ nghệ vàng có: đào Hùng Cường, Nguyễn đình Anh (đại học đà Nẵng): nghiên cứu chiết curcumin thô từ củ nghệ vàng bằng phương pháp kiềm hóa [34]; Lê Văn Hoàng, đào Hùng Cường, Nguyễn đình Anh (đại học đà Nẵng): nghiên cứu ảnh hưởng của ựiều kiện sấy ựến hàm lượng curcumin của

củ nghệ vàng [35]; đào Hùng Cường (đại học đà Nẵng): chiết tách curcumin từ củ nghệ bằng dung môi thực phẩm [36]; nhóm nghiên cứu của Nguyễn Minh Chắnh và cộng sự (Học viện Quân y) ựã nghiên cứu tách chiết và một số thông số hóa lý của

curcumin từ củ nghệ vàng (Curcuma Longa L.)[37]

Nhóm tác giả đào Hùng Cường, Lê Hải Lợi (đại học đà Nẵng) [38] ựã tổng hợp dẫn xuất pyrazole của phenylhydrazin và curcumin, dẫn xuất isoxazole của hydroxylamin

và curcumin; nghiên cứu hoạt tắnh kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế gốc tự do DPPH của chúng Kết quả cho thấy curcumin và hai dẫn xuất tổng hợp trên ựều có khả năng

kháng oxi hóa và có khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn E.Coli, P.aeruginosa, B.subtillis, S.aureus Tuy nhiên trong nghiên cứu này, các sản phẩm tổng hợp ựược chỉ

ựược tinh chế bằng kết tinh lại và có các tắnh chất vật lý như nhiệt ựộ nóng chảy, màu sắc khác biệt rất nhiều so với các bài báo quốc tế ựã ựược công bố [25,26,27]

1.2 Tắnh cấp thiết của ựề tài

Các dẫn xuất imine curcumin như semicarbazone curcumin, các dẫn xuất pyrazone curcumin (như hydrazinocurcumin, hydrazynobenzoylcurcuminẦ) các dẫn xuất isoxazole có khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ký sinh trùng gây bệnh sốt rét, ựặt biệt là khả năng kháng mạnh nhiều chủng tế bào ung thư Nếu ựược ựầu tư nghiên cứu sâu hơn, các dẫn xuất imine curcuminoid có thể ứng dụng làm thuốc chữa

Hoạt tính của các dẫn xuất imine curcuminoid ñang thu hút sự quan tâm của các nhà hóa học, dược học… trên thế giới Tuy nhiên theo hiểu biết của chúng tôi, các nghiên cứu trong nước về curcuminoid chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học và ứng dụng của curcuminoid trong y dược và thực phẩm, chưa có nhiều nghiên cứu về các dẫn xuất của curcuminoid ðặt biệt là dẫn xuất imine của curcuminoid, ñến nay vẫn rất ít nghiên cứu về lĩnh vực này ñược công bố tại Việt Nam Do ñó việc nghiên cứu thêm về các dẫn xuất này sẽ góp phần tạo tiền ñề cho các nghiên cứu tiếp theo về dẫn xuất imine curcuminoid nói riêng và các hoạt chất có khả năng chống ung thư nói chung

1.3 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu một cách ñầy ñủ hơn các hoạt tính kháng oxi hóa của các dẫn xuất imine curcuminoid Cung cấp thêm những thông tin mới về khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư của các dẫn xuất imine curcuminoid Kết quả nghiên cứu ñạt ñược

sẽ ñịnh hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về các dẫn xuất curcumin và ứng dụng của chúng trong y dược

Chương 2:

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

- Cô lập curcumin từ hỗn hợp curcuminoid trích ly từ củ nghệ vàng

- Nghiên cứu tổng hợp hai dẫn xuất imine curcumin

- Tinh chế và xác ñịnh cấu trúc của các dẫn xuất imine curcumin

- Khảo sát hoạt tính sinh học của imine curcumin và các dẫn xuất curcumin như khả năng quét gốc DPPH, kháng quá trình peroxyde hóa lipid, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư

2.2 Cô lập curcumin

Hỗn hợp curcuminoid 3 thành phần (Viện dược liệu, Bộ y tế, Hà Nội) ñược kết tinh lại

3 lần với hệ dung môi nước/methanol 1/5 Phần tinh thể thu ñược sau quá trình kết tinh ñược sắc ký cột (silica gel, dung môi CH2Cl2) thu curcumin tinh khiết

2.3 Tổng hợp các dẫn xuất imine curcumin

2.3.1 Tổng hợp isoxazolcurcumin (IOZ)

2.3.1.1 Quy trình tổng hợp isoxazolcurcumin

Hình 2.1: Quy trình tổng hợp isoxazolcurcumin

Hoá chất sử dụng: curcumin (phân ñoạn curcumin tinh khiết từ sắc ký cột mục 2.2.),

hydroxylamine hydrochloride (hàm lượng ≥98.5%), sodium acetate (Trung Quốc), ethanol (Chemsol Vina), nước cất

Phương pháp thực hiện: Hoà tan 497 mg hydroxylamine hydrochloride trong ethanol,

chỉnh pH dung dịch về ~5.0 bằng sodium acetate Cho 500mg curcumin vào hỗn hợp trên Thực hiện phản ứng imine hoá trong 16 giờ, ñun sôi hoàn lưu Kiểm tra ñiểm dừng phản ứng bằng bản mỏng aluminium oxide 60 trung tính với hệ dung môi dichloromethane/methanol 97/3 Sau phản ứng, cô giảm áp loại ethanol, rửa sản phẩm bằng trích ly ethylacetate/nước Thu lớp ethylacete, cô giảm áp thu ñược cao sản phẩm

Cucumin, hydroxylamine hydrochloride

Imine hoá

Dung môi ethanol

CH 3 COONa chỉnh pH ñến 5.0

- ðun sôi hoàn lưu

- Thời gian: 16 giờ

Loại dung môi Cô giảm áp

Rửa, chiết Dung môi: ethylacetate + nước

Sắc ký cột

Isoxazolcurcumin

thô Sắc ký cột ñối với sản phẩm thô, thu ñược 306mg isoxazolcurcumin Hiệu suất quá trình tổng hợp isoxazolcurcumin: 61.71%

- Cột sắc ký: ñường kính 25mm, chiều cao aluminium oxide trong cột: 15cm

- Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: CH2Cl2/CH3OH 99/1

ðiều kiện sắc ký bản mỏng:

- TLC Aluminium 60 trung tính, F254 (Merck) ñược hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ

- Bản mỏng 5cmx10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm

- Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2/CH3OH 97/3

- Hiện màu TLC: ñèn UV (254nm/365nm), H2SO4 10% trong ethanol, hơi I2

2.3.2.1 Quy trình tổng hợp HBTC

Hình 2.2: Quy trình tổng hợp HBTC

Hoá chất sử dụng: curcumin (phân ñoạn curcumin tinh khiết từ sắc ký cột mục 2.2.),

2-hydrazinobenzothiazole (Sigma, hàm lượng ≥97%), acetic acid (Trung Quốc), ethanol (Chemsol Vina), nước cất

Phương pháp thực hiện: Hoà tan 449 mg 2-hydrazinobenzothiazole trong methanol, chỉnh pH dung dịch về ~5.0 bằng acetic acid Cho 500mg curcumin vào hỗn hợp trên Thực hiện phản ứng imine hoá trong 24 giờ, 60oC có khuấy trộn Kiểm tra ñiểm dừng phản ứng bằng bản mỏng silica gel 60G, F254 với hệ dung môi dichloromethane/methanol 98/2 Sau phản ứng, cô giảm áp loại methanol, rửa sản phẩm bằng trích ly ethylacetate/nước Thu lớp ethylacete, cô giảm áp thu ñược cao sản

Cucumin, 2-hydrazinobenzothiazole

Imine hoá

Dung môi methanol

CH 3 COOH chỉnh pH ñến 5.0

- Nhiệt ñộ: 60 o C

- Thời gian: 24 giờ

Loại dung môi Cô giảm áp

Rửa, chiết Dung môi: ethylacetate + nước

Sắc ký cột

HBTC

phẩm thô Sắc ký cột ñối với sản phẩm thô, thu ñược 360mg HBTC Hiệu suất quá trình tổng hợp HBTC: 53.33%

- Cột sắc ký: ñường kính 30mm, chiều cao silica gel trong cột: 30cm

- Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: CH2Cl2

ðiều kiện sắc ký bản mỏng:

- TLC Silica gel 60, F254 (Merck) ñược hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ

- Bản mỏng 5cmx10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm

- Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2/CH3OH 98/2

- Hiện màu TLC: ñèn UV (254nm/365nm), H2SO4 10% trong ethanol, hơi I2

(Thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.Hồ Chí Minh)

Ở mức ñộ in vitro, các chất nghiên cứu ñược ñánh giá sàng lọc tác dụng kháng oxy hoá

Khả năng quét gốc tư do DPPH ựược xác ựịnh bằng sự giảm ựộ hấp thu ở λ=515nm, do gốc DPPH bị khử bởi chất kháng oxy hoá (AH)

Hình 2.3: Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá

Chất ựối chứng: Vitamin C (Acid L-ascorbic)

Phương pháp thực hiện: 0.5ml mẫu thử (hoặc 0.5ml methanol ựối với mẫu trắng ựối

chứng) ựược pha loãng ở các nồng ựộ khác nhau trong methanol ựược cho phản ứng với ựồng lượng DPPH 1mM trong methanol và thêm methanol cho vừa ựủ 4 ml Các ống nghiệm ựược ựậy kắn, lắc ựều và ựể trong tối ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút, sau

ựó ựo mật ựộ quang (OD) ở bước sóng λ=515nm Xây dựng ựồ thị phụ thuộc %HTCO

(công thức 2.1) theo nồng ựộ chất hay dung dịch cần ựo, từ ựó xác ựịnh nồng ựộ của

mẫu thử tương ứng với giá trị %HTCO = 50% đó chắnh là giá trị IC50 của mẫu thử, so sánh với IC50 của chất ựối chứng là trolox

Hoạt tắnh kháng oxy hoá (HTCO) ựược tắnh theo công thức (2.1):