tìm hiểu về 4 sự kiện “ngô” đã được chứng nhận biến đổi gen ở vn

 Dòng ngô sử dụng trong chuyển gen tạo sự kiện MON 89034 là dòng thuần Dòng thuần LH172 được biết đến như là một trong số ít các dòng ngô có khả năng thích ứng với chuyển gen bằng vi kh

Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Viện công nghệ sinh học_công nghệ thực phẩm

Đ tài: ề Tìm hiểu về 4 sự kiện “Ngô” đã được chứng nhận biến

đổi gen ở VN Nhóm SVTH: Doãn Thị Yến

Sự kiện Ngô MON89034

Chứng nhận AT như thế nào?

 27/8/2014 , Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường đã ban hành qđ số BTNMT cấp Giấy chứng nhận an toàn sinh học cho ngô biến đổi gen mang sự kiện MON 89034 kháng sâu bộ cánh vảy của Công ty TNHH Dekalb Việt Nam

1836/QĐ- Đây là sự kiện biến đổi gen đầu tiên được cấp Giấy chứng nhận an toàn sinh học tại Việt Nam

 Trước khi được cấp Giấy chứng nhận an toàn sinh học tại Việt Nam, sự kiện MON

89034 đã được cấp phép phóng thích vào môi trường tại 8 quốc gia trên thế giới, bao gồm: Canada (2008), Hoa Kỳ (2008), Nhật Bản (2008), Brazil (2009),

Áchentina (2010), Nam Phi (2010), Phillipines (2010) và Honduras (2010)

http://www.agbiotech.com.vn/vietnam/

 Sự kiện MON 89034 với sự biểu hiện của 2 protein Cry1A.105 và Cry2Ab2 mang đặc tính kháng đối với một số loài sâu hại bộ cánh vảy (Lepidoptera) như sâu đục thân (Ostrinia furnacalis), sâu đục bắp

(Helicoverpa armigera) và sâu khoang (Spodoptera litura)

 Nguồn gốc gen cho: vi khuẩn Bacillus thuringiensis, sử dụng plasmit

vector nhị thể PV-ZMIR245

 Dòng ngô sử dụng trong chuyển gen tạo sự kiện MON 89034 là dòng thuần Dòng thuần LH172 được biết đến như là một trong số ít các dòng ngô có khả năng thích ứng với chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và khả năng tái sinh cao

 Vật liệu sử dụng để chuyển gen là các phôi non của dòng LH172 được phân lập riêng rẽ

http://www.agbiotech.com.vn/vietnam/

Thông tin liên quan đến phương pháp chuyển gen:

 Sử dụng plasmit vector nhị thể PV-ZMIR245

 Plasmid vector PV-ZMIR245 là một vector chuyển gen nhị thể gồm 2 T-DNA riêng biệt

 T-DNA thứ nhất, được gọi là T-DNA I, có chứa 2 cấu trúc biểu hiện gen cry1A.105 và cry2Ab2

 T-DNA thứ hai, được gọi là T-DNA II, chứa cấu trúc biểu hiện gen nptII mã hóa enzyme

neomycin phosphotransferase kháng neomycin và paromomycin.

 Sau giai đoạn nuôi ủ trên môi trường nuôi cấy, các phôi non được chuyển sang môi trường nuôi cấy chọn lọc có chứa chất kháng sinh carbenicillin (để loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium), và paromomycin (để loại bỏ các tế bào không được chuyển gen) Trên môi trường chọn lọc này, chỉ những phôi có chứa cấu trúc chuyển gen (T-DNA II hoặc/và chứa tổ hợp T-DNA I + T-DNA II) có khả năng sống sót và tái sinh

Các tế bào thu được này sau đó được tiếp tục nuôi cấy trong những môi trường chọn lọc nhiều lần để tạo thành sự kiện ngô chuyển gen MON 89034 theo như quy trình đã được mô tả bởi Armstrong và Phillips (1998)

http://www.agbiotech.com.vn/vietnam /

Quy trình chuyển gen tạo sự kiện MON

89034, ngô Bt kháng sâu bộ Cánh vảy

http://www.agbiotech.com.vn/vietnam /

 So sánh với giống ngô truyền thống

 Có khả năng chống sâu bọ cánh vẩy

 Sinh trưởng và phát triển vượt trội hơn

 Có giá trị dinh dưỡng tương đương

Tính an toàn và giá trị dinh dưỡng này được khẳng định

thông qua các chỉ tiêu sau :

 Cấu trúc và chức năng đoạn gen chèn vào mang 2 cấu trúc biểu hiện gen 32

cry1A.105 và cry2Ab2 đã được xác định rõ ràng: Hệ gen sự kiện MON 89034 chỉ chứa duy nhất 1 đoạn chèn vào, đoạn chèn vào duy nhất này có đầy đủ các nguyên

sử dụng 2 protein này làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

 Kết quả phân tích thành phần và hàm lượng dinh dưỡng của 61 hợp chất chính trong hạt và trong thân ngô cho thấy sự kiện MON 89034 có thành phần hợp chất

và mức độ dinh dưỡng tương tự ngô truyền thống sử dụng làm giống nền

S ki n ngô NK603 ự ệ

 Giống ngô chịu thuốc trừ cỏ Roundup bản chất glysophate

 Với cây trồng thông thường, glyphosate sẽ ức chế enzyme EPSPS (quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp axit amin cần thiết) trong cây

=> gây chết.

Cây trồng nhận gen : Ngô,

được sử dụng lâu đời, an toàn

Nguồn gốc gen cho

Tính chống chịu glyphosate của ngô NK603 là kết quả của việc đưa vào cây một gen mã hóa tính chống chịu với glyphosate 5-enoylpyruvylshikimate-3-phosphate synthase từ vi khuẩn

Agrobacterium sp chủng CP4 (CP4 EPSPS)

Gen chuyển vào là gen

mã hóa cho enzyme EPSPS

từ Agrobacterium CP4 , enzyme từ vi khuẩn này liên kết yếu với glyphosate

Thông tin liên quan t i ph ớ ươ ng

• Plasmid mang gen: PVZMGT32

• Phương pháp bắn hạt gia tốc

• Đã chứng minh được đoạn gen chuyển vào hệ gen

của cây chủ là không bị sắp xếp lại, và ổn định qua

các thế hệ, tuân thủ theo định luật di truyền của

Menden

 Thông tin về sự biểu hiện (hàm lượng được tạo ra) của

protein tái tổ hợp EPSPS: thấp trong các phần của cây: thân,

rễ, lá…

• Khả năng gây độc và dị ứng của EPSPS: từ trình tự

axit amin của protein này, so với trình tự axit amin

trên cơ sở dữ liệu các protein gây độc/gây dự ứng,

không thấy sự tương đồng về trình tự khả năng gây

So sánh với ngô truyền

thống

 Phát triển tương tự

 Các số liệu đánh giá an toàn chứng minh thực phẩm ,thức ăn chăn

nuôi từ sự kiện NK603 là an toàn và có giá trị dinh dưỡng tương tự

 Kết quả phân tích thành phần, hàm lượng dinh dưỡng của hợp chất trong hạt và thân ngô cho thấy sự kiện NK603 có thành phần hợp chất

và mức độ dinh dưỡng tương tự ngô truyền thống

 Protein CP4EPSPS và EPSPS L214P trong sự kiện NK603 không gây dị ứng/ngộ độc khi sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

 Khả năng phơi nhiễm 2 protein CP4EPSPS và EPSPS L214P đối với con người và động vật không tồn tại nguy cơ ảnh hưởng bất lợi đến sức khỏe khi sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

 Khả năng phát tán gen của ngô chuyển gen tới ngô truyền thống thấp, không gây thay đổi bất lợi nào với môi trường và đa dạng sinh học

Khác biệt

Đã được chấp nhận ở nhiều quốc gia

Quy trình đăng ký cấp giấy chứng

nhận an toàn sinh học

Sự kiện ngô BT11

Sự kiện chuyển gen: Bt11

Mã nhận diện duy nhất: SYN-BTØ11-1

Giống nền sử dụng: NK66

Đặc điểm:

 Chống chịu sâu đục thân và các loại thuốc trừ cỏ có chứa hoạt chất Glufosinate ammonium

 Được sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi

 Đăng ký khảo nghiệm bởi công ty TNHH Syngenta Việt Nam

Ấu trùng ngay sau khi nở

đã ăn lá cây ngô

Thân cây ngô bị sâu đục thân phá hoại và cờ bị

gãy đổ

Thời gian chứng nhận sử dụng MIR162 các nước trên thế giới

Ngu n g c gen ồ ố

 Vi khu n B ẩ

thuringiensis

Vi khu n ẩ Streptomycesvirid ochromogenes

Gi ng ố ngô n n ề NK66 Protein

CryIAb

Protein PAT

Quy trình chuyển gen tạo sự kiện

ngô BT11

- Ngô Bt11 được tạo ra từ dòng bố mẹ ban đầu được chuyển gen sử dụng plasmid pZO1502 mang gen Btk và Pat, phương pháp

chuyển gen dung hợp tế bào trần (protoplast transformation) sau

đó tái sinh cây

- Vị trí đoạn gen được chuyển: Đoạn gen được chèn vào nằm ở dọc

 Các phân đoạn sau đã được chèn vào plasmid pUC18, để thành plasmid pZO1502, bao gồm phân đoạn gen 35S-1/intron/Btk HD-1/nos và phần đoạn gen 35S-2/intron/pat/nos

 Gen Btk là một phiên bản biến đổi của toàn bộ chiều dài gen CryIA(b) Sự thay đổi gen CryIA(b) bao gồm những thay đổi trên ADN và được xén bớt để tăng sự biểu hiện trên cây

 Gen Pat (phosphinothricin acetyl transferase) được dòng hoá từ Steptomyces viridochromogenes chủng Tu494 Đoạn ban đầu được thay đổi để tối thích sự biểu hiện ở thực vật

 Hai gen Btk và pat đều sử dụng promoter 35S có nguồn gốc từ

virus khảm bông CaMV để khởi động biểu hiện liên tục cho gen và phân đoạn IVS có nguồn gốc từ ngô để tăng cường sự biểu hiện của gen trên thực vật

Đánh giá nguy cơ trôi gen, phát tán gen của ngô Bt11 sang cây trồng không chuyển gen

 Nguy cơ trôi gen đến các loài hoang dã tương thích về mặt sinh sản

ở Việt Nam được đánh giá là không có khả năng xảy ra do các loài

hoang dại cùng chi Zea không tồn tại ở Việt Nam.

 Xét về mặt cấu tạo, thời gian phát tán phấn của ngô diễn ra ngắn và

khoảng cách không gian tương đối hẹp cũng làm giảm nguy cơ

phát tán gen

 Về mặt truyền thống canh tác, ngô trồng ở Việt Nam được thu hoạch triệt để, không còn sót lại sau mỗi mùa vụ, 95% diện tích trồng ngô Việt Nam hiện nay là ngô lai, do đó đa số nông dân không còn tập quán tái sử dụng hạt thương phẩm làm ngô giống cho vụ sau.

Đánh giá nguy cơ trôi gen sang các

loài vi sinh vật

 Rất khó có khả năng ADN tái tổ hợp được truyền từ ngô Bt11

tới các loài vi sinh vật trong đất hoặc trong bộ máy tiêu hoá của người và động vật

 Biểu hiện của gen Cry1Ab và gen Pat trong ngô Bt11 được điều khiển bởi promoter eukaryote và promoter này hầu như

không hoạt động trong môi trường tế bào prokaryote.

 Với người và động vật, ADN còn bị phân hủy nhanh trong bộ máy dạ dày/ruột nên quá trình truyền gen nguyên vẹn càng

không thể diễn ra

Nguy cơ ảnh hưởng đến môi trường

tự nhiên

 Với ngô Bt11, gen Btk và Pat được chuyển lo ngại có thể tồn tại

và xâm nhập vào các quần thể tự nhiên, nó có thể làm tăng sự đa dạng di truyền hoặc xâm lấn dẫn đến sự tuyệt chủng của các

quần thể hoang dại.

 Nguy cơ này được nghiên cứu, xem xét qua 3 vụ khảo nghiệm

hạn chế và một vụ khảo nghiệm diện rộng tại các 4 vùng trọng

điểm ngô ở các tỉnh thành khác nhau ở Việt Nam.

 Tất cả các khảo nghiệm đều cho kết quả thấy ngô Bt11 có đặc

điểm nông sinh học, hình thái là hoàn toàn tương tự với giống cùng dòng không chuyển gen NK66.

 Các đánh giá về mức độ nhiễm một số bệnh hại ngô chính như

bệnh khô vằn, gỉ sắt, đốm lá lớn, đốm lá nhỏ cũng cho thấy tính

mẫn cảm với các loại bệnh này là tương đương giữa ngô Bt11

và giống ngô thường NK66.

 Ngô Bt11 không mang các đặc tính của cỏ do vậy không có

nguy cơ trở thành cỏ dại xâm lấn môi trường tự nhiên

Nguy cơ ảnh hưởng đến hệ sinh thái

 Nghiên cứu đánh giá mức độ phong phú về thành phần loài; tính đa dạng, đồng đều; chỉ số ưu thế của quần thể loài chân khớp trong hệ sinh thái ruộng ngô có nguy cơ phơi nhiễm với protein Cry1Ab, và diễn biến mật độ của bốn nhóm chính

 Nhóm sâu hại (nhóm miệng nhai, nhóm chích hút)

 Nhóm thiên địch (bắt mồi ăn thịt, )

 Nhóm thụ phấn, ăn phấn

 Nhóm sinh vật đất (bọ đuôi bật collembola)

R p ệ Ru i ồ

 Ngô biến đổi gen mang sự kiện Bt11 có các đặc tính nông sinh học của giống ngô truyền thống, không mang nguy cơ trở thành cỏ dại xâm lấn,

không tác động đến quần thể sinh vật không chủ đích Ngô Bt11 hoàn toàn không gây ảnh hưởng bất lợi đến môi trường tự nhiên và đa dạng sinh học

Sự kiện ngô MIR162

Tên khoa học: Zea mays L (Maize)

Mã nhận diện duy nhất: SYN-IR162-4

Đặc điểm :

 kháng sâu bọ hại bộ cánh vẩy

 Chuyển đổi cây trồng Agrobacterium tumefaciens qua

trung gian

 Được sử dụng làm thực phẩm cho ngươi ( dạng tươi,

nghiền khô hoặc dạng tinh dầu) và làm thức ăn chăn

nuôi

 Đăng ký khảo nghiệm hạn chế bởi công ty TNHH

Syngenta Việt Na

Thời gian được chứng nhận sử dụng MIR162 ở các nước trên

thế giới

20

Escherichia coli

phosphomannose isomerase (PMI)

Ngô MIR162 biểu hiện 2 protein được mã hoá bởi hai gen chèn vào hệ gen của ngô:

- Gen Vip3Aa20, mã hoá protein VIP3Aa20 có nguồn gốc từ vi

khuẩn gram dương Bacillus thuringensis có hoạt tính kháng côn trùng bộ cánh vảy, là gen chủ đích

- Gen Phosphomannose isomerase (pmi), mã hoá protein PMI

có nguồn gốc từ vi khuẩn gram dương Escherichia coli được sử dụng với vai trò là chỉ thị chọn lọc trong quá trình biến nạp

 Ngô MIR162 được tạo thành thông qua mầm ngô chưa trưởng

thành Z mays dòng NP2500 x NP2499 thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens (chủng LBA4404).

Quy trình chuyển gen tạo sự kiện

ngô MIR162

 Gen vip3Aa1 của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, chủng AB88 được

tách và cải biến vị trí axit amin lysine 284 thành glutamine.

 Gen mã hóa cho protein cải biến này được đổi tên thành vip3Aa19 và được biến nạp vào plasmid pNOV1300

 Gen vip3Aa19 được cải biến để thay thế axit amin methionine ở vị trí

129 thành isoleucine và mang tên vip3Aa20

 Plasmid được dòng hóa và nhân lên trong vi khuẩn E.coli DH5α

 Tách plasmid và biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 mang Ti-plasmid đã loại bỏ T-AND.

 Ti-plasmid này chứa gen vir mã hóa protein cần thiết cho việc biến nạp

đoạn gen chuyển trong pNOV1300 vào tế bào thực vật để thực hiện

việc chèn gen mới vào hệ gen ngô.

Đánh giá khả năng gây độc tố của các chất mới là

sản phẩm biểu hiện của gen chuyển

 Protein Vip3Aa20

 Trình tự Vip3Aa20 không giống với bất kỳ trình tự acid amind của

protein trong danh sách protein gây độc cho người và động vật

 Nghiên cứu độc tính cấp tính qua đường miệng ở chuột đã chứng minh

Vip3Aa20 không gây độc cho chuột

 Protein PMI

 Kiểm tra trình tự của NCBI Entrez cho trình tự PMI (391 axit amin)

cho kết quả protein này không giống với bất kỳ trình tự của protein gây độc cho người và động vật được biết đến

 Nghiên cứu độ độc cấp tính trên chuột được thực hiện bằng phương pháp cho ăn qua đường miệng với thức ăn là protein tái tổ hợp từ vi sinh vật

 Không gây ra các tác dụng phụ khi cho chuột ăn với liều cao nhất được

dùng trong thí nghiệm đối với người và động vật

Đánh giá khả năng gây dị ứng của các chất mới là sản

phẩm biểu hiện của gen được chuyển

 Nguồn gốc của protein mới

Protein Vip3Aa20 có nguồn gốc từ vi khuẩn B thuringiensis

Protein PMI mã hóa bởi gen pmi phân lập từ vi khuẩn E.coli

 So sánh tương đồng về trình tự acid amin của protein mới với chất gây dị ứng

Peptide 80-amino acid của Vip3Aa20 và PMI không tương đồng với trình tự

acid amin của các protein gây dị ứng nào Do vậy protein Vip3Aa20 và PMI hay ngô MIR162 không có khả năng gây dị ứng cho người và động vật

 Khả năng phân hủy in vitro của protein

Protein Vip3Aa20 và PMI dễ dàng bị phân hủy trong dạ dày và ruột của động

vật có vú dẫn đến việc dễ dàng tiêu hóa các protein này

 Tính bền với nhiệt của protein

Vip3Aa20 không bền khi ở nhiệt độ 65ºC trở lên

PMI là không bền khi đun nóng ở nhiệt độ trên 37ºC

thực phẩm hay thức ăn cho động vật

Nghiên cứu gà thịt ăn thức ăn chế biến từ ngô MIR162 trong 44 ngày

để đánh giá khả năng sống sót, tăng trọng và chuyển hóa thức ăn tới trọng lượng gà.

 Không có tác động bất lợi nào từ ngô MIR162 đến sinh trưởng,

phát triển, tỉ lệ tử vong của gà khu so sánh với đối chứng

 Gia cầm không có sự khác biệt đến tỉ lệ sống, sinh trưởng, tăng

trọng và giá trị dinh dưỡng của thịt gà khi so sánh với gà ăn thức ăn được chế biến từ ngô truyền thống.

 Khả năng hình thành chất mới

Ngoài hai protein mục tiêu Vip3Aa20 và PMI, ngô MIR162

không có khả năng hình thành các hợp chất mới

 Ngoại trừ việc có mặt của protein Vip3Aa20 và PMI, ngô

MIR162 hoàn toàn giống với ngô thông thường

Đánh giả khả năng hình thành các hợp chất mới khả năng gây bệnh hoặc các tác động bất lợi khác đến sức khoẻ con người và vật nuôi

So sánh với cây truyền thống

 Thành phần hóa học trong lá và hạt ngô bao gồm chất khoáng, axit amin, axit béo, vitamin, các chất ức chế dinh dưỡng và các

chất chuyển hóa thứ cấp nằm trong khoảng biến thiên tự

nhiên của các giống ngô thông thường

 Khả năng chuyển hóa các thành phần dinh dưỡng của nó trong

cơ thể người và động vật là hoàn toàn giống như ngô thường

không chuyển gen

 Ngô MIR162 không mang đặc tính sinh học nào khác biệt so

với ngô cùng dòng không chuyển gen

 Khả năng chống chịu côn trùng, sâu bọ hại cánh vẩy tốt hơn

 Năng suất cao hơn