Luận văn Khảo sát khả năng chống oxy hóa của một số dược liệu dân gian bằng phương pháp DPPH

TOM TAT Khả năng chống lại các gốc tự do là một hướng nghiên cứu hiên nay để tìm ra các dược liệu dân gian có thể chống lại quá trình oxy hóa của co thé.. Các vấn đề cần giải quyết để có

TRUONG DAI HOC CAN THO

KHOA KHOA HOC TU NHIEN

BO MON SINH HOC -~o Lics -

LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC CHUYEN NGANH SINH HOC

Đề tài:

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHÓNG OXY HÓA CỦA

MỘT SÓ DƯỢC LIỆU NHÂN GIAN

BANG PHUONG PHAP DPPH

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÓP: SINH HỌC K34

> Cần Thơ, Tháng 3/2012 <

LOI CAM TA

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, em luôn nhận được sự quan tâm, giúp

đỡ tận tình của quý Thầy cô, bạn bè cũng như từ gia đình

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy Trần Thanh Mến và

cô Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức và động viên em trong suốt thời gian học cũng như trong thời gian thực hiện đề tài này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý Thầy Cô khoa Khoa Học Tự Nhiên nhất là

quý thầy cô thuộc Bộ môn Sinh học đã tận tình hướng dẫn, động viên em

Xin gửi lời cảm ơn đến Anh Trần Văn Bé Năm, Chị Liễu Như Ý và các anh chị

cán bộ Phòng Sinh Học Phân Tử, Viện NC & Phát triển Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Xin cảm ơn bạn Quách Tú Huê đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn và trong quá trình học tập

Chân thành cảm ơn tập thể lớp Sinh Học K34 đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Em xin chúc quý Thầy Cô cùng các bạn sinh viên thành công và đồi đào sức

khỏe

Nguyễn Thanh Diễm

LOI CAM KET

Tôi xin cam kết Luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu

của tôi dưới sự hướng dẫn của Thầy Trần Thanh Mến Các số liệu và kết quả có

được trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ

luận văn nào trước đây

Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện

MUC LUC

LỜI CẢM TẠ 5-5 SE 12E1511121121111111211 21111111 T11 1101 112112111 1 tro i LỜI CAM KÉTT - 5-52 S9 EEEE12119112111211211 1111111211211 1111121101111 111gr iii MUC LUC woeccesceesssesseessessssesssessssssecssessssssesssesssecsvesansssecasecssesssessuesasesssecaneasesesecasecs iv DANH SACH HINH 0 ccsccssssssesssessesssessssesssecsecsesssessessssssessessessesssseessessessseseesees vii DANH SÁCH BANG Wu esecsscssesssessesssessessessesseesseeses Error! Bookmark not defined DANH SÁCH CHU VIET TAT woiceescssscsscessessesssessesssssessesssessessecsusssesaveasesscaresseeseees ix TÓM TẮTT 52-56 t1 152112112111211211111111211 11 11 T1 1 1 1 1 1 11a 1 tre x ABSTRACT ove cecesssesssssseesssesssessecssecssessvssssesssesssessnesssessesssecssesssesssecasesssessteceesasecasees xi CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU - 2-22 9 9SE9EE£EEE2EE9EEE2112E157111211111 2111111 1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIBU woicceecescceccescessesssessessessessessesseessessessessessseanes 3

2.1 Sơ lưc về bệnh lão hóa và các bệnh liên quan - 2-2 52 + £2£++£xerxzes 3

2.1.1 Bệnh lão hóa -2¿-5sc S221 9E11271521112711221121112112111 11111111 xrrey 3

2.3.1 Giới thiệu về chất chống oxy hóa 2: 5c tt 2E 2EE2E2EEEEEerrrrree §

2.3.2.1 Chất chống oxy hóa nội sinhh 2- -©5¿+s+2E2EE£EEtEESEEEEkrrrrrerrk 9

2.3.2.2 Chất chống oxy hóa ngoại sinh

2.3.2.3 Các chất chống oxy hóa được nghiên cứu ll 2.4 Giới thiệu về một số dược liệu dân 10 13

iv

"ăn tồn ốố ố 13

"hàn in 13 2.4.1.2 Thành phần hóa học của cây Öi 2222+22+2222EE222E22212222.ze 14 2.4.1.3 Dược tính của Ôi ¿ 222: 2x22 2211122112111 ke 14

bo nh n 16

2.4.4.2 Dược tính của Nhàu 0 11122111 12111121 1111011110111 811111 8 re 17

2.5 Giới thiệu về trolOX -2 +22++2EEESEE122711271127112112212 2212221 18

3.2.3 Chuẩn bị cao chiẾT 5c Se tk 1E EE1E11111111111 0111101111 11 11p 23

3.2.4 Chuẩn bị DPPIH : 2- 22 ©2+22E22EE22EEE212271127112711211271121 2E cre 23

3.2.5 Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa của Trolox24

3.2.6 Khảo sát nồng độ ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa của Trolox.24

3.2.7 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết cao thực vật 24

Vv

3.2.8 Xử lý số OU acces cccececssssssessssssesssssessessessnsesesssssuseseesessseuessscsuseseesesseeees 25 CHƯƠNG 4: KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN . -5- 52 SE+E2 221211221211 26

4.3 Thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hóa của Trolox theo thời gian 26 4.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hóa của trolox theo nồng độ 28

4.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hóa của địch chiết cao của một số

PHU LUCoiecessccssssssssssssssssssssossessssesssssssesssssssssssessssssessassssussssasseesssscsseesssecssesessecesses 48

vi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Nguồn gốc của gốc tự O ¿2 +2E+EE£2E22E2E12E12112112712112221 21 re 7 Hình 2: Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa -2- 22 2+2s¿2x+2zz+zxszse2 9 Hình 3: Cấu trúc của Viatmin E và Vitamin C ¿2cx+ccxcccrrrerrrrerrrre 12

Hình 4: Cấu trúc hóa học của các loại Carotenoid - ¿+ s+s+zszezxzzezszzzrszez 13 Hình 5: Cấu trúc hóa học của Melafonin 2: -St+Ex+EvEEEEESEE2EtEEEEESEEsrrrreree 13 Hình 6: Cấu trúc hóa học của Vitamin E và TrÏOX 2 2+s+zs+s£zzerszzzrszez 20 Hình 7: Cấu trúc hóa học của AB TS ¿+22 +E+E+ESEE2ESEEEEEEEEEEEEEEEErrkrkrrerrree 20

Hình 8: Cấu trúc hóa học của DPPH 2255 cntttthrnrreie 22

Hình 9: Cấu trúc hóa học của DPPH sau khi phản ứng với Antioxidant AH 23

Hình 10: Máy đo quang phổ 2 se e‡SềSEEEEE12111211211 2111111211211 1x xe 26

0000 6060-00).0/ 010157 26

Hình 12: Sự thay đổi khả năng làm sạch DPPH của Trolox ở các nồng độ theo thời

Hình 14: Khảo sát khả năng làm sạch DPPH của cao chiết 14 Oi ở các nồng độ khác

Mhau duc do 6 SUTIN oc 34 33

Hình 15: Khả năng làm sạch DPPH của cao chiết Khổ qua ở các nồng độ được đo ở

vii

Hình 17: Khả năng chống oxy hóa của cao chiết Nhàu ở các nồng độ được đo ở

Hình 1§: Sự thay đổi khả năng làm sạch DPPH của các cao chiết và đối chứng dương theo nồng độ - - 2 + S2 EE21211211111211115 11511111111 1111 1x 1g, 38

viii

DANH SACH CHU VIET TAT

CAT: Catalase enzyme

DNA : Deoxyribonucleic acid

GPX: Glutathione peroxidase

NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase

RNA: Ribonucleic acid

RNS: Reactive nitrogen species

ROS: Reactive oxygen species

RSS: Reactive sulfua species

SOD: Superoxide dismutase

TOM TAT

Khả năng chống lại các gốc tự do là một hướng nghiên cứu hiên nay để tìm ra các dược liệu dân gian có thể chống lại quá trình oxy hóa của co thé Dé tài khảo sát khả năng làm sạch các gốc tự do của cao chiết lá Ôi (Psidium guajava), Lá dứa

(Pandanus amaryllifolius), Khổ qua (Momordica charamia L), rễ Nhàu (Morinda cir/olia L) được thực hiện nhằm tìm ra một số loài thực vật có khả năng chống oxy

hóa Sự làm sạch gốc tự do của các cao chiết được khảo sát ở các nồng độ 400 pg/mL, 300 ug/mL, 200 ng/mL, 150 pg/mL, 100 ng/mL, 75 pg/mL, 50 ug/mL, 37,5 ug/mL, 25 pg/mL, 12,5 ug/mL, 0 wg/mL và kết quả thu được sau khi đo ở bước sóng 517 nm Kết quả nghiên cứu cho thấy, 4 mẫu cao chiết đều có khả năng chống

oxy hóa nhưng ở các mức độ khác nhau Cao chiết lá Ôi có khả năng chống oxy hóa

ở tất cả các nồng độ khảo sát và cao hơn đối chứng dương từ nồng độ 150 pg/mL đến 400 ug/mL Cao chiết Lá đứa có khả năng chống oxy hóa ở tất cả các nồng độ

khảo sát và cao hơn đối chứng dương ở nồng độ 400 ug/mL Cao chiết Khổ qua có

khả năng chống oxy hóa ở tất cá các nồng độ khảo sát nhưng còn rất thấp so với nhóm đối chứng dương và cao chiết lá Ôi và Lá đứa Cao chiết Nhàu có khả năng chống oxy hóa ở tất cả các nồng độ khảo sát nhưng còn rất thấp so với nhóm đối chứng dương và các cao chiét con lai

Từ khóa: cây Ôi, Lá dứa, Khổ qua, Nhàu,, DPPH, Trolox, Chống oxy hóa, gốc tự

do

ABSTRACT The research of antioxidant activity is a remarkable way which can scavenge free radicals in the body This objective focus on the antioxidant activity and the free radicals removing ability by using extracts of Psidium guajava, Pandanus amaryllifolius, Mormodica charantia and Morinda citrifolia Four plants are surveied at the concentrations of 400, 300, 200, 150, 100 ug/mL by DPPH assay to

estimate the scavenging free radicals of four ethanol extracts Then the mixture is

mesured at 517 nm by using spectrophotomer.The result also demonstrates that the

antioxidant activity of four extracts on DPPH" radicals is proportional with the

concentrations The scavenge free radicals of Psidium guajava extract is higher than

that of Trolox at concentrations of 400, 300, 200, 150 and 100 ug/mL The

antioxidant activity of Psidium guajava extract highest at concentrations of 400 pg/mL with 91,36% The antioxidant activity of Pandanus amaryllifolius extract is

higher than that of Trolox at concentrations of 400 ug/mL with 74,05% The

antioxidant activity of Mormodica charantia and Morinda citrifolia extract are lower than that of Trolox at all concentrations The antioxidant activity of

Mormodica charantia L extract is highest at concentration 400 ug/mL with 16,15% The scavenge free radicals of Morinda citrifolia L extract is highest at

concentration 400 wg/mL with 6,19% The result Psidium guajava and Pandanus

amaryllifolius extract are good antioxidants by DPPH assay at in vitro level

CHUONG 1 GIOI THIEU

Lão hóa là một trong những vấn đề về sức khỏe mà con người rất quan tâm

Khi cơ thể bị lão hóa, có rất nhiều thay đổi sinh lý diễn ra ảnh hưởng đến sức khỏe như: giám khả năng thị giác, thính giác, tiêu tiểu không kiểm soát, giảm trí nhớ và

ánh hưởng rõ ràng nhất là những biểu hiện trên da Những bệnh nghiêm trọng khác

gồm loãng xương, viêm khớp, bệnh tim mạch, tiểu đường, ung thư, Alzheimer,

parkinson, đục thuý tinh thể, cũng liên quan đến quá trình lão hóa (Curtis et al., 2011) Các căn bệnh nguy hiểm liên quan đến lão hóa càng thúc đây con người tìm cách chống lại quá trình lão hóa Tuy nhiên, muốn chống lại quá trình lão hóa thì

phải biết rõ nguyên nhân gây ra quá trình lão hóa Cho đến thời điểm hiện tại thì

nguyên nhân của quá trình lão hóa vẫn còn đang là vấn đề gây tranh cãi trong giới khoa học, có rất nhiều thuyết về nguyên nhân gây lão hóa như: thuyết di truyền,

thuyết kích tố, đột biến gen, được các nhà khoa học đưa ra nhưng vẫn chưa được

chấp nhận

Năm 1954, Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là khoa học

gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra

những tổn thương cho tế bảo Trước đó, gốc tự do được xác định chỉ ở ngoài cơ thé

Và để giải thích nguyên nhân của lão hóa cũng như các bệnh khác thì thuyết về các

gốc tự do đang được các nghiên cứu chấp nhận nhất

Các vấn đề cần giải quyết để có phương pháp chống lão hóa tốt: 1) hiểu biết chính xác về cơ chế quá trình oxy hóa là nguyên nhân chính của quá trình lão hóa, 2) xác định các dấu hiệu của tình trạng oxy hóa và chất chống oxy hóa, 3) xác định một hướng điều trị, trong đó quan trọng nhất là bố sung chất chống oxy hóa như thế nào

để có lợi, 4) kiến thức phân tử sâu hơn về các chống oxy hóa vì trong một số điều

kiện hoạt động chúng có thể làm tăng quá trình oxy hóa

Hiện nay nhu cầu sử dụng các loại thuốc chống lão hoá ngày càng tăng lên Nhưng các loại thuốc làm đảo ngược đồng hồ sinh học này chưa có được những

Trang |

bằng chứng đáng tin cậy về tác dụng của nó cũng như các tác dụng phụ có thể có (Jay Olshansky, 2010) Để tránh các tác dụng phụ không mong muốn mà các loại thuốc trên thị trường gây ra, các nghiên cứu đang hướng đến việc tìm ra nguồn dược liệu tự nhiên có khả năng chống oxy hóa

Việt Nam thuộc khu vực nhiệt đới gió mùa nên có được nguồn thiên nhiên đa dạng, trong đó có rất nhiều loài thực vật có được tính trị bệnh Nhiều thực vật có

chứa các hợp chất có khả năng chống oxy hóa đã được nghiên cứu như: Vitamin E,

Vitamin C, j-carotene, Để tìm kiếm, phát triển và bảo tồn nguồn được liệu tự

nhiên này, dé tài “Khảo sát khả năng chống oxy hóa của một số dược liệu dân gian bằng phương pháp DPPH” được xem là rất cần thiết trong việc tìm ra một số loài thực vật có khả năng chống oxy hóa

Mục tiêu của đề tài là khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá Ôi (Psidum guajava L), lá Dứữa (Pandanus amaryllijfolius), rễ Nhàu (Morinda cirijfolia

L) va Khé qua (Momordica charantina L) trong dung méi ethanol bang phuong

phap DPPH in vitro

Trang 2

CHUONG 2 LUQC KHAO TAI LIEU

2.1 Sơ lược về bệnh lão hóa và các bệnh liên quan

Hon 300 lý thuyết đã được đề xuất đề giải thích quá trình lão hóa nhưng không được chấp nhận (Medvedev, 1990) Tuy nhiên, đề nghị ban đầu của Denham

Harman (1957) về các gốc tự đo (đặc biệt là superoxide Oz°—, hydroxyl OH-, va hydrogen peroxide HạOz») có mối liên hệ với quá trình lão hóa đã được các nhà khoa học chấp nhận như là một lời giải thích là có thể các phản ứng hóa học liên

quan đến gốc tự đo là nguyên nhân của sự lão hóa Một mô hình tam giác bên trong

tế bào đã được mô tả bao gồm: cân bằng oxy hoá, quá trình oxy hóa, chất chống oxy

hóa và các phân tử sinh học được đặt ở mỗi đỉnh của tam giác (Carmeli e zi., 2002) Trong tình trạng sức khỏe bình thường, ba yếu tố này luôn giữ ở trạng thái cân bằng Đến khi các gốc tự do được sản sinh ra quá nhiều đẫn đến xảy ra quá trình oxy hóa

và tiếp tục góp phần làm suy giảm chức năng tế bào (Bowles e/ zi., 1991; Meydani

Trang 3

giảm thần kinh Cơ thể của người bệnh sẽ dần mắt đi các chức năng, cuối cùng dẫn đến tử vong Trong bệnh Alzheimer, các yếu tố bệnh lâm sàng thường không đồng nhất nên rất khó khăn để xác định cho nguyên nhân và tiến triển của bệnh Tuy nhiên, bằng chứng gần đây đã chỉ ra quá trình oxy hóa như là một nguyên nhân tiềm tang của bénh Alzheimer (Nunomura et al., 2006; Onyango and Khan, 2006) Hon

nữa, triệu chứng sa sút trí tuệ do bệnh Alzheimer đã cho thấy một sự cân bằng bị

thay đôi giữa các gốc oxy hóa và chất chống oxy hóa nội sinh (Sinclair e/ a/., 1998) 2.1.3 Bệnh ung thư

Ung thư là một căn bệnh kéo đài và nguy hiểm Ung thư được chia làm các giai

đoạn:

e Giai đoạn đầu: ung thư tại chỗ

e Giai đoạn I, II, II: khối u lớn dần hoặc ung thư lan ra khỏi cơ quan ban đầu đến hạch bạch huyết và những cơ quan kế cận

© Giai đoạn IV: ung thư lan sang nhiều cơ quan khác

Các gốc tự do tác động ở tat cả các giai đoạn của ung thư: giai đoạn đầu, gốc tự

do được sinh ra qua nhiéu gay tén hai dén Deoxyribonucleic acid (DNA), tạo ra đột biến gen bằng những tác động gây thay đổi cau tric DNA va do do thic day chuyén đổi gây ung thư Giai đoạn tiếp theo, quá nhiều gốc tự do gây tắc nghẽn hệ thống thông tin thứ cấp có thể làm tăng các tế bào ung thư hoặc giảm số lượng tế bào khỏe mạnh Giai đoạn cuối, chúng tiếp tục làm thay đổi DNA để khởi xướng sự gia tăng

tế bào ung thư

Trong khi ảnh hưởng chính xác của hoạt động của các gốc oxy hóa đến nguyên nhân gây ung thư còn chưa được xác định rõ ràng, thì đã có các nghiên cứu chứng minh rằng một số chất chống oxy hóa có khả năng làm giảm tỷ lệ mắc bệnh ung thư Tác dụng của vitamin E đã được chứng minh trong một số nghiên cứu có thể làm giảm tỷ lệ mắc ung thư vú, phổi, đại tràng và tuyến tiền liệt (Gaziano e¿ z/., 2009)

Trang 4

2.1.4 Bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường đã trở thành một vấn đề sức khỏe thách thức toàn thế giới với con số thống kê khoảng 250 triệu người trên thế giới bị bệnh tiểu đường và con số

này dự kiến sẽ còn tăng lên (Philip e ai., 2010) Tiểu đường gây ra các biến chứng

nghiêm trọng như bệnh tim mạch, đặc trưng bởi rối loạn chức năng nội mô, tăng quá trình xơ vữa động mạch, bệnh thận, bệnh võng mạc, Đây là những nguyên nhân

gây tử vong hàng đầu của các bệnh nhân bị bệnh tiểu đường Tăng đường huyết mãn tính dẫn đến tăng các gốc oxy tự do và gây ra nhiều quá trình oxy hóa Nhiều nghiên cứu cho thấy gốc tự do tăng lên quá nhiều lại làm bệnh tiểu đường và các biến chứng khác trầm trọng hơn

Ngoài ra còn có các bệnh như: Parkinson, đục thủy tinh thẻ, bệnh tim mạch

cũng liên quan đến các gốc tự do và đang được nghiên cứu

2.2 Các gốc tự do trong cơ thế

2.2.1 Nguồn gốc

Các gốc tự do là các phân tử có một điện tử đơn lẻ ở lớp ngoài cùng (Riley,

1994) Cấu hình này không ổn định và luôn có xu hướng lấy điện tử của các phân tử

liền kề như protein, chat béo, carbohydrate, và acid nucleic Trong hệ thống sinh học, các gốc tự do thường có nguồn gốc từ nitơ, oxy và các phân tử lưu huỳnh Những gốc tự do trong các nhóm này được gọi là dạng oxy phản ứng (ROS: Reactive oxygen species), dang nito phản ứng (RNS: Reactive nitrogen species) và dạng lưu huỳnh phản ứng (RSS: Reactive sulfua species)

e ROS bao gồm các gốc tự do nhu superoxide (O,*-), perhydroxyl (HO,*), hydroxyl (—OH), nitric oxide (NO), va cac loai khac nhu hydrogen peroxide (H,0,°), acid hypochlorous (HOCI) va peroxy nitrite (ONOO)

e RNS được bắt nguồn từ NO thông qua các phản ứng với Oz*— để hình thành

ONOO

e RSS co thé dé dang hinh thành từ các phản ứng của ROS

Trang 5

Phần lớn các gốc tự do hoạt động mạnh và gây nhiều tốn hại cho cơ thể nhất là

ROS Oxy được biết đến là một nguyên tố không thẻ thiếu để đảm bảo sự sống, mọi

tế bào đều cần đến oxy để chuyển hóa chất đinh đưỡng thành năng lượng Như hiện tượng thực bào, hiện tượng hô hấp trong tế bào và cơ chế giái độc ở gan Oxy mà ta hít thở hàng ngày là chất cần thiết nhưng chính nó cũng trở thành gốc tự do ROS được tạo ra trong các quá trình chuyên hóa trong tế bào và các hoạt động chức năng ROS luôn được sinh ra trong cơ thể con người và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể ROS có vai trò quan trọng trong biểu hiện gen và vận chuyên ion Bên cạnh những lợi ích như trên thì gốc tự do cũng có ảnh hưởng mạnh mẽ đến cơ thê khi số lượng tăng lên quá nhiều

Chúng ta có thé thấy được rõ tác hại này qua sự gí sét, hay còn gọi là sự oxy hóa Những quá trình tương tự như vậy cũng xảy ra trong cơ thể theo từng nhịp thở

của chúng ta, nó luôn tạo ra các gốc tự do Hiện tượng thực bào là hiện tượng vi khuẩn, virus bị tế bào bạch cầu tiêu diệt trong cơ thể, hoặc hiện tượng hô hấp trong

tế bào, hoặc cơ chế giải độc ở gan đều là các hoạt động làm sinh ra gốc tự do Các

loại phản ứng oxy hóa như superoxide (O2*—), perhydroxy radical (HOO-) va hydroxyl radical (HO*) Các gốc tự do được hình thành bởi quá trình giảm electron của phân tử oxy (O;)

ROS có thê được phát sinh trong quá trình chiếu xạ ánh sáng tia cực tím, tia X

và tỉa gamma, trong các phản ứng xúc tác kim loại, hiện diện trong không khí là chất

gây ô nhiễm, được sản xuất bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào trong quá trình viêm và là sản phẩm của ty thể và lạp thế xúc tác phán ứng vận chuyên điện tử

(Cadenas, 1989)

Gốc tự đo được tạo nên từ vô số các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thé

Bên cạnh đó nhân tố môi trường cũng góp phần làm tăng các gốc tự đo như: tia cực tím, khói thuốc lá, chất béo no, do viêm nhiễm mãn tính hoặc do ánh hưởng của thuốc trừ cỏ, stress, những thói quen ăn uống không khoa học và các chất gây ô

Trang 6

nhiễm khác Tác hại của chúng có thể được hạn chế nhờ chế độ ăn giàu chất chống

oxy hóa có trong hoa quả như các thực phâm có chứa vitamin E, C, các flavonoid, acid amin chứa lưu huỳnh, các nguyên tố vi lượng

FORMATION OF FREE RADICALS

` Hình 1: Nguồn gốc cúa gốc tự do

Nguon: http://www.sstwo-mall.com/index.php/free-radicals

2.2.2 Tac hai ciia gốc tự do

Gốc tự do phá hủy lipid trên màng tế bào, các phân tử protein, các thể hạt, tăng

nhanh quá trình lão hóa cơ thể và kích thích sự phát triển bệnh ung thư, gây ra các

chứng tắc nghẽn động mạch, bệnh Alzheimer, tim mạch, Điều nguy hại là các gốc

tự do luôn tổn tại trong cơ thể Các electron tự do luôn có xu hướng kết đôi với electron khác để tạo ra liên kết hóa học Nó có thể phản ứng với gốc tự do khác hoặc

phân tử trung hòa Như vậy, gốc tự do có thể biến các phân tử ban đầu trung hòa trở

thành gốc tự do Tác động như vậy sẽ tạo ra phản ứng dây chuyền trong cơ thể gây ánh hưởng đến các phospholipid, lipoprotein màng Quá trình oxy hóa do các gốc tự

do tham gia sẽ tạo nên các peroxide, đây được coi là một phản ứng thoái hóa sinh học Các gốc tự đo và sản phẩm hoạt động của chúng sau khi gây tổn thương màng

tế bào sẽ gây nhiều tác hại khác như: biến đổi cấu trúc các protein, làm sạch hoạt

động các enzyme, biến đổi cấu trúc và thuộc tính các hormone, Tất cả những quá

trình đó đây nhanh quá trình thoái hóa và lão hóa cơ thể, dẫn đến nhiều loại bệnh tật

làm suy giám sức khỏe, rút ngắn tuôi thọ

Trang 7

Nguyễn Ý Đức (1988) cho rằng trong cuộc đời của người sống đến 70 tuổi, có

khoảng I7 tấn gốc tự do được tạo ra Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do, mà

các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rat dé phản ứng và gây ra nhiều tốn hại

2.3 Chat chong oxy héa (antioxidant)

2.3.1 Giới thiệu về chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là chất làm sạch hoặc trì hoãn quá trình oxy hóa của một chất nền khi hiện diện với một lượng nhỏ Theo Berger (2005) các chất chống oxy hóa hoạt động theo các phương thức sau:

© Cac chat này trực tiếp trung hòa các gốc tự do do bằng cách cho đi điện tử (e) để

kết hợp với điện tử lẻ của các gốc tự đo

e Làm giảm nồng độ peroxide và sửa chữa các màng bị oxy hóa

e Tác động đến hệ thống chống oxy hóa nội sinh để làm tăng hoạt động chống oxy hóa của cơ thể

Ở mức độ tế bào, chất chống oxy hóa có thể làm giảm các gốc tự đo bằng cách

làm sạch các hoạt động hoặc biểu hiện của các enzyme tạo ra gốc tự do như nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADHP), nitro oxidase

(NOx) va xanthine oxidase (XO) hoặc bằng cách tăng cường các hoạt động và biểu

Trang 8

hién ctia cdc enzyme chéng oxy hoa nhu superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) va glutathione peroxidase (GPX) Té bao déng vat co chtra enzyme SOD cé

thé chuyén đổi hai O2*— thành HzO; và Os Tiếp theo đó H;O¿; được enzyme catalase

chuyên đối thành H;O và O¿

Các chất chống oxy hóa có thể phản ứng trực tiếp với các gốc tự do và phá hủy

chúng, sau đó các chất chống oxy hóa sẽ trở thành các gốc tự do mới nhưng hoạt

động ít hơn và ít nguy hiểm hơn so với những gốc tự do mà nó đã vô hiệu hóa

Ví dụ: Vitamin C tan trong nước và Vitamin E (TOH) tan trong lipid sẽ phản ứng trực tiếp hoặc vô hiệu hóa hydroxyl (HO*), alkoxyl (LO*) và lipid peroxyl (ROO»)

2.3.2 Các loại chất chống oxy hóa

2.3.2.1 Chất chống oxy hóa nội sinh

Trong cơ thê khỏe mạnh luôn có hệ thống chống oxy hóa nội sinh, có tác dụng

vô hiệu hóa các gốc oxy hóa tự do có hại như các enzyme: glutathione peroxidase,

superroxide, dismutase, đặc biệt là vitamin C, vitamin E, j-caroten (tiền vitamin

A), khoáng chất selen "nội sinh" có sẵn trong co thể, xúc tác các phản ứng khử đề vô hiệu hoá gốc tự do giúp cơ thể khoẻ mạnh

Chất chống oxy hóa hiệu quả nhất trong cơ thé là các enzyme như: glutathione peroxidase, catalase va superoxide dismutase (Mates et al., 1999)

e SOD enzyme xtc tác chuyên đổi hai O2*— thành H;O; và oxy

Catalase 2H;O¿—————————> 2H;O+O;

e Gutathione peroxidase là một nhóm các enzyme có hoạt tính chống oxy hóa có trong tế bào Các chức năng sinh hóa của glutathione peroxidase là giảm hydroperoxide lipid va biến đổi hydrogen peroxide tự do thành nước

Chất chống oxy hóa nội sinh đóng một vai trò quan trong trong việc duy trì các

chức năng tối ưu của tế bào và bảo vệ sức khỏe Tuy nhiên, trong trường hợp các quá trình oxy hóa sinh ra quá nhiều gốc tự do, chất chống oxy hóa nội sinh có thé không đáp ứng đủ dé giữ cân bằng cho co thé thì chế độ ăn uống hay chất chống oxy hóa ngoại sinh có thể được yêu cầu để duy trì các các hoạt động tối ưu

2.3.2.2 Chất chống oxy hóa ngoại sinh

Hiện nay, hướng đi tìm các chất chống oxy hóa ngoại sinh đang rất được quan tâm Với nguồn tài nguyên dược liệu sẵn có rất phong phú và đa dạng, việc tìm kiếm

những được liệu gần gũi với con người ngày càng được quan tâm hơn Một số

nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng trái cây và rau quả luôn làm giảm tỉ lệ mắc các

bệnh liên quan đến quá trình lão hóa như ung thư, bệnh tìm mạch và bệnh Alzheimer (Moskovitz and Yim, 2002) Trong thực vật có chứa các chất chống oxy hóa tự nhiên như: ascobates, catechins, flavonoids, giúp làm sạch (scavege) các gốc tự

do từ các phản ứng trong cơ thé

Trang 10

2.3.2.3 Các chất chống oxy hóa được nghiên cứu

Vitamin C (Ascorbic acid): Theo Niki et al., (1995) vitamin C khi kết hợp với ơ-tocopherol có hiệu quả rat cao trong việc làm sạch quá trình oxy hóa

Vitamin E: Vitamin E là một vitamin tan trong lipid được tìm thấy trong màng

tế bào Nó bảo vệ tế bào chống lại quá trình oxy hóa bằng cách tác động trực tiếp

đến một loạt các gốc oxy tự do Vitamin E có một vai trò quan trọng trong việc

phòng chống xơ vữa động mạch thông qua việc làm sạch quá trình oxy hóa LDLs (Low density lipoprotein: có vai trò vận chuyển cholesterol) của các gốc tự do (Steinberg, 1992; Witztum, 1994) Theo Morrow và Roberts (1997), sự hình thành của isoprostanes là sản phẩm được tạo ra trong quá trình oxy hóa lipid và là nguyên nhân gây xơ vữa động mạch sẽ tăng đáng kế ở động vật thiếu vitamin E Hơn nữa, làm sạch sự hình thành isoprostanes bằng cách bố sung vitamin E đã được chứng minh trong các mô hình động vật (Liu et al., 1999) va ké ca 6 ngudi (Upritchard et al., 2003) a-tocopherol 1a hinh thitc chủ yếu của vitamin E trong cơ thể người và đã được nghiên cứu rộng rãi

near +-OH —> CH; + H,O

O° `Cụn;; O °C 16H33

(A) Vitamin a TOH reactive im reactive

Vitamin C, AscH™ reactive Asc `, stable

Hình 3: Cấu trúc của Viatmin E và Vitamin C trong phản ứng chống oxy hóa

Nguon: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2927345/figure/F2/

Trang 11

Carotenoid: Carotenoids 1a nhimg chat chéng oxy hda tan trong lipid Nồng độ trong huyết tương của carotenoids tương quan nghịch đảo với mức độ của isoprostanes (Block a/., 2002) Nồng độ carotenoids giảm sẽ dẫn đến hậu quả tăng

các phản ứng viém (Hu et al., 2004), xo vita déng mach (Prince et al., 1988), bénh

tim mach (Gaziano et al., 1995), sarcopenia (Semba et al., 2003), va ty lệ tử vong (Hu et al., 2004) Nhimng tac dung trong việc chống oxy hóa va giam peroxide lipid cua carotenoids da va dang dugc nghiên cứu (Upritchardetal, 2003)

Melatonin (C13HisN202): Melatonin la m6t hormone co 6 dong vat cd va

duge téng hop tir serotonin Theo Aydogan et al., (2006) Melatonin gop phan giam thiệt hại do quá trình oxy hóa lipid Khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ của

melatonin được tác động bằng cách kích thích sự biểu hiện và hoạt động của các

enzyme chống oxy hóa như: glutathione peroxidase, superoxide dismutase, NO synthetase (Nishida, 2005) Nồng độ melatonin đặc biệt cao trong ty thể và nhân tế bao (Aydogan et al., 2006)

Trang 12

Öi còn được gọi là phan thạch lựu có tên khoa học là Psijưm guajava L., thuộc

ho sim (Myrtaceae) Oi 1a một loại cây cao trung bình có chiều cao từ 5-10 m Vỏ thân ổi nhẫn và mỏng, khi già bong thành từng mảnh lớn, màu nâu đỏ Canh non

vuông, có nhiều lông mềm, về sau cành có hình trụ và nhẫn Lá ổi có kiểu mọc đối,

hình trái xoan hay thuôn dài, chiều dài lá khoảng 15 em, chiều rộng 3-6 em, phía góc

lá có thể tù hay hơi tròn, gân lá nổi rõ ở mặt đưới và phủ một lớp lông mịn Cuống lá thường ngắn từ 3-5 mm Hoa màu trắng, đường kính khoảng 2.5 em, hoa thường có

nhiều nhụy, hoa có thể mọc đơn độc hay tụ 2-3 hoa thành cụm ở nách lá Hoa ổi nở vào đầu mùa hè Quả ổi thường mọng, hình cầu hay đạng quá lê, chiều dài quả có

thể đến 10 cm, chứa rất nhiều hạt nhỏ Đài hoa tồn tại trên quả Ôi có nguồn gốc từ

vùng nhiệt đới châu Mỹ, châu Á, châu Phi Hiện nay, ở nước ta có nhiều loại di Ôi

mọc hoang ở khắp nơi từ vùng đồng bằng đến đôi núi (Phạm Hoàng Hộ, 2003) Oi không những là loại trái cây để lấy quả mà các bộ phận khác của cây còn có tác

dụng tốt trong làm thuốc như búp non, lá non, quả, vỏ rễ và vỏ thân cây (Đỗ Tất Lợi,

2006)

Trang 13

2.4.1.2 Thanh phan héa hoc cia cay Oi

LA 6i chia tinh dau (0.31%) chu yéu là dl-limonen Ngoài ra, trong 14 6i còn chứa sitosterol, acid maslinic (acid cratagolic), acid guijavalic Trong lá ối non và búp non còn có 7-10% tanin pyrogalic, khoảng 3% nhựa Nhựa cây ổi chứa acid đ-

galacturonic (72.03%), d-galactose (12.05%) va l-arabinose (4.4%) Than cây và quả

éi co pectin, vitamin C Trong hạt có tinh dầu với hàm lượng cao hơn trong lá Vỏ

thân chứa acid ellagic (Đỗ Tắt Lợi, 2006)

2.4.1.3 Dược tính của Ôi

Theo nghiên cứu của Oh et al., (2003), dich chiết lá Ôi có hoạt tính làm sạch

enzym tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) Hoat tinh nay cho thay dịch chiết từ lá Oi

có tác dung tri đái tháo đường type 2 khi thử trên chuột, với nồng độ 10 mg/kg gây

hạ glucose trong máu khá rõ rệt Nghiên cứu của Rai e¿ z/., (2007) cho thấy nước ép

từ quả 6i tươi được tiêm qua màng phúc mạc với liều lượng 400 mg/kg sau 2 giờ giúp làm hạ đường huyết của các chuột bị đái tháo đường Nghiên cứu của Hui et al., (2004) đã chứng minh cao chiết lá Ôi có khá năng chống oxy hóa mạnh (94.4 —

96.2%) ở nồng độ 100 ug/mL bằng phương pháp ABTS

2.4.2 Lá Dứa

2.4.2.1 Đặc điểm

Theo D6 Tat Loi (1982) thi La Dita (Pandanus amaryllifolius) thuộc họ Dứa đại (Pandanceae) Ngoài ra, cây còn có tên gọi khác la Pandanus odorus Tén thường gọi là Dứa thơm hay Cây cơm nếp Cây Lá Dứa thuộc cây thân bụi, có đời sống lâu năm Đường kính thân cây tir 1-3 em, cây cao đến l m, thân rộng, thân cây

có màu xanh đậm chia ra nhiều nhánh Lá có dạng lá đơn, láng, mọc thành cụm hình hoa thị Lá đài và có hình dạng giống mũi mác, mép lá không có gai, mặt đưới lá có

màu nhạt Lá Dứa có mùi thơm địu, không có lông, lá xếp theo hình máng xối, dài

khoảng 40-50 cm, rộng 3-4 cm, lá có nhiều gân cách nhau I mm, không thấy có hoa Lá Dứa có mùi thơm như mùi cơm nếp mà các loài Pandanus khác không có

Trang 14

Cây Lá Dứa được phân bồ chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các

châu lục Ở Việt Nam, cây lá dứa là loại cây được trồng và mọc hoang phô biến

Trên thế giới cây Lá Dứa được trồng nhiều ở miền nhiệt đới Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Philippines, Lá Dứa là cây dễ trồng vì chịu đựng được nhiều điều kiện đất khác nhau nhưng phát triển tốt nhất trên đất thoát nước tốt, giàu hữu cơ Cây Lá Dứa có thể trồng được quanh năm (Phạm Hoàng Hộ, 2003)

2.4.2.2 Dược tính của Lá Dứa

Lá Dứa tươi nấu với cam thảo có tác đụng cho bệnh nhân bị bệnh thận mãn

tính Lá Dứa tươi được trộn chung với dầu đề trị nhức đầu, viêm khớp, co thắt da

dày Lá Dứa còn được chế biến thành trà có tác dụng: hạ sốt, tim, tiêu hóa, (Đỗ Đức

Ngọc, 2009) Theo các tác giả Đào Hùng Cường, Nguyễn Thị Thanh Tú (2010) đã

khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây Lá Dứa, thành phần dễ bay hơi một

số chất gây mùi chính của cây là 2-acetyl-1-pyrrolin, Limone; 3-methyl-2 (5H) furanone; 2,4,4 trimethylbut-2-enolide có mùi thơm giống như gạo nếp

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trên rễ cây Lá Dứa (Heimsch e 4l, 2008) Trong một số nghiên cứu, hợp chất 4-hydroxybenzoic acid trong rê cây Lá dứa được chứng minh có tác dụng làm hạ đường huyết trên chuột (Peungvicha et al.,

1998) Theo y học hiện đại Lá Dứa có phytosterol tác dụng làm giảm bệnh tim mạch

vanh (Tapiaro et al., 2003; Ling et al., 1995) Ngoài ra, hiện nay có nhiều hợp chất kháng khuân cũng được tìm thấy trong Lá Dứa (Kaiser e a/., 201 1)

2.4.3 Day Khé qua

2.4.3.1 Đặc điểm

Day Khé qua (Khé qua) c6 tén khoa hoc 14 Momordica charantina L thudc

ho Bau bi (Curcubitaceae) Khé qua là cây nhất niên, thân leo nhờ vòi đoan, thân có

5 cạnh, trên thân có lông trắng mịn Cuống lá khổ quađẹp, có lông, phiến lá có gân dạng chân vịt, có lông thưa Khổ qua là cây đồng chu, hoa cô độc có cọng dài, có lá

hoa hình tim, lá đài 5, xanh đợt, cao 5-7 mm Hoa 5 cánh màu vàng, tiểu nhụy 3, bao

Trang 15

phấn vàng đậm hình chữ S, noãn sào có lông mịn Trái khổ qua thuộc dạng phì quả

vàng đậm, hột trong nạc đỏ, quả bì rất đắng, chống đái tháo đường (Phạm Hoàng Hộ, 2003) Quả hình thoi dài, gốc và đầu thuôn nhọn, mặt ngoài có nhiều u lỗi không

bằng nhau, khi chín màu vàng hồng, hạt đẹp có màng đỏ bao quanh

2.4.3.2 Dược tính của Khố qua

Quả khố qua chứa các chất như sau: các glucosid triterpennic như charantin

và hỗn hợp các chất thuộc nhóm stigmastadtenol, các glucosylsterol, pyrimidin arabinosit charin và vicim Trong trái khổ qua còn chứa các sắc tố và vitamin chủ

yếu là vitamin B¡, Bạ, Ba, E và B-carotene

Ngoài ra còn có cyrpotoxanthin và zeaxanthin, các chất khoáng Ca, Mg, Cu,

Fe, Zn (Đỗ Huy Bích a/, 2004) Hạt khổ qua chứa các chất như bao gồm các

glucosid, B- D- glucosid cua j- sitosterol, các terpenglucosid, các momorcharasid, các hợp chất lectin: protein như globulin, lectin Ngoài ra, hạt khổ qua còn chứa các chất béo như acid oleostearic; acid stearic La va thân khổ qua chứa các chất như

momordicin, sterol, chitinase

Công dụng của trái khổ qua cũng đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới với nhiều phương pháp tách chiết khác nhau và cho các kết quả rất khả quan về tiềm năng chữa bệnh tiêu đường (Welihinda, 1986) Cao chiết nước và cao chiết ethanol khổ qua có tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây tiêu đường bởi alloxan, kết qua

hạ đường huyết này giống như việc điều trị chuột tiểu đường bang gliclazide (Kameswara Rao et al., 2001) Theo két quả nghiên cứu của Semiz eí ai., 2007 đã chứng minh khả năng làm sạch gốc tự do của cao chiết khô qua bằng phương pháp

so màu TAR_ như mô tả của Erel (2004)

2.4.4 Nhàu

2.4.4.1 Đặc điểm

Cay Nhau co tén khoa hoc 1a Morinda citrifolia L thudc ho Cà Phê (Rubiaceae) Nhau là cây gỗ cao 4 - 8 m, thường mọc ở vùng nhiệt đới và ôn đới, ở nước ta nhàu thường mọc ở những nơi am thap, dọc theo bờ sông, ao, mương rach Cành non màu xanh, tiết diện vuông, có rãnh, nhẫn, cành già tiết diện tròn, màu nâu

Trang 16

xam La don, moc déi, phién lá to, hình bầu dục hai đầu thuôn nhọn, dai 15 - 30 cm, rộng 10 - 15 cm Lá màu xanh bóng đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn, bìa lá hơi

dợn sóng Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt đưới, có 6 - 7 cặp gân phụ Cuống lá

đài I - 3 cm Lá kèm nằm giữa 2 lá mọc đối, hình xoan, cao l1 - 1,5 cm, màu xanh nhạt Cụm hoa là đầu hình tròn hay hơi bầu dục, ở ngoài nách lá Trục cụm hoa hình trụ, màu xanh, nhẫn, đài 1 - 2 cm Day cum hoa có 3 phiến hep, dai 5 - 8 mm Hoa

đều, lưỡng tính Đài hoa là một gờ tròn Cánh hoa 5 phía dưới dính lại thành ống hình phễu, màu xanh nhạt, cao 7 - 12 mm, bên trong có nhiều lông trắng: 5 thùy dài

khoảng 5 - 8 mm, màu trắng, hình bầu dục đầu nhọn, đỉnh có phụ bộ là một mẫu nhỏ

cong vào trong Khi hoa nở các thùy cong xuống phía dưới, tiền khai hoa vặn Bộ nhụy đực có 5 nhụy bằng nhau, rời, gắn ở phần loe của ống tràng xen kẽ với các cánh hoa, chỉ nhụy rất ngắn Bao phấn hình đầu tên, màu vàng nhạt, dài khoảng 4

mm Hạt phan roi, hinh cau, mau vàng nhạt Có 2 lá noãn, ở vị trí trước và sau, bau

dưới có 2 ô, mỗi ô có 1 noãn, đính phôi kiểu trung trục Vòi nhụy đạng sợi màu xanh

nhạt, dải 5 mm Có 2 đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài 3 mm, màu xanh Đĩa mật day, hình khoen, màu vàng Quả hạch kép do bầu noãn và một phần lá đài của các hoa trên cụm hoa dính nhau tạo thành Quả còn non màu xanh nhạt, dài 5 - 7 em, rộng 3

- 4 em Quả già màu ngà vàng, nhẫn bóng, mùi khai, trên quả còn vết tích các đĩa mật Hạt nhiều, hình bầu dục, một đầu nhọn, màu nâu đen (Phạm Hoàng Hộ, 2003)

2.4.4.2 Dược tính của Nhàu

Rễ và lá nhàu chứa moridin là một anthraquinolic kết tỉnh thành tinh thế hình

kim, màu vàng cam, tan trong nước sôi và các chất kiềm, ít tan trong nước lạnh,

không tan trong ether Ngoài ra, còn có I-metoxyrubiazin, moridon, alizarin và 1 oxy-2, 3-dimetoxy anthraguinon Nhàu còn chứa nhiều selenium, lignans,

polysacchsrides, flavonoids, iridoids, acid béo, catechin, B-sitoterol, damnacanthal,

alkaloids Rễ nhàu được dùng chữa cao huyết áp, chữa nhức mỏi tay chân, đau lưng,

sài uốn ván và nhiều bệnh khác Nhân dân thường dùng rễ để nhuộm vải, lụa Lá

nhàu đùng chữa ly, tiêu chảy, cảm sốt và nấu canh rất bố dưỡng Nhàu còn có thể

Trang 17

giã đắp làm lành vết thương, vết loét, làm chóng lên da non (Trương Thị Đẹp,

2007)

Theo nghiên cứu của Zin et al., 2001 tat cả các bộ phận của nhàu đều có hoạt

tính chống oxy hóa cao khi được khảo sát bằng phương pháp TBA (thiobarbituric) 2.5 Giới thiệu về Trolox

Trước đây, vitamin E đã được nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa vì vitamin E 1a mét dang a-tocopherol tén tai trong tế bào và được chứng minh là chất làm sạch mạnh các gốc tự do gây thiệt hại cho màng tế bào (Oral e/ a/., 2006) Vitamin E làm sạch các gốc peroxyl tự đo và hình thành ơ-tocopherol phenoxyl tự

do ít độc hại hơn cho cơ thé (Burton and Ingold, 1983)

Hợp chất Trolox (6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic aciđ)

là dẫn xuất tan trong nước có cấu trúc tương tự ơ-tocopherol đã được nghiên cứu va đưa vào sử dụng như một chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh (Scott e/ al., 1974; Bisby et al., 1984) Trong nghiên cứu này, trolox được sử đụng là nghiệm thức đối chứng dương trong hoạt động chống oxy hóa

2.6 Phuong phap DPPH (Blois, 1958)

Phương pháp DPPH (2,2 -diphenyl-1-picrylhydrazyl) đã được giới thiệu gần 50

năm trước đây bởi Marsden Blois, Đại học Stanford Mặc dù bài báo này là bài viết

ngăn (bài nhỏ trên một trang trên tạp chí Nature), nhưng nó cung cấp các bước của phương pháp ngắn gọn và rõ ràng Đã có nhiều kết quá thí nghiệm chứng minh rằng phương pháp Blois phù hợp trong việc kháo sát khả năng chống oxy hóa như nghiên

cuu cua Kim et al.,(2002) va Zhu et al., (2002)

DPPH là phân tử dạng bột có màu đen đặc trưng DPPH có chứa gốc ty do én

định, có màu tím đặc trưng trong dung môi

O2N

Hình 8: Cấu trúc hóa hgc cia DPPH

Nguon: http://www.scielo.cl/scielo php?pid=S07 179707201 1000400019&

script=sci_arttext DPPH đã được sử dụng rộng rãi để đánh giá hiệu quả của hoạt động làm sạch các gốc tự do của các chất chống oxy hóa Phương pháp DPPH là một phương pháp đơn giản đã được phát triển nhằm xác định hoạt tính chống oxy hóa của các loại cao

chiết thực vật

Theo Sreeyan và Rao (1996) nguyên tắc của việc giảm các gốc tự do trong phương pháp DPPH là chất chống oxy hóa phản ứng với các gốc tự do én định trong DPPH va chuyén déi thanh DPPH-H (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazine) Trong phương pháp DPPH, các chất chống oxy hóa có thế cho đi một hydro để làm giảm các gốc tự do ôn định trong DPPH Khi các chất chống oxy hóa làm sạch hoạt động

Trang 19

cua cac gốc tự do thì màu tím đặc trưng của DPPH sẽ mất dần và xuất hiện màu

vàng của DPPH-H DPPH thường được sử đụng như một chất phản ứng để đánh giá hoạt động làm sạch các gốc tự do của chất chống oxy hóa dựa trên sự thay đôi hấp

Thời gian phản ứng được đề xuất đầu tiên là 30 phút boi Blois (1958) và cũng

đã được tiến hành trong các nghiên cứu của Kim e¿ ai., (2002) Khoảng thời gian phản ứng ngắn hơn cũng đã được đề xuất như: 5 phút (Lebeau ef al., 2000) hoặc 10

phút (Schwarz e/ a/., 2001) Tuy nhiên thời gian phản ứng tùy thuộc vào chất chống oxy hóa vì mỗi cơ chất có khả năng làm sạch và tốc độ làm sạch DPPH khác nhau (Brand-Williams e/ al., 1995; Bondet e/ a/., 1997) Do đó, thời gian phản ứng tốt nhất là khi cơ chất đã làm sạch tối đa gốc tự do trong DPPH (Lu et al., 2000; Sanchez-Moreno et al., 1999; Yepez et al., 2002)

Trang 20

Bước sóng hấp thụ được đưa ra khác nhau như: 515 nm (Bondet e/ aỉ., 1997; Brand-Williams et al., 1995; Gomez- Alonso et al., 2003; Lebeau et al., 2000;

Sanchez- Moreno et al., 1999) hay 516 nm (Schwarz et al., 2001) hay 518 nm (Leit

et al., 2002), va 520 nm (Kim et al., 2002) Nhung bude song hap thu tối đa trong

hầu hết cơ chất được các nhà khoa học chấp nhận là 517 nm (Blois, 1958; Lu and Foo, 2000; Zhu et al., 2002)

Phương pháp DPPH trong nghiên cứu này được tóm tắt như sau: hỗn hợp phản

ứng 500 uL gồm 250 uL cao chiết trong ethanol va 250 pL DPPH (6x10 M) Hỗn

hợp được ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 40 phút Sau đó đo độ hấp thụ của DPPH bang may do quang phố ở bước sóng 517 nm để khảo sát khả năng chống oxy

hóa của cao chiết

Trang 21

CHUONG 3 PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP

3.1 Phuong tién

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm thực hiện:

Phòng Thí Nghiệm Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên

Phòng Sinh Học Phân Tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Trién CNSH Thời gian thực hiện: từ tháng 11/2011 dén thang 3/2012

3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

3.1.2.1 Nguyên liệu

Cao chiết của 4 loại thực vật:

e Lá Ôi (Nguyễn Phạm Trúc Phương, Sinh học K33 cung cấp)

e Khổ qua (Cao Minh Đạt, Sinh học K33 cung cấp)

e Lá dứa ( Lư Thị Thùy Linh, Sinh học K33 cung cấp)

e Rễ nhàu (Phạm Thị Lan Anh, Sinh thái K16 cung cấp)

3.1.2.2 Hóa chất

Ethanol, Methanol (Merck), Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-

carboxylic acid), DPPH (2,2 -diphenyl-1-picrylhydrazyl), Vitamin C dang vién va

các hóa chất cần thiết khác

3.1.2.3 Thiết bị

Cốc thủy tính, ống nghiém thwy tinh, centrifuge tubes, dau cone, gang tay, cac

loại micropipette, Máy đo quang phố BecKman Coulter 640B (Mỹ), cân phân tích 4

chỉ SỐ, máy Vortex,

Trang 22

Trolox với nồng độ 40 mM, trữ mẫu ở nhiệt độ 4°C để làm dung dịch gốc cho các

thi nghiém sau nay (Maher M et al , 2006)

3.2.2 Chuẩn bị cao chiết

Chuẩn bị dung dịch gốc có nồng độ 2 mg/mL và 3 mg/mL được thực hiện như sau: Cân cao chiết và cho vao eppendorf tubes 15 mL, thém ethanol vao tube, sau đó dùng máy Vortex trộn đều hỗn hợp để hòa tan cao chiết Thu được dung dịch cao

chiết có nồng độ 2 mg/mL và 3 mg/mL Các dung dịch gốc thu được sẽ được trữ

trong tủ lạnh đề làm dung dịch gốc cho các thí nghiệm sau

hòa tan DPPH, sau đó trữ trong tối ở nhiệt độ phòng đề làm dung dịch gốc cho các thí nghiệm tiép theo (Maher M et al., 2006)

3.2.4 Khảo sát thời gian ảnh hướng đến khá năng chống oxy hóa củaTrolox

Hỗn hợp phản ứng có thể tích 500 uL gồm 250 L Trolox có nồng độ từ 50

uM đến 400 uM và 250 L DPPH (6x10M) Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng và

sau đó được do độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 517nm ở các thời gian lần lượt là 0 phút, 5 phút, 10 phút, 20 phút, 30 phút và 40 phút

3.2.5 Khảo sát nồng độ ảnh hưởng đến khá năng chống oxy hóa của Trolox

Khả năng chống oxy hóa của Trolox được xác định nhờ phương pháp DPPH được tóm tắt như sau: Hỗn hợp phản ứng có thé tích 500 uL gồm 250uL Trolox ở

các nồng độ từ 0 M đến 400 uM và 250 uL DPPH (6x10M) Hỗn hợp được ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong thời gian 40 phút Sau đó đo độ hấp thụ của DPPH

bằng máy đo quang phô 3 lần/nồng độ và lay giá trị trung bình

Theo Maher et al., (2006) khá năng chống oxy hóa (%) được tính theo công thức sau:

C: Độ hấp thụ của DPPH không có Trolox ở 40 phút

3.2.6 Kháo sát khá năng chống oxy hóa của dịch chiết cao thực vật

Khả năng chống oxy hóa của cao chiết được xác định nhờ phương pháp DPPH được tóm tắt như sau: Hỗn hợp 500 uL gồm 250 uL cao chiết ở các nồng độ từ 0

ug/mL đến 400 ug/mL và 250 uL DPPH (6x10”M) Hỗn hợp được ủ trong tối ở

Trang 24

nhiệt độ phòng trong thời gian 40 phút Sau đó đo độ hấp thụ của DPPH bằng máy

đo quang phổ 3 lần/nồng độ và lấy giá trị trung bình

Theo Maher et a/., (2006) khả năng chống oxy hóa (%) được tính theo công

A: Độ hấp thụ của DPPH không có cao chiết ở 0 phút

B: Độ hấp thụ của DPPH có cao chiết ở 40 phút

C: Độ hấp thụ của DPPH không có cao chiết ở 40 phút

CHUONG 4 KET QUA VA THAO LUAN

4.1 Thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hóa của Trolox theo thời gian

DPPH khi được hòa tan trong dung môi và để trong tối ở nhiệt độ phòng sẽ

sinh ra các gốc tự do ôn định Theo nghiên cứu của Blois (1958) và Zhu e ai,

(2002), khả năng hấp thụ của DPPH cao nhất khi đo ở bước sóng 517nm Khi cho

một chất có khá năng làm sạch DPPH phán ứng với DPPH và đo độ hấp thụ của hỗn

hợp ở bước sóng 517 nm thì chỉ số hấp thụ sẽ giảm so với chỉ số hấp thụ của DPPH

Ngược lại, chất không có khả năng chống oxy hóa thi sẽ không làm giảm chỉ số hấp

thụ khi phản ứng với DPPH và được đo ở bước sóng 517 nm Bước sóng 517 nm là bước sóng tối ưu cho phần lớn các chất chống oxy hóa Do vậy, trong các thí nghiệm

của đề tài sẽ sử dụng bước sóng 517 nm Thực hiện thí nghiệm để khảo sát khả năng chống oxy hóa của Trolox theo thời gian và tìm thời gian ú tối ưu cho phản ứng

chống oxy hóa của Trolox Kết quả được mô tả ở Hình 12:

Trang 26

Hình 12: Sự thay đối khả năng làm sạch DPPH của Trolox ở các nồng độ

theo thời gian

Kết quả được trình bày ở Hình 12 cho thấy: có sự khác biệt về khả làm sạch

DPPH của Trolox ở các nồng độ khác nhau được khảo sát qua các thời điểm khác nhau Khi nồng độ Trolox càng cao, khả năng làm sạch gốc tự do trong DPPH càng

400 ug/mL (92%) ở thời điểm 5 phút

Khi thời gian kéo đài đến 10 phút và 15 phút, trong từng nồng độ được kháo sát thì khá năng làm sạch DPPH khác biệt không ý nghĩa với thời điểm 5 phút.Tuy

nhiên, hiệu quá làm sạch DPPH tăng theo nồng độ khi kéo dài đến 30 phút Sự khác

biệt thể hiện rỏ ràng nhất ở nồng độ 150 ug/mL Khả năng làm sạch DPPH ở nồng

Trang 27

độ 150 ng/mL là 41% ở 20 phút và đạt 50,1% ở thời điểm 30 phút Tại thời điểm 40

phút, khả năng làm sạch DPPH của các nồng độ khác biệt có ý nghĩa so với thời

điểm 30 phút

Ở tất cá các thời điểm khảo sát, kho Trolox ở nồng độ 400 ug/mL thì hiệu qua làm sạch DPPH luôn cao hơn 90% Điều này có thể giải thích là do Trolox hiện diện

ở nông độ cao thì sẽ có nhiều phân tử Trolox trung hòa các gốc ty do trong DPPH vi

trong phản ứng Trolox đóng vai trò là chất khứ

Theo nghiên cứu của Blois (1958) và Philip (2010) thời gian ủ tối ưu để có thể

khảo sát được khá năng làm sạch DPPH của các chất chống oxy hóa là 30 phút Tuy

nhiên, trong thí nghiệm này tại thời điểm 40 phút thì hiệu quả làm sạch DPPH vẫn tăng so với thời điểm 30 phút Do đó, các thí nghiệm sau của đề tài sẽ sử dụng thời gian ủ là 40 phút

Kết luận: Thời gian tối ưu để ủ Trolox và DPPH trong phản ứng khảo sát khả

năng chống oxy hóa là 40 phút

4.2 Thí nghiệm khảo sát khá năng chống oxy hóa cúa trolox theo nồng độ Thí nghiệm thực hiện dé khảo sát ánh hưởng của nồng độ đến khá năng chống

oxy hóa của Trolox và tìm nồng độ tối ưu của Trolox trong phản ứng với DPPH Kết quả thí nghiệm được trình bày ở Hình 13:

Trang 28

Hình 13: Đường chuẩn của Trolox trong phuong phap DPPH

Két qua cho thay kha nang lam sach DPPH cua Trolox ting dan theo nồng độ

v6i R°= 0,981

Khi nồng độ ở 12,5 ug/mL và 25 ug/mL, khả năng làm sạch DPPH của Trolox thấp với chỉ 9,3% DPPH được làm sạch ở nồng độ 25 ug/mL Nồng độ khảo sát càng cao thì khả năng làm sạch DPPH của Trolox càng cao Từ 13,2% DPPH được làm sạch khi Trolox ở nồng độ 50 ug/mL tăng lên 27,5% khi Trolox ở nồng độ 100 ug/mL

Khả năng làm sạch DPPH của Trolox bắt đầu tăng mạnh ở nồng độ 150 ug/mL

với 50,3% Ở nồng độ 200 ug/mL, Trolox có thể làm sạch 53,580% DPPH và 80,5%

ở nồng độ 300 ug/mL Khả năng chống oxy hóa của Trolox cao nhất ở nồng độ 400

ug/mL với hơn 94% Kết quả thí nghiệm phù hợp với cơ sở lý thuyết về chất chống

oxy hóa Khi nồng độ chất chống oxy hóa càng cao thì có càng nhiều gốc tự do trong DPPH được trung hòa Mặt khác, kết quả thí nghiệm phù hợp với nghiên cứu của

Trang 29