KHOA KHOA HOC TU NHIEN
CBS
LUAN VAN TOT NGHIEP DAI HOC CHUYEN NGANH SINH HQC
KHAO SAT KHA NANG CHONG OXY HOA
CUA CAO CHIET LA VA RE
CAY NHAU (Morinda citrifolia L.) IN VITRO
Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS ĐÁI THỊ XUÂN TRANG HỊ NGỌC PHỤNG
BỘ MƠN SINH HỌC MSSV: 3092364
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LỚP: SINH HỌC K35
Trang 2LỜI CÁM ƠN
Luận văn tốt nghiệp đĩng một phần quan trọng trong hành trang học tập của sinh viên nĩi chung, sinh viên ngành Sinh Học nĩi riêng Nĩ giúp tơi cĩ thê tiếp cận được với thực tế, cĩ thêm nhiều kiến thức về ngành học và định hướng cho lựa chọn nghiên cứu khoa học sau này; từ đĩ trang bị những kiến thức thực tế tổng quan giúp tơi cĩ khả năng định hướng tốt cơng việc và cĩ những chuẩn bị tốt sau khi kết thúc học tập ở trường
Tơi xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến Cơ TS Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện đề tài
Tơi xin gửi lời biết ơn chân thành đến quí Thầy Cơ Bộ mơn Sinh học - Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã cho tơi nền tảng kiến thức, cho tơi niềm tin để tơi cĩ thể học hỏi và trao đồi thêm kỹ năng của mình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến quí Thầy Cơ
Bộ mơn Hĩa học - Khoa Khoa Học Tự Nhiên, các anh chị cán bộ Phịng Sinh Học Phân Tử - Viện NC & PT Cơng Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tơi
hồn thành tốt luận văn
Tơi xin cám ơn bạn Nguyễn Phạm Phương Thảo và chị Ninh Khắc Huyền
Trân, Cao Học Sinh Thái Học K18 đã luơn đồng hành cùng tơi trong suốt quá trình
nghiên cứu, các bạn lớp Sinh Học K35 đã chia sẻ, động viên tơi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn
Cĩ thể trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, với vốn kiến thức và kinh nghiệm cịn non nớt, chắc chắn tơi khơng thể khơng cĩ những thiếu sĩt nhất định Rất mong được sự hướng dẫn, chỉ bảo từ phía quí thầy cơ, các anh chị đi trước đề tơi cĩ thể hồn thiện hơn, tiếp tục con đường nghiên cứu vì khoa học, vì xã hội
Xin chân thành cảm ơn!
Trang 3LỜI CAM KÉT
Tơi xin cam đoan Luận văn này được hồn thành dựa trên kết quả nghiên cứu
của tơi dưới sự hướng dẫn của Cơ Đái Thị Xuân Trang Các số liệu và kết quả trình
bày trong luận văn là hồn tồn trung thực và chưa từng được cá nhân nào cơng bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây
Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận văn
TS Đái Thị Xuân Trang Hồ Ngọc Phụng
Trang 4
-11-PHAN KY DUYET CAN BO HUONG DAN
Ts Dai Thi Xuân Trang
DUYET CUA HOI DONG BAO VE LUAN VAN
Cân Thơ, ngày tháng năm 2013 CHU TICH HOI DONG
Trang 5-MỤC LỤC
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU - 22292EEE©+E+22EEEEE++2222215122222221322222112ecee 1 LiL Dat VAI AG occ cecccecssssssscsssveessssseeessssessssvesssseessssessssssessssevesssuesssssetsssseieesseseees 1
1.2 Mục tiêu của đề tài
1.3 Nội dung nghiên CỨU ¿5:5 2x x2 HH HH Hư 2
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2222222222¿2¿22cceccereerreresree 3
2.1 Sơ lược về chất chống oxy hĩa - 2222¿+2222E+22+tEE2E1522E2EEE.ccrrrrkex 3 2.1.1 StressS OXy hĨa chì HH H1 HH re 3
2.1.2 Chất chống oxy hĩa -22222222c 2222222112122 4
2.1.2.1 Chất chống oxy hĩa cĩ bản chất enzyme . 5222cccvcce: 5 2.1.2.2 Chất chống oxy hĩa khơng cĩ bản chất enzyme . :¿ 7 2.2 Giới thiệu về Trolox con e U1 2.3 Đại cương về cây Nhàu . - 2222 2222122211122 cerre 12
2.3.1 Khoa phan loa ố 12
2.3.2 Đặc điểm Him thai e ccssessssssscssssssssssssessesseccssssssssessseecsssssssssssssnseeeeees 12
2.3.3 Thành phần hĩa học của cây Nhàu
2.4 Một số nghiên cứu về cây Nhàu . -2¿-2¿©2222+22+ttEEEEEErrtrrkkrrrrrrrrek 13
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
3.1 Phurong tin nghiém CUU occ 17
3.1.1 Dia diém va thoi gian thực hiện - - 5c net, 17
Trang 6-iv-3.1.3 Hĩa chất ch H001 17 3.1.4 Đối tượng nghiên cứu . -2c¿++2222+2++2222215222222112 22222212 errrkk 18 3.2 Phương pháp nghiÊn CỨU - 6 S9 Ek SE RE HH rgiưy 18 3.2.1 Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hĩa của cao chiết lá và rễ cây 0n, 0T ồ.ồ.ồ.ồ.ồ.ốẻốằốằố 18 3.2.1.1 Phương pháp trích cao lá và rễ cây Nhàu bằng dung mơi ethanol 18 3.2.1.2 Khảo sát sự chống oxy hĩa téng sé (Total Antioxidant Status (TAS) assay) in vitro của cao chiết lá và rễ cây Nhầu c2cccccccccce 19
3.2.2 Thống kê phân tích số liệu 2222222v++ccrrsttttEEEkrrvrrrrrrrree 20 CHƯƠNG 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN -¿22222222222222ccrrrrree 21 4.1 Xác định độ ẩm của các mẫu làm 21 4.2 Khao sat kha nang chéng oxy hĩa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS) assay) của cao chiết lá và ré cay Nhu it Vitro ccsscccssssssssssssssssesssssssssessesssseesseees 21 CHUONG 5 KET LUAN VA KIEN NGHI
1 Kết Wa icc cccccsescsssescsssssssssssesssssvecssssecsssssssssuesessssvecsssesessssecsssseestasneeessseeeesssees 27 2 Kiến nghị -222222222+222221222271111222T71111 221 E21 2 re 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 2222222+2222E15222E2E11112221711E122271 1 ccee 28
Trang 7
-V-MỤC LỤC HÌNH
Hình 4.1 Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hĩa tổng số in wirro Của “TTỌOX (St TT TT HH TH ghưệt 21 Hình 4.2 Phần trăm lượng ROS cịn lại sau phản ứng với chất chống oxy
hĩa cĩ trong cao chiết lá và rễ cây Nhàu 24
Trang 8-Vi-MUC LUC BANG
Bang 4.1 Độ ẩm của các mẫu cây . -2222222cetttcEEerrrrrrrrkrererrree 20
Bảng 4.2 Khả năng chống oxy hĩa tổng số của cao chiết lá và rễ cây Nhàu ¬— 22
Trang 9
-Vii-DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ECs : Effective concentration of 50%
EDTA: Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate GSH: Glutathione
GSSG: Glutathione disulfide GSH-Px: Glutathione peroxydase
LDL: Low-density Lipoprotein (Lipoprotein ti trong thap) NADPPH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate OD: Mat d6 quang phé
ROS: Reactive Oxygen Species SOD: Superoxide dismutase TAS: Total Antioxidant Status TBA: Acid thiobarbituric
TBA-RS: Thiobarbituric acid reactive substances
Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid
Trang 10-Viii-TĨM LƯỢC
Những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy sự phát triển của các bệnh lý như
bệnh ung thư, bệnh tim, xơ vữa động mạch, đái tháo đường do nhiều nguyên nhân
trong đĩ nguyên nhân chính là stress oxy hĩa Ngăn chặn sự tiến triển của các bệnh
lý trên bằng cách bổ sung các chất chống oxy hĩa tự nhiên hiện diện trong thực vật
do các chất chống oxy hĩa này cĩ khả năng làm sạch các gốc tự do cĩ hại cho cơ thể từ sự stress oxy hĩa Đề tài khảo sát khả năng chống oxy hĩa của cao chiết lá và rễ
cây Nhàu (Morinda cirjola L.) ín vữro được thực hiện nhằm đánh giá khả năng
chống oxy hĩa của lá và rễ cây Nhàu đề áp dụng vào điều trị bệnh Sự làm sạch gốc tự do của các cao chiết được đo lường thơng qua khả năng chống oxy hĩa tổng số (TAS) Kết quả nghiên cứu cho thấy, 2 mẫu cao chiết đều cĩ cĩ khả năng chống oxy hĩa nhưng ở mức độ khác nhau Ở nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1,5; 3; 5; 10 mg/ml, cao
rễ cĩ hàm lượng chất chống oxy hĩa tính tương đương theo ug Trolox cao hơn cao
lá Do đĩ, ở các nồng độ trên, cao rễ cĩ khả năng chống oxy hĩa tổng số TAS mạnh hơn so với cao lá Từ kết quả nghiên cứu đạt được cho thấy cao lá và rễ Nhàu cĩ khả năng chống oxy hĩa để làm sạch các gốc tự do từ sự stress oxy hĩa
Từ khĩa: cây Nhàu, TAS, Trolox, stress oxy hĩa, gốc tự do, chất chống oxy hĩa
Trang 11
-1X-CHUONG 1 GIOI THIEU 1.1 Đặt vấn đề
Stress oxy hĩa (oxidative stress) là kết quả của sự hình thành gốc tự do vượt
quá mức kiểm sốt của các hệ thống chống oxy hĩa trong cơ thể Điều này xảy ra khi các chất chống oxy hĩa cĩ nồng độ quá thấp, khơng đủ đề trung hịa các gốc tự do Kết qua các gốc tự do sẽ tắn cơng các phân tử lipid, protein, acid nucleic của tế bào dẫn đến tồn thương cục bộ và kết quả cuối cùng là gây sự hoạt động bắt thường của cơ quan (Meister, 1992; Katalinic et al., 2006) Stress oxy hĩa dẫn đến hậu quá là phát sinh nhiều loại bệnh của tuổi già như Parkinson (Tappel, 1968), Alzheimer (Behl, 1997) và một số bệnh về thần kinh khác (Reiter, 1995); xơ vữa động mạch,
bệnh đái tháo đường, bệnh phối, bệnh ung thư, viêm khớp, thối hĩa võng mạc, đục
thủy tính thể, suy giảm hệ thống miễn dịch (Langseth, 1995; Mahakunakorn, 2003)
Chat chéng oxy hĩa cĩ khả năng phục hdi các gốc tự do (ROS) Các hợp chất chống oxy hĩa như axit phenolic, polyphenol và flavonoid cĩ khả năng làm sạch các gốc tự do như peroxide, hydroperoxide hoặc lipid peroxyl và do đĩ ức chế cơ chế oxy hĩa (Prakash et al., 2000) Chat chéng oxy hĩa làm mat phản ứng của các gốc tự do bởi hai cơ chế chính (1) chuyển giao hydro nguyên tử (Hydrogen Atom
Transfer - HAT), và (2) chuyên giao điện tử duy nhất (Electron Transfer - ET)
(Huang et al., 2005)
Ngày nay, do ánh hưởng của điều kiện sống như ơ nhiễm mơi trường, tiếng ồn, căng thăng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hĩa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đĩ là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bắt lợi, tơn thương cho co thé va là nguyên nhân cua nhiều căn bệnh nan y Nên cần cĩ những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất cĩ khá năng chống oxy hĩa mang lại những tác dụng tốt, cĩ lợi cho sức khỏe của con người, mà các chất cĩ khả năng chống oxy hĩa cĩ nguồn gốc tự nhiên lại cĩ hiệu quả, an tồn và ít bị ơ nhiễm hơn các sản phẩm nhân
Trang 12
-1-tạo Vì vậy, việc điều tra và xác định các chất chống oxy hĩa tự nhiên từ thực vật là
quan trọng và cần thiết
Do đĩ đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHĨNG OXY HĨA CỦA CAO CHIET LA VA RE CAY NHAU (Morinda citrifolia L.) IN VITRO” duge thyc
hiện nhằm đánh giá khả năng chống oxy hĩa của lá và rễ cây Nhàu để áp dụng vào điều trị một số bệnh hiện nay như cao huyết áp, bệnh tiểu đường
1.2 Mục tiêu cúa đề tài
Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng chống oxy hĩa của cao chiết lá và rễ cây Nhàu Khả năng chống oxy hĩa của cao chiết lá và rễ cây Nhàu được đánh giá ïn vitro bang phương pháp TAS (Total Antioxidant Status)
1.3 Nội dung nghiên cứu
~ Trích các chất bằng dung mơi ethanol 99% từ lá và rễ cây Nhàu
Trang 13CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về chất chống oxy hĩa
2.1.1 Stress oxy hĩa
Stress oxy hĩa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hĩa và các chất oxy hĩa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hĩa (Katalinic et al., 2006)
Quá trình trao đồi chất và stress oxy hĩa tạo ra một số sản phẩm trung gian là
các gốc tự do (ROS: Reactive oxygen species) Gốc tự do là tất cá các phân tử hĩa
học chỉ cĩ một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay số điện tử lẻ Do các phân tử mang điện tử lẻ khơng cân bằng, khơng bền vững, dễ tạo ra phản ứng Các
phân tử mang điện tử lẻ luơn luơn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nĩ thiểu từ các
phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tu do mdi (Pal et al., 2011) Trong cơ thê cĩ rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxyl và nhất là gốc hydroxyl, là nguyên nhân gây ra nhiều tơn thương Các gốc tự do cĩ nguồn gốc oxy này cĩ hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) (Prakash et al., 2000)
Ban dau oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxide (O2e-), day la gốc tự do quan trọng nhất của tế bào Từ superoxide (O2°-) nhiéu gốc tự do và các phân tử
khác của oxy cĩ khả năng phản ung cao dugc tao ra nhu hydroxyl (HOs), hydroperoxyl (HOOs), peroxyl (ROOs), alkoxyl (ROs), lipoperoxide (LOOs), H,0, (Halliwell, 1991; Dyke et al., 1994)
Các dạng oxy hoạt động này do cĩ năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, ADN, gây rối loạn các quá trình sinh hĩa trong cơ thé (Prakash et al., 2000) Đồng thời, khi một phân tử sống bị
các gốc tự do tấn cơng, nĩ sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục
phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đồi cĩ tác hại đối với cơ thé, gốc tự do hủy hoại tế
Trang 14_3-bào bằng cách oxy hĩa màng tế _3-bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn cơng các ty thé, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Cuối cùng, bằng cách oxy hĩa gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể khơng tăng trưởng được (Packer, 1999) ROS cũng tham gia vào quá trình lão hĩa và sự phát triển của nhiều bệnh thối hĩa, bao gồm bệnh Alzheimer và
Parkinson (Ganske and Dell, 2006)
Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách như gốc tự do cĩ thể là sản phẩm của
những căng thắng tâm thần, mệt mỏi, ơ nhiễm mơi trường, thuốc lá, được phẩm, tia
phĩng xạ mặt trời, thực phẩm cĩ chất màu tổng hợp, nước cĩ nhiều chlorine và ngay cả oxygen (Halliwell, 1991; Donal, 2002)
Khơng phải là gốc tự do nào cũng cĩ hại đối với cơ thể Nếu được kiểm sốt, nĩ là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melanin cần cho thị giác, gĩp phần sản xuất prostaglandins cĩ cơng dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng
cường miễn dịch, dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kimh, co bĩp cơ thịt
(Halliwell, 1991; Donal, 2002) 2.1.2 Chat chống oxy hĩa
Chất chống oxy hĩa là những chất cĩ khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Chất chống oxy hĩa cĩ thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để tạo ra những gốc tự do mới kém hoạt động hơn, từ đĩ cĩ thể ngăn cản chuỗi phán ứng dây chuyền
được khởi đầu bởi các gốc tự do Chất chống oxy hĩa cũng cĩ thể gián tiếp tạo phức
với các ion kim loại chuyên tiếp trong phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzyme xúc tác cho các quá trình sinh ra gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong
cơ thể (Trần Hùng, 2006)
Trang 152.1.2.1 Chất chống oxy hĩa cĩ bán chất enzyme
Đây là hệ thống chống oxy hĩa nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế bào và giữ một
Vai trị quan trọng trong việc duy trì sự sống Tế bào sống luơn bị tổn hại bởi các gốc tự do sinh ra trong các quá trình sinh lý như quá trình hơ hấp và các quá trình bệnh lý Vì vậy, một hệ thống chống oxy hĩa nội sinh để bảo vệ tế bào là điều cần thiết
(Trần Hùng, 2006) Hệ thống đĩ bao gồm các enzyme như sau:
Superoxide dismutase
Superoxide dismutase (SOD) hién dién 6 hai vi tri trong té bao, SOD hién diện trong ty thể cĩ cofactor là mangan (Mn — SOD), SOD hién diện trong bao
tuong cé cofactor 1a đồng và kẽm (Cu, Zn — SOD) (Fridovich, 1986) SOD ở trong dich tế bào chỉ cĩ đồng tham gia vào quá trình xúc tác, kẽm chỉ tham gia vào sự ơn định enzyme SOD cĩ nồng độ cao nhất ở gan, thận và hồng cầu, xúc tác superoxide
thanh H,0>
O,7°+0,7° 8°, O;+H;O;
Cu thé: Cu*-SOD + Oy — Cu'*- SOD + 0;
Cu'* - SOD + Oy + 2H* > Cu” - SOD + HạO;
Hydrogen peroxide duoc tao thành là chất nguy hiểm trong tế bào vì nĩ cĩ thể chuyên thành gốc hydroxyl (trong phản ứng Haber — Weiss) là một trong những gốc nguy hiểm nhất cho tế bao (Borel et al., 2006)
“+ Glutathione peroxydase (GSH-Px)
Enzyme phân hủy H;O; ở các tế bào của động vật cĩ vú chủ yếu là GSH-Px
(Flohé, 1982) Glutathione (GSH) là cofactor của enzyme GSH-Px GSH là một
Trang 16thành trong các quá trình tổng hợp diễn ra trong cơ thể, xúc tác sự khử hĩa của H,05, cdc hydro peroxide va peroxide hitu co (Flohé, 1982)
H,0, + 2GSH — 2 H,O + GSSG ROOH + 2GSH — ROH + H,0 + GSSG
GSH: Glutathione dang khtr
GSSG (Glutathione disulfide): Glutathione dang oxy hĩa
Dang oxy héa phuc héi nhé glutathione reductase (GR)
GSSG + NADPH + H* _°., 2GSH+ NADPH
GSH-Px hoạt động khi HạO; ở nồng độ thấp, khi HạO; ở nồng độ cao catalase sẽ hoạt động Khi H;O; cịn lại rat it, catalase khơng cịn tác dụng thì GSH-Px được
hoạt hĩa và xúc tác phản ứng phân hủy H;O¿ Điều này rất quan trọng vì phản ứng với GSH-Px địi hỏi phải cĩ cơ chất là GSH, cịn phản ứng với catalase thi khơng
cần GSH, vì thế tiết kiệm được glutathione cho cơ thể (Mahakunakorn, 2003)
Catalase
Catalase c6 trong các peroxisome cua tất cả các mơ nhưng chủ yếu là ở trong
mo gan va than Catalase xtc tac phan huy rất mạnh H;O; thành H;O và xúc tác phản ứng giữa HạO; và chất cho proton (AH) (Chance at el., 1979; Mahakunakorn,
2003 )
2HạO; _€”“** ` 2H,O + O; 2H;O;+AH; _“#⁄% ` 2H,O+ A
Bộ ba enzyme catalase, SOD, GSH-Px bảo vệ những vị trí của cơ thể bị
“phơi nhiễm” như biêu mơ phổi, hồng cầu Ở những vị trí này bộ ba enzyme trên cĩ
Trang 172.1.2.2 Chất chống oxy hĩa khơng cĩ bản chất enzyme
Chất chống oxy hĩa khơng cĩ bản chất enzyme là những hợp chất do cơ thể
sinh ra (nguồn gốc nội sinh) như vitamin A, glutathione, glycine, methionine, hoadc
các chất chống oxy hĩa ngoại sinh cĩ nhiều trong thực vật gồm cĩ các nhĩm vitamin
C, vitamin E, flavonoid, lignan, alkaloid, courmarin, terpen, carotenoid Cac chat
này được xếp vào nhĩm các chất chống oxy hĩa khơng cĩ bản chat 1a enzyme (Tran Hùng, 2006)
“ Vitamin E
Vitamin E là một chất chống oxy hĩa hịa tan trong lipid, phân phối rộng khắp trong tế bào và được coi như là hàng phịng thủ trước tiên chống lại quá trình peroxide hĩa lipid Vitamin E bảo vệ các acid béo chưa bão hịa và cholesterol trong màng tế bào
Vitamin E giúp tiết kiệm selenium của enzyme GSH-Px và bảo vệ những chất tương tự chất béo khác như vitamin A khỏi bị phân hủy (Buettner, 1993) Trong sự hiện diện của ion Fe”'/ascorbate, vitamin E khơng ngăn chặn được sự khởi phát quá trình peroxide hĩa lipid nhưng gĩp phần làm chậm lại tiến trình này (Wagner,
1996) Vitamin E là một tập hợp 8 chat, trong d6 a — tocopherol là hợp chất thể hiện
hoạt tính chống oxy hĩa mạnh nhất Tinh chất chống oxy hĩa của a-tocopherol thể hiện qua việc ngăn chặn phản ứng của các gốc tự do bằng cách nhường 1 hydro (H) của gốc phenol cho gốc lipoperoxide (LOO») dé biến gốc tự do này thành hydroperoxyl (LOOR) theo phản ứng sau
LOO» + Tocopherol-OH —> LOOH + Tocopherol-O»
Trang 18s* Vitamin C
Vitamin C (acid ascorbic) được tìm thấy nhiều trong thực phẩm tươi, rau quả và trái cây Nĩ đĩng một vai trị hết sức quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thé Vitamin C giúp cho cấu trúc collagen ơn định, cần thiết cho sự lành vết thương, tăng sức đề kháng cho cơ thể Vitamin C cũng là một chất chống oxy hĩa rất quan trọng Vitamin C hoạt động như một chất chống oxy hĩa trong mơi trường nội bào lẫn ngoại bào Vitamin C cũng hoạt động cùng với các enzyme chống oxy hĩa khác như GSH-Px, catalase và SOD Hơn nữa, vì vitamin C phục hồi và tái tạo vitamin E từ dạng bị oxy hĩa trong cơ thể, nên nĩ tăng cường hiệu lực chống oxy hĩa của
vitamin E:
Tocopherol(TO') + Vitamin C (AseH') — Tocopherol(TOH) + gốc ascorbyl (Ase”) Các tơn thương oxy hĩa của LDL-cholesterol đĩng vai trị trung tâm trong sự hình thành xơ vữa động mạch Vitamin C ngăn chặn hữu hiệu sự oxy hĩa LDL ngay
cả đối với người hút thuốc lá
Tuy nhiên, trong vài trường hợp, vitamin C gây hại cho cơ thể vì nĩ cĩ thể đĩng vai trị là một chất tiền oxy hĩa Đặc biệt là khi nĩ ở nồng độ cao và cĩ sự hiện diện của các ion kim loại chuyển tiếp (Fe”, Cu”) Khi đĩ, vitamin C sẽ đĩng vai trị là chất tiền oxy hĩa xúc tác phản ứng Fenton tạo các gốc tự do O;*, HO" và H;O; (Buettner, 1993; Langseth, 1995)
+ Glutathione
Glutathione (GSH) 1a mt chat chống oxy hĩa nội sinh phổ biến cĩ phân tử lượng thấp GSH là một tripeptide gdm cdc acid amin nhu acid L-y-glutamic, L- cysteine va L-glycine Hoạt tính chống oxy hĩa của GSH được thể hiện theo 2 cách
Trang 192GSH+2R° — 2RH+2GS" GS’ + GS’ — GSSG
b) GSH đĩng vai trị là chất cho điện tử trong các phản ứng được xúc tác bởi enzyme GSH peroxidase và GSH-Px nhằm phân hủy các hợp chất peroxide hữu cơ
và vơ cơ độc hại
GSH rất quan trọng trong việc chống oxy hĩa ở não, nơi mà những chất
chống oxy hĩa khác như SOD, Catalase và GSH-Px cĩ nồng độ rất thấp Sự bất
thường của GSH trong não là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh Parkinson Ngoai ra, GSH cịn phản ứng với NO trong não tạo S-nitrosoglutathione làm giảm tác hại của NO lên tế bào thần kinh (Varga, 1991)
* Nhĩm các hợp chất polyphenol
Polyphenol là nhĩm các hợp chất tự nhiên cĩ nhiều nhĩm chức phenol trong cấu trúc phân tử Nhĩm này gồm cĩ các hợp chất phenol đơn giản, tanin và các hợp chất flavonoid Với cấu trúc cĩ nhiều nhĩm phenol, chúng cĩ khả năng ngăn chặn các chuỗi phản ứng dây chuyền gây ra bởi các gốc tự do bằng cách phản ứng trực
tiếp VỚI gốc tự do đĩ tạo thành một gốc tự do mới bền hơn, hoặc cũng cĩ thể tạo
phức với các ion kim loại chuyên tiếp vốn là xúc tác cho quá trình tạo gốc tự do Flavonoid là nhĩm hop chat polyphenol rất phé biến trong giới thực vật và đã cĩ trên 5000 hợp chất flavonoid đã được mơ tả (Harbourne, 1994) Cấu trúc chung của flavonoid 1a diphenylpropan (C6-C3-C6), Flavonoid cé 2 vong benzen C6 (vịng A va B) gan với dị vịng C3 cĩ oxy Flavonoid là nhĩm hợp chất cĩ cơng dụng quan
trọng trong cả thực vật và động vật (CrozIer e/ ai., 1997)
Do cĩ bản chất là polyphenol các flavonoid thường cĩ tính chống oxy hĩa mạnh giúp cơ thể chống lại các tổn thương do gốc tự do một cách hữu hiệu Nhờ
vậy, flavonoid cịn cĩ tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch (KrIs- Etherton et al., 2004; Ness et al., 1997)
Trang 20
_9-Do cĩ cấu trúc gan giéng voi a- tocopherol nên các flavonoid cé thé thay thé cho nhau trong một số hệ thống Bên cạnh tính chống oxy hĩa, flavonoid cịn cĩ khả năng ức chế một số enzyme Nhiều loại enzyme trong số này là các enzyme oxy hĩa khử như cyclooxygenase, lipoxygenase, và NADPH oxydase Flavonoid cịn cĩ khả năng chống ung thư một cách hiệu quả mặc dù cơ chế chính xác của tác động này vẫn chưa được hiểu rõ Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh ảnh hưởng của flavonoid trong sự ngăn ngừa phát sinh ung thư Điều này thúc đây nhiều nghiên cứu về sự ức chế phát sinh ung thư phụ thuộc flavonoid do việc loại các gốc tự do (Kris-Etherton et al., 2004; Zima and Kalousova, 2005)
Mỗi flavonoid đều cĩ những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ
trợ nhau Quercetin là một flavonoid phổ biến nhất, nĩ là genin cho nhiều loại
flavonoid khác như rutin, quercitrin Những dẫn xuất này khác nhau bới phần đường gắn vào khung quercetin
Quercetin đã được chứng minh là cĩ vai trị quan trọng trong hoạt động kháng viêm của cơ thể do nĩ cĩ thể ngăn chặn trực tiếp nhiều tiến trình khởi phát sự viêm bằng cách ức chế sự sản xuất và phĩng thích histamin và các chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị tmg (Formica ef al.,1995; Marozzi et al.,1970; Wadsworth et al., 1999) Ngoai ra quercetin cịn cĩ khả năng chéng oxy hĩa và tiết kiệm lượng vitamin C sử dụng Khi phản ứng với gốc tự do, quercetin tạo một gốc tự do mới bền hơn do hiệu ứng liên hợp trong cấu trúc quercetin nĩi riêng và các hợp chất phenol nĩi chung, giúp giải tỏa các điện tử tự do (Filipe et al., 2004)
Như vậy, khả năng chống oxy hĩa của flavonoid là do sự trung hịa các gốc tự do và làm chậm đáng kế sự khới đầu của quá trình peroxide hĩa lipid, tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp do đĩ ngăn chặn sự peroxide hĩa lipid, ức chế việc tạo ra các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzyme như xanthine oxidase, cyclooxygenase, lipoxygenase (Takuya et al., 2005)
Ở cấp độ tế bào, một trong những đặc tính hữu ích nhất của flavonoid — trung hịa các gốc tự do — là nhờ vào cấu trúc hĩa học cũng như sự liên kết chặt chẽ của nĩ
Trang 21-10-với màng tế bào; flavonoid bảo vệ LDL chống lại sự oxy hĩa ở giai đoạn khởi đầu của sự peroxide hĩa lipid Flavonoid gắn vào bề mặt của phân tử LDL hình thành
liên kết ether làm giới hạn sự tấn cơng mạnh mẽ của các tác nhân oxy hĩa và các
géc tu do (Takuya et al., 2005) Nhờ vậy mà flavonoid cĩ thể bảo vệ tế bào chống
lại các tơn thương do các gốc tự do một cách rất hiệu quả
2.2 Giới thiệu về Trolox
Trước đây, vitamin E đã được nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hĩa vì
vitamin E là một dạng œ-tocopherol tồn tại trong tế bảo và được chứng minh là chất làm sạch mạnh các gốc tự do gây thiệt hại cho màng tế bào (Oral et al., 2006)
Vitamin E làm sạch các gốc peroxyl tự do và hình thành œ-tocopherol phenoxyl tự
đo ít độc hại hơn cho cơ thé (Burton and Ingold, 1983)
Hợp chất Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) là dẫn xuất tan trong nước cĩ cấu trúc tương tự œ-tocopherol đã được nghiên cứu (Scott et al., 1974; Bisby et al.,1984) va Trolox 1a chat chéng oxy ha chuan thuong
được sử dụng để so sánh khả năng làm sạch gốc tự do của các chất cần được khảo sat (Wong et al., 2005)
Trang 22-11-2.3 Đại cương về cây Nhàu
2.3.1 Khĩa phân loại
Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Phân lớp hoa mơi (Lamiidae)
Bộ: Cà phê (Rubiales)
Họ: Cà phê (Rubiaceae)
Giống: Morinda
Lồi: Morinda citrifolia L
(Phạm Hồng Hộ, 2003)
2.3.2 Đặc điểm hình thái
Cây Nhàu cĩ tên khoa học là Morinda cirifolia L cây gỗ cao 4 - 8 m, thường mọc ở vùng nhiệt đới và ơn đới, ở nước ta nhàu thường mọc ở những nơi
am thap, dọc theo bờ sơng, ao, mương rach Canh non màu xanh, tiết diện vuơng, cĩ rãnh nhẫn, cành già tiết diện trịn, màu nâu xám (Trương Thị Đẹp, 2007)
Lá đơn, mọc đối, phiến lá to, hình bau dục hai đầu thuơn nhọn; dài 15 - 30
cm, rong 10 — 15 cm Lá màu xanh bĩng, đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn Bìa lá
hoi don sĩng Gân lá hình lơng chim, nổi rõ ở mặt dưới, 6 — 7 cặp gân phụ Cuống lá
dài 1 -3 cm Lá kèm nằm giữa hai lá mọc đối, hình xoan, màu xanh nhạt Cụm hoa là
đầu hình trịn hay hơi bầu dục, ở ngồi nách lá Trục cụm hoa hình trụ, màu xanh,
nhan, dai 1 — 2 cm Day cum hoa cé phién hẹp, dài 5 — 8 mm (Phạm Hồng Hộ, 2003; Trương Thị Đẹp, 2007)
Hoa đều, lưỡng tính Đài hoa là một gờ trịn Cánh hoa 5, phía dưới dính lại
thành ống tràng hình phễu, màu xanh nhạt, cao 7 — 12 mm, bên trong cĩ nhiều lơng
trắng; 5 thùy dài khoảng 5 —- 8 mm, màu trắng, hình bầu dục đầu nhọn, đỉnh cĩ phụ
Trang 23
-12-bộ là một mẫu nhỏ cong vào trong Khi hoa nở các thùy cong xuống phía dưới, tiền khai hoa vặn Bộ nhụy đực cĩ 5, bằng nhau, rời, gắn ở phần loe của ống tràng xen kẽ
với các cánh hoa, chỉ nhị rất ngắn Bao phần hình đầu tên, màu vàng nhạt, dài khoảng 4 mm Hạt phấn rời, hình cầu, màu vàng nhạt Lá nỗn cĩ 2, ở vi tri trước và sau, bầu dưới cĩ hai ơ, mỗi ơ một nỗn, đính phơi kiểu trung trục Vịi và đầu nhụy:
Vịi nhụy dạng sợi màu xanh nhạt, đài 5 mm; 2 đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài 3
mm, màu xanh Đĩa mật dày, hình khoen, màu vàng (Phạm Hồng Hộ, 2003;
Trương Thị Đẹp, 2007)
Quả hạch kép do bầu nỗn và một phần lá đài của các hoa trên cụm hoa dính nhau tạo thành Quả cịn non màu xanh nhạt, dài 5 — 7 cm, rộng 3 — 4 cm Quả già
màu ngà vàng, nhẫn bĩng, mùi khai, trên quả cịn vết tích các đĩa mật Hạt nhiều, hình bầu dục, một đầu nhọn, màu nâu đen (Phạm Hồng Hộ, 2003; Trương Thị
Đẹp, 2007)
2.3.3 Thành phần hĩa học cúa cây Nhàu
Rễ Nhàu chứa moridin là một anthraquinoic két tinh thanh tinh thé hinh kim,
màu vàng cam, tan trong nước sơi và các chất kiềm, ít tan trong nước lạnh, khơng
tan trong ether Ngồi ra, cịn cĩ 1-metoxyrubiazin, moridon, alizarin va 1-oxy-2,3-
dimetoxy anthraquinon Lá nhàu cũng cĩ chứa moridin Trong nhàu cịn cĩ nhiều
selenium, lignans, polysaccharides, flavonoids, iridoids, acid béo, catechin, B- sitoterol, damnacanthal, alkaloids (Truong Thi Dep, 2007)
2.4 Một số nghiên cứu về cây Nhàu
Nghiên cứu của Umezawa er al (1992) đã ly trích một hợp chất từ rễ Nhàu cĩ tên là 1-methoxy-2-foremyl-3-hydroxyanthraquinone cĩ thể kìm hãm sự xâm nhiễm của HIV lên các tế bào MT-4 mà khơng kìm hãm sự phát triển của tế bào
Hai chất được phân lập từ rễ Nhàu là Damnacathal và Nordamnacathal cĩ tác dụng gây độc ở cả hai dịng tế bào ung thư là dịng ung thư tế bào tiết hắc tố B16 va ung thư máu dịng L 1210 (Đỗ Quốc Việt er ai., 1998 )
Trang 24
-13-Nghiên cứu của Hirazumi and Furusawa (1999) trên nước ép trái cây của Morinda citrifolia chia mét polysaccharide giau chat chống hoạt động của khối u
Nghiên cứu thành phần hĩa học và một số dạng bào chế từ trái Nhàu Morinda citrifolia L của Võ Thị Bạch Tuyết er ai (2002)
Nghiên cứu hoạt động oxy hĩa của dịch chiết từ rễ, trái và lá Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dé danh giá hoạt động chống oxy hĩa của các cao chiết khác
nhau cua Zin et al (2002)
Trong cơng nghiệp dệt, Antraquinone là một nhĩm chất nhuộm tự nhiện màu
vàng hoặc đỏ cĩ trong rễ nhiều lồi Morinda Sp Chất nhộm màu này được sử dụng
rộng rãi trong cơng nghiệp nhuộm vải ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là phía Bắc
Thai Lan (Aobchey et al., 2002)
Nghiên cứu của Phạm Thị Vân Anh e¿ ai., (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của cao qua Nhau (Morinda citrifolia L.) trên động vật thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch bằng chiếu tia xạ Kết quả chứng minh được cao quả Nhàu làm tăng trọng lượng lách và tuyến ức tương đối, tăng số lượng bạch cầu lympho, mono, diệt tự nhiên so với lơ chuột chỉ chiếu tia gamma đơn thuần khơng được dùng thêm thuốc thử
Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sương e ai (2004) đã cơ lập một acid triterpen từ cao alcol của rễ cây Nhàu, Morinda cirifolia L Acid này được nhận
danh là acid ursolic dựa trên các dữ liệu phơ nghiệm
Theo nghiên cứu của Pu e/ ai (2004) thì chuột đực được uống nước ép trái Morinda cirifolia cĩ tác dụng ức chế sự làm rỗng dạ dày (gastric emptying) thơng qua một cơ chế liên quan đến kích thích cholecystokinin (CCK — cĩ tác dụng kích thích sự tiết của enzyme tuyến tụy và ức chế sự làm rỗng dạ dày) và kích hoạt thụ
thể CCK
Trang 25
-14-Rễ nhàu được dùng chữa cao huyết áp, chữa nhức mỏi tay chân, đau lưng, sài
uốn ván và nhiều bệnh khác Lá nhàu dùng chữa ly, tiêu chảy, cảm sốt và nấu canh
ăn cho bổ Dùng ngồi giã đắp làm lành vết thương, vết loét, làm chĩng lên da non Dịch lá được đùng đắp trị bệnh viêm khớp gây đau nhức Vỏ nâu nước dùng cho phụ
nữ sau khi sinh uống bổ Quá nhàu khi chín cĩ thể ăn với muối giúp dễ tiêu hĩa,
điều kinh, trị băng huyết, bạch đới Quả nướng chín ăn chữa kiết ly, ho hen, cảm và
phù thũng (Trương Thị Đẹp, 2007)
Dịch chiết trái Morinda citrjfolia đã được nghiên cứu về hoạt động chống
oxy hĩa, xác định tổng hàm lượng phenol và flavonoid theo những quy trình chiết khác nhau (Ramamoorthy and Bono, 2007)
Nghiên cứu của Nayak e¿ ai (2007) đánh giá hoạt động chữa lành vết thương của dịch chiết ethanol của lá Morinda citrifolia L Nghién cứu sử dụng chiết xuất ethanol của lá (150 mg/kg/ngày) được sử dụng để đánh giá các hoạt động chữa lành vết thương trên chuột Kết quả cho thấy ngày thứ II, các động vat điều trị bằng chiết xuất giám 71% khu vực vết thương so với nhĩm cịn lại giảm 57% Nâng cao khả năng co vết thương, giảm thời gian hình thành biểu mơ, tăng hàm lượng hydroxyproline và đặc điểm mơ học cho thấy chiết xuất lá Noni cĩ thể cĩ lợi ích điều trị trong việc chữa lành vết thương
Nghiên cứu của Palu et al (2007) điều tra các cơ chế cĩ liên quan đến những tac déng diéu hda mién dich cia Morinda citrifolia L in vitro và in vivo ở chuột
Nghiên cứu ảnh hưởng của cao quả Nhàu (Morinda cirjfolia L.) lên số lượng Iympho bào T CD4, T CD8 và sự chuyển dạng lympho bào trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid (CY) Kết quả cho thấy cao quả Nhàu làm tăng khá năng chuyển dạng lympho bảo, tăng số lượng lympho bào T
CD4 và T CD§ trong cả máu ngoại vi và tổ chức lách (Phạm Thị Vân Anh et al.,
2008)
Trang 26
-15-Nghiên cứu của Muralidharan and Srikanth (2009) được thiết kế để điều tra
các hoạt động chống loét của dịch chiết ethyl acetate cua trai Morinda citrifolia L trên các mơ hình loét dạ dày và tá tràng khác nhau ở chuột Morinda citrifolia cho
thấy sự ức chế acid đạ dày tối đa (53,54%), acid tự do (52,55%) và acid tổng số (30,30%) Các chỉ số loét trong các động vật được điều trị bằng M cirjfolia ít hơn
đáng kể so với các trường hợp điều trị bằng thuốc theo tiêu chuẩn Từ đĩ cho thấy rằng M ciirjfolia cĩ khả năng chống loét đáng kế để bảo vệ niêm mạc đạ dày và tá tràng
Morinda cirifolia cịn được sử dụng để nghiên cứu khả năng kháng khuẩn
Lá được say khơ, nghiền thành bột Sử dụng dung mơi khác nhau như benzen, chloroform, ethyl acetate, ethanol và nước dé tách chiết Bốn sinh vật, cụ thé 1a vi
khuẩn Escherichia coli, tụ khuân cau Staphylococus aureus, nam Candida albicans va nam Aspergillus niger da dugc sit dung dé diéu tra Két quả xét nghiệm kháng khuẩn cho thấy chất chiết xuất từ Noni cĩ khả năng chống lại các sinh vật thứ
nghiém (Usha et al., 2010)
Vỏ rễ Nhàu Morinda cirifolia L được sử dụng để nghiên cứu đánh giá tác dụng giảm đau trong các mơ hình động vật khác nhau Nghiên cứu cho thấy chiết xuất methanol vỏ rễ Nhàu cĩ hiệu quả giảm đau tương tự như aspirin và NSAIDs (Nonsteriodal anti-inflammatory drugs) (Prasad et al., 2010)
Ngồi việc nghiên cứu hoạt động chống oxy hĩa, Morinda cirifolia cịn được
tập trung nghiên cứu hoạt động làm sạch gốc tự đo của dịch chiết ethanolic của rễ
Morinda citrifolia trong ống nghiệm (Pal er al., 2011)
Bên cạnh đĩ, các tác dụng chống trầm cảm của các chất chiết xuất từ trái cây Morinda citrifolia đã được nghiên cứu trong ơng nghiệm với các xét nghiệm sinh
học monoamine oxidase (MAO) A và B chỉ ra rằng trái cây Nonl cĩ chất ức chế
MAO-A va MAO-B tự nhién (Deng and West, 2011)
Trang 27
-16-CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện Địa điểm thực hiện :
Phịng thí nghiệm Sinh Học, Bộ mơn Sinh, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Đại
Học Cần Thơ
Phịng thí nghiệm Sinh Học Phân tử, Viện NĐC và PT Cơng Nghệ Sinh Học,
Đại Học Cần Thơ
Thời gian thực hiện: từ tháng 12/2012 đến tháng 4/2013
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
3.1.2.1 Dụng cụ
Eppendorf 1,5 ml va 2 ml, micropipette (10 — 100 ul, 100 - 1000 pl), dau cone (vang 100 wl, xanh 1000 wl), chai thuy tinh (50 ml, 250 ml, 1000 ml), cốc thủy
tinh (40 ml, 1000 ml), ống đong (10 mi, 1000 ml), kim mũi giáo, găng tay, giấy bạc 3.1.2.2 Các thiết bị sứ dụng
Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm máy cơ quay (Evaporate), máy đo quang phổ BecKman Coulter 640B (Mỹ), máy ly tâm lạnh Mikro 220R (Đức),
cân phan tich AB104-S, may do pH Metler Toledo, may trộn mau Vortex, may
khuấy từ, máy Ổn nhiệt
3.1.3 Hĩa chất
Hĩa chất sử dụng trong thí nghiệm gồm acid acetic (Merck - Germany), hydrogen peroxide (H,O2) (Merck - Germany), disodium dihydrogen
ethylenediaminetetraacetate (C1)H,4N2Na,Og.2H,O) (EDTA) (Merck - Germany), ammonium iron (II) sunfate hexahydrate (Fe(NH,)2(SO.)2) (Merck - Germany), sodium benzoate (Trung Quéc), acid thiobarbituric (TBA) (Merck - Germany),
Trang 28
-17-Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) (Denmark), ethanol 99° (Trung Quéc), Na ,HPO,.12H,O và NaH;PO¿.I2H;O dang tinh thé, natri hydroxit (NaOH)
3.1.4 Đối tượng nghiên cứu
Lá và rễ Nhàu được thu từ cây trong tự nhiên khơng phun xịt thuốc được cắt
nhỏ phơi khơ đến khi trọng lượng khơng đổi
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hĩa cúa cao chiết lá và rễ cây Nhau in vitro
3.2.1.1 Phương pháp trích cao lá và rễ cây Nhàu bằng dung mơi ethanol
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là lá và rễ của cây Nhàu được thu hái ở tỉnh Kiên Giang Mẫu sau khi thu được định danh dựa vào các đặc điểm hình thái của thực vật và tham khảo tài liệu từ bộ sách cây cỏ Việt Nam của Phạm Hồng Hộ (2003) Sử dụng tồn bộ rễ (rễ chính và rễ con) của cây Nhàu Đối với mẫu lá Nhàu, chỉ lấy những lá ở giai đoạn giữa của cành, màu xanh bĩng, khơng sử dụng những lá quá non hay quả già
Các mẫu được rửa sạch bằng nước với trọng lượng mẫu tươi là 3 kg Mẫu
được cắt nhỏ, dé riêng, phơi khơ cho đến khi trọng lượng khơng đổi, sau đĩ cân lại
lần nữa dé xác định trọng lượng mẫu khơ Độ 4m của nguyên liệu là sự chênh lệch
giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khơ và được tính theo cơng thức sau:
Trọng lượng tươi — Trọng lượng khơ
X 100 %
Trọng lượng tươi
Trang 29
-18-Mẫu sau khi phơi khơ cho vào túi nylon sạch, ghi nhãn, bảo quản ở nhiệt độ phịng để sử dụng cho nghiên cứu
250g mỗi loại lá và rễ của cây Nhàu khơ được cho vào túi vải, cột chặt sau
đĩ cho vào bình thủy tinh, cho ethanol (99%) vào đến khi vừa ngập mẫu
Mẫu được ngâm trong 48 giờ ở nhiệt độ phịng, sau đĩ lọc lấy phần nước dịch ngâm mẫu và cơ đuơi dung mơi bằng hệ thống máy cơ quay (Evaporate) ở nhiệt
độ cĩ định 56°C va áp suất thấp (180 ppm) Sau khi tách loại bỏ lượng đung mơi
ethanol thu được cao thơ ethanol Cao ethanol từ lá và rễ Nhàu được trữ ở 4°C để sử dụng cho các thí nghiệm sau
3.2.1.2 Khảo sát sự chống oxy hĩa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS) assay) in vifro của cao chiết lá và rễ cây Nhàu
TAS được xác định theo phương pháp của Koracevic e/ ai., (2000) cĩ hiệu
chính như sau: 10 uL cao ethanol từ các bộ phận cây Nhàu được pha lỗng trong 490 uL dung dịch đệm phosphate natri 100 mM pH 7.4 được cho vào hỗn hợp gồm 0,5 mL dung dich benzoate natri 10 mM voi 0,2 mL Fe —- EDTA (2 mL Fe - EDTA
được pha từ 2 mM dung dich EDTA voi 2 mM dung dich Fe(NH4)2(SOu)2) Sau do
0,2 mL H,O, 10 mM được cho vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều và ủ ở 37C trong 60
phút Sau khi ủ, 1 mL acid acetic 20% va TBA (thiobarbituric acid) 0,8% trong
NaOH được thêm vào ống nghiệm Hỗn hợp phản ứng sau khi ủ ở 100°C trong 30 phút được để nguội ở nhiệt độ phịng Độ hấp thu quang phổ của phản ứng được đo ở bước sĩng 532 nm
Phản ứng TAS trong thí nghiệm này được thực hiện theo nguyên tắc tạo ra
các gốc tự do dé đánh giá sự hiện diện của chất chống oxy hĩa cĩ trong lá và rễ của cây Nhàu Dung dịch benzoate natri kết hợp với Fe(NH¿);(SO¿); tạo ra các Oz (superoxide) Nếu trong lá, rễ của cây Nhàu cĩ hiện diện các chất chống oxy hĩa thì
sẽ kết hợp với các superoxide Lượng superoxide cịn lại sẽ kết hợp với TBA để
Trang 30
-19-thành lập TBA — RS (thiobarbituric acid reactive substances) được đo ở bước sĩng, 532 nm
3.2.2 Thống kê phân tích số liệu
Số liệu được trình bày bằng Mean + StDev Kết quả được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA bằng phần mềm Minitab 16.0
Trang 31
-20-CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định độ ẩm của các mẫu cây
Độ âm của các mẫu cây chính là lượng nước cĩ trong mẫu cây được tính tốn dựa trên sự chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khơ của mẫu Độ ẩm của các mẫu cây được thể hiện trong Bang 4.1
Báng 4.1 Độ ấm của các mẫu cây
Tênmẫu Trọng lượngtươi(g) Trọng lượng khơ(g) Độấm(%)
Lá Nhàu 3000 640 78,67
Rễ Nhàu 3000 850 71,67
Qua số liệu ở Bảng 4.1 cho thấy độ âm của lá (78,67%) cao hơn so với rễ
(71,67%) Độ âm của rễ Nhàu trong nghiên cứu này phù hợp với độ âm của rễ Nhàu theo nghiên cứu của Phạm Thị Lan Anh (2011) là 72,1%
4.2 Khao sat kha năng chống oxy hĩa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS)
assay) cúa cao chiết lá và rễ cây Nhàu iw viro
Phương pháp đo lường khả năng chống oxy hĩa tổng số TAS cĩ thể xác định được lượng chất chống oxy hĩa hiện diện trong một mẫu Tuy nhiên, TAS cĩ thể thay đơi do stress oxy hĩa (Erejuwa er al., 2011)
Khả năng chống oxy hĩa của cao chiết cây Nhàu ở từng nồng độ được tính
theo đường chuẩn Hg Trolox được thể hiện trong Hình 4.1 và Bảng I (phụ lục 1)
Trang 32
-21-= + y = -0.0038x + 1.0928 12 R’ = 0.9858 Độ hấp thụ quang phố (532 nm) 0.8 0.6 0.4 0.2 => 0 50 100 150 200 250 300
Khối lượng Trolox (ng)
Hình 4.1: Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hĩa tổng số in vifro của Trolox
Theo kết quả Hình 4.1 gia tri OD do được tỷ lệ nghịch với nồng độ Trolox
Khi nồng độ Trolox thấp giá trị OD đo được rất cao và ngược lại Điều này chứng tỏ khi nồng độ Trolox thấp, lượng chất chống oxy hĩa hiện diện thấp do đĩ các
superoxide cịn lại nhiều sẽ kết hợp tạo ra nhiều TBA — RS vi thé lam tang gia tri
OD và ngược lại Kết quả phân tích thống kê cho thấy, giá trị OD đo được ở các
nồng độ Trolox đều khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5% (P<0,05)
Trang 33
-22-Bảng 4.2: Khá năng chống oxy hĩa tổng số cúa cao chiết lá và rễ cây Nhàu
Nồng độ cao
chiết (mg/ml) Cao lá Cao ré
0 OD 1,1328° + 0,0225 1,1328° + 0,0225 0,25 OD 1,0475° + 0,0088 0,9728 + 0,0159 Trolox 11,91' +231 31,571 44,19 0,5 OD 0,9764° + 0,0035 0,9113° + 0,0060 Trolox 30,63" + 0,92 47,76" + 1,58 0,75 OD 0,9200° + 0,0095 0,8756° + 0,0044 Trolox 45,48° + 2,50 57,17Ẻ + 1,17 1 oD 0,8480° + 0,0058 0,8390° + 0,0037 Trolox 64,42! + 1,52 66,80' + 0,97 1,5 OD 0,7573' + 0,0011 0,7364' + 0,0018 Trolox 88,29° + 0,30 93,78° + 0,48 2 OD 0,6443* + 0,0103 0,62925 + 0,0158 Trolox 118,02° + 2,72 122,00° + 4,17 3 OD 0,5429" + 0,0319 0,4775" + 0,0031 Trolox 144,71° + 838 161,91° + 0,80 5 oD 0,3525' + 0,0058 0,2930' + 0,0050 Trolox 194,82°+ 1,51 210,46? + 1,31 10 oD 0,2583i + 00020 0,1524! + 0,0058 Trolox 219,61°+ 0,53 247,48" + 1,53
Ghi chú: Các chữ cái theo sau trong cùng cột khác nhau sẽ khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5% OD: Mật độ quang phổ đo ớ 532 nm
Trang 34
-23-Khả năng chống oxy hĩa tổng số ở các nồng độ của cao ethanol lá và rễ cây Nhàu được tính tốn theo ug Trolox dựa vào phương trình đường chuẩn y = -0.0038x + 1.0928 (RŸ = 0.9858) (Hình 4.1) được thể hiện trong Bảng 4.2 Kết quả ở Bảng 4.2 cho thấy nơng độ cao chiết tăng thì giá trị Trolox tương ứng cũng tăng theo
Đối với cao ethanol lá cây Nhàu hàm lượng chất chống oxy hĩa tính tương duong theo pg Trolox ting dan tir 11,91 + 2,31 wg Trolox ở nồng độ là 0,25 mg/ml
lên 219,61 + 0,53 ug Trolox ở nồng độ là 10 mg/ml Như vậy, cao chiết lá Nhàu cĩ
khả năng chống oxy hĩa tăng dần theo nồng độ và ở nồng độ 10 mg/ml thì khả năng chống oxy hĩa mạnh hơn so với các nồng độ cịn lại Hàm lượng chất chống oxy hĩa tính tương đương theo Ig Trolox giữa các nồng độ của cao lá đều cĩ khác biệt cĩ ý
nghĩa thống kê ở mức 5% (P <0,05)
Hàm lượng chất chống oxy hĩa tính tương đương theo ug Trolox của cao
ethanol ré cay Nhau tang dần từ 31,57+4,19 ug Trolox ở nơng độ là 0,25 mg/ml lên 247,48 + 1,53 ug Trolox ở nong do 1a 10 mg/ml Nhu vay, cao chiết rễ Nhàu cĩ khả
năng chống oxy hĩa tăng dần theo nồng độ và ở nồng độ 10 mg/ml thì khả năng chống oxy hĩa mạnh hơn so với các nồng độ cịn lại Gid tri trong duong ug Trolox giữa các nồng độ của cao rễ cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5% (P
<0,05)
Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở nồng độ 1; 2 mg/ml, ham luong chat chéng oxy hĩa tính tương đương theo g Trolox của cao lá và cao rễ cho thấy khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê Như vậy ở các nồng độ trên, khá năng chống oxy hĩa tổng số TAS của cao lá và cao rễ tương đương nhau (Bảng 2 — phụ lục 1)
Kết quá thí nghiệm cho thấy, ở nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1,5; 3; 5; 10 mg/ml,
cao rễ cĩ hàm lượng chất chống oxy hĩa tính tương đương theo uug Trolox cao hơn cao lá Do đĩ, ở các nồng độ trên, cao rễ cĩ khá năng chống oxy hĩa tổng số TAS mạnh hơn so với cao lá (Bảng 2 — phụ lục 1)
Trang 35-24-Giá trị OD đo được chính là lượng gốc tự do (ROS) cịn lại sau khi đã kết hợp
với chất chống oxy hĩa trong cao chiết Vì thế cĩ thể kết luận rằng giá trị OD thấp thì lượng gốc tự đo cịn lại thấp hay lượng gốc tự do đã kết hợp với chất chống oxy hĩa nhiều Điều này cũng khẳng định trong các nhĩm cĩ giá trị OD thấp cĩ sự hiện diện của rất nhiều chất chống oxy hĩa
Phần trăm lượng gốc tự do cịn lại sau khi kết hợp với chất chống oxy hĩa trong cao chiết lá và rễ cây Nhàu được trình bày trong Hình 4.2 và Bảng 3 (phụ lục
1) g 100 on Š gọ l 5 f Ư Cao lá = Ữ E] Cao rễ : 60 = Ss 40 nm ° me 20 ep E 5 5 ¬ 0 Ẫ | Đối 0/25 05 0,75 1 1,5 2 3 5 10 Chứng
Nong do cao chiét (mg/ml)
Hinh 4.2: Phan tram lượng ROS cịn lại sau phản ứng với chất chống oxy hĩa cĩ trong cao chiết lá và rễ cây Nhàu
Theo kết quả ở Hình 4.2 và Bảng 3 (phụ lục 1) cho thấy phần trăm lượng gốc
tự do cịn lại sau khi kết hợp với chất chống oxy hĩa tỉ lệ nghịch với nồng độ cao
chiết Điều này chứng tỏ rằng khi nồng độ cao chiết càng cao thì chất chống oxy hĩa hiện diện trong cao chiết càng nhiều Do đĩ, chất chống oxy hĩa này sẽ kết hợp với
các superoxide Lượng superoxide cịn lại ít sẽ kết hợp tạo ra ít TBA — RS vì thế làm
Trang 36
-25-giảm giá trị OD và ngược lại Vì vậy, phần trăm lượng gốc tự do cịn lại sau khi kết
hợp với chất chống oxy hĩa càng giảm và ngược lại Như vậy, phần trăm lượng gốc tự đo cịn lại sau khi kết hợp với chất chống oxy hĩa càng thấp thì lượng chất chống oxy hĩa càng nhiều
Kết quả được trình bày ở Hình 4.2 cho thấy, phần trăm lượng gốc tự do cịn
lại nhiều nhất ở nồng độ 0,25 mg/ml, với cao lá là 92,48 + 0,78 %, cịn ở cao rễ là
85,88 + 1,41 % Phần trăm lượng gốc tự do giảm dần và cịn lại khoảng 55% ở nồng độ 2 mg/ml Và ở nồng dé 10 mg/ml, gốc tự do cịn lại ở cao lá là 22,80 + 0,18 % và
cao rễ là 13,45 + 0,51 %
Giá trị ECso (Effective concentration of 50%) của cao ethanol lá và rễ Nhàu được tính tốn dựa theo đồ thị của từng cao chiết Trong đĩ, ECs cao lá là 2,8390 +
0,0994 mg/ml va cao ré 14 2,1150 + 0,0023 mg/ml Nhu vay, cao ré c6 kha nang chống oxy hĩa mạnh hơn so với cao lá
Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy trong cao ethanol của lá và rễ cây Nhàu cĩ nhiều chất chống oxy hĩa Đây cũng là cơ sở khoa học bổ sung thêm giá trị cho nguồn tài nguyên cây Nhàu
Trang 37
-26-CHƯƠNG 5 KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 1 Kết luận
Cao ethanol lá và rễ cây Nhàu đều cĩ tác dụng chống oxy héa in vitro
Hiéu qua loai bo gốc tự do (ROS) của cao chiết Nhàu theo thứ tự rễ (ECao = 2,115 +0,0023 mg/m]) và lá (ECao = 2,839 + 0,0994 mg/ml)
2 Kiến nghị
Xác định thành phần hĩa học hiện diện trong cao chiết cĩ tác dụng chống oxy hĩa
Khảo sát ánh hưởng của các cao chiết cây Nhàu đến quá trình oxy hĩa ở mức
d6 in vivo
Trang 38
-27-TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt
Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung (1998) Tác dụng chống ung thư của Damnacathal
và Nordamnacathal chiết xuất từ rễ Nhàu (Morinda citrifolia L.) Tạp chí được
hoc (Vietnamese Journal of Pharmacy) 5 (361), 8-10
Nguyễn Ngọc Sương, Nguyễn Như Nguyện, Võ Thị Linh Chi (2004) Acid triterpen từ rễ cdy Nhau (Morinda citrifolia L.) Tap chi phat triển KH&CN,
số 11-2004
Phạm Thị Lan Anh (2011) Khảo sát khả năng hạ đường huyết của một số dược liệu dân gian Trường Đại Học Cần Thơ Luận Văn tốt nghiệp cao học
Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Trọng Thơng và Vũ Thị Ngọc Thanh (2004) Nghiên
cứu ảnh hưởng của cao quả Nhàu (Morinda cirjfolia L Rubiaceae) trên động vật thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch bằng chiếu tia xạ TC Nghiên cứu y học Số: 8 Trang: 82 — 86
Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Trọng Thơng, Phạm Thiện Ngọc, Phan Thị Thu Anh (2008) Nghiên cứu ảnh hưởng của cao qua Nhau (Morinda citrifolia L.) lén
số lượng lympho bào T CD4, T CD8 và sự chuyển dạng lympho bào trên chuột nhat trắng bị gây suy giảm miễn dịch bang cyclophosphamid (CY) TCNCYH
60 (1): 91-96
Phạm Hồng Hộ (2003) Cây cỏ Việt Nam — Quyển II Nhà xuất bản trẻ Hà Nội
Trần Hùng (2006) Bài giảng: Chất chống oxy hĩa tự nhiên trong chăm sĩc sức khoẻ, Bộ mơn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y dược TP HCM
Trương Thị Đẹp (2007) Thực vật được Nhà xuất bản y học thành phố Hồ Chí
Minh
Trang 39
-28-Võ Thị Bạch Tuyết, Tơn Thị Thùy, Nguyễn Thới Nhâm (2002) Khảo sát thành phan hĩa học và một số dang bao chế từ trái Nhàu Morinda citrifolia L
Rubiaceae Y Học TP Hồ Chí Minh Tập 6 Phụ bán của số 1: 150 — 153 * Tài liệu tiếng Anh
Aobchey P., Sriyam S., Praharnripoorab W., Lhieochaiphant § and Phutrakul S
(2002) Production of Red Pigment from the Root of Morinda
angustifolia Roxb var scabridula Craib by Root Cell Culture CMU Journal (2002) Vol 1(1) : 66-78
Behl, C (1997) Amyloid beta-protein toxicity and oxidative stress in Alzheimer's
disease Cell and Tissue Research, 290(3), 471-80
Bisby, R H., Ahmed, S & Cundall, R B (1984) Biochem Biophys, 245-251 Borel J.P., Maquart F.-X, Ph Gillery, M.E (2006) Biochemistry for clinicians Buettner G.R (1993) The pecking order of free radicals and antioxidants: Lipid
peroxidation, Tocopherol, and Ascobate Archives of Biochemistry and Biophysics, 300(2), 535 — 543
Burton, G W & Ingold, K U (1983) Protective Agents in Cancer (McBrien, D C H & Slater, T F., eds.), 81-92
Chance B., Sies H., Boveris A (1979) Hydroperoxide metabolism in mammalian
organs Physiologycal Reviews, 59, 527-605
Crozier A., Jensen E., Lean E.J.M., McDonald M.S (1997) Quantitative analysis of
flavonoids by reversed phase high performance liquid chromatography Journal of Chromatography, A 761, 315-321
Deng S and B.J West (2011) Antidepressant Effects of Noni Fruit and its Active Principals Asian Journal of Medical Sciences, 3(2): 79 — 83
Trang 40
-29-Donald Armstrong (2002) Oxidants and Antioxidants, Ultrastructure and Molecular Biology Protocols, Humana Press, 2002, Volume 196, 3-12
Dyke, K.V., Dyke, C.V., Woodfork, K., (1994) Luminescence Biotechnology:
Instruments and Applications CRC Press, section 5, 379-459
Erejuwa O.0., S.A Sulaiman, M.S.A Wahab, Salam, M.S.M Salleh and S Gurta
(2011) Comparision of antioxidant effects of honey glibenclamide metformin and their combinations in the kidneys of streptozotocin-induced diabetic rats Int J Mol Sci, 12(1), 829-843
Filipe P., Haigle J., Silva J.N.,et al (2004) Anti- and pro-oxidant effects of
quercetin in copper-induced low density lipoprotein oxidation Quercetin as an effective antioxidant against pro-oxidant effects of urate European Journal of
Biochemistry, 271, 1991-1999
Flohé L (1982) Glutathione peroxidase brought into focus In: Pryor WA Free radicals in biology New York: Academic Press, 223-254
Formica J.V., Regelson W (1995) Review of the biology of Quercetin and related bioflavonoids Food and Chemical Toxicology, 33, 1061-1080
Fridovich (1986) Superoxide dismutases Methods in Enzymology, 58, 61-97
Ganske, F., Dell, EJ (2006) ORAC Assay on the FLUOstar OPTIMA to
Determine Antioxidant Capacity Application Note 148 Rev 12/2006
Halliwell, B (1991) Reactive oxygen species in living systems Am.J.Med, 91: 14S
Harbourne J.B (1994) The flavonoid: advances in searches in research since 1986 London; New York: Chapman & Hall
Hirazumi A and E Furusawa 1999 An immunomodulatory polysaccharide — rich
substance from the fruit juice of Morinda citrifolia (Noni) with antitumour
activity Phytother Res, 13, 380 — 387