Sự thiếu electron tự nhiên của các phân tử Anthocyanin giúp cho các hợp chất này đặc biệt hoạt động. Một số cơ chế chống oxy hóa của Anthocyanin có được từ các nghiên cứu như sau:
Ngăn chặn các gốc hoạt động bằng cách cho hydro.
Chelate các ion kim loại xúc tác cho các phản ứng oxy hóa. Liên kết với các protein, tạo phức chất bền.
Phản ứng thế vào 2 nhóm hydroxy nằm ở vị trí ortho trong vòng B của Anthocyanin và cyanidin đóng vai trò quan trọng giúp ổn định các gốc tự do. Ngoài ra, nhóm ortho- dihydroxy này còn có khả năng chelate các ion kim loại và từ đó ngăn chặn sự peroxy hóa lipid (Tuyền et al., 2011).
Tsuda et al. đã tìm cách giải thích cơ chế chống oxy hóa của Cyanidin-3- glucoside (C3G) bằng cách cho phản ứng với gốc alkylperoxyl. Dựa trên sản phẩm của phản ứng, các tác giả cho rằng C3G chống oxy hóa theo cơ chế khác với alpha- tocopherol và giả thuyết rằng C3G phá vỡ cấu trúc và quét các gốc tư do.
Các hợp chất flavanoid nói chung trong đó có Anthocyanin chống oxy hóa bằng cách quét các gốc O2 tự do, hay phản ứng với các gốc peroxy tham gia vào phản ứng oxy hóa dây chuyền. Nhờ vào khả năng cho các gốc tự do H+, các hợp chất này có thể ức chế được phản ứng peroxy hóa lipid. (Tuyền et al., 2011).
hydro. Phương pháp này đã được giới thiệu gần 60 năm trước bởi Marsden Blois, Đại học Stanford. Đã có nhiều kết quả thí nghiệm chứng minh rằng phương pháp Blois phù hợp cho việc khảo sát khả năng chống oxy hóa như nghiên cứu của Kim et al.,(2002); Zhu et al.,(2002); Nurliyana et al.,(2010); Prakash et al.,(2000); Mensor et al.,(2001)... DPPH là phân tử dạng bột có màu đen đặc trưng, có chứa gốc tự do ổn định, có màu tím đặc trưng khi hòa tan trong dung môi.
Nguyên tắc của việc giảm các gốc tự do trong phương pháp DPPH là do chất chống oxy hóa phản ứng với các gốc tự do ổn định trong DPPH chuyển đổi thành DPPH-H (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazine). Trong phương pháp DPPH, các chất chống oxy hóa có thể cho đi một hydro để làm giảm các gốc tự do ổn định trong DPPH. Khi các chất chống oxy hóa làm sạch các gốc tự do thì màu tím đặc trưng của DPPH sẽ nhạt dần và xuất hiện màu vàng của DPPH-H. Sự biến đổi màu này tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH (Ko et al., 1998; Hu and Kitts, 2000; Prakash et al., 2000; Mensor et al., 2001; Deshmukh, 2009).
Thời gian phản ứng được đề xuất đầu tiên là 30 phút (Blois,1958) và đã được tiến hành trong các nghiên cứu khác (Kim et al.,2002). Khoảng thời gian phản ứng ngắn hơn cũng từng được đề xuất: 5 phút (Lebeau et al.,2000), 10 phút (Schwarz et al.,2001). Tuy nhiên , thời gian phản ứng tùy thuộc vào chất chống oxy hóa vì mỗi cơ chất có khả năng và tốc độ làm sạch DPPH khác nhau (Brand et al.,1995; Bondet et al.,1997). Do đó, thời gian phản ứng tốt nhất là khi cơ chất đã là sạch tối đa gốc tự do trong DPPH (Lu et al.,2000; Sanchez et al.,1999; Yepez et al.,2002).
Có nhiều bước sóng hấp thụ được đưa ra: 515nm, 516nm, 518nm, và 520nm (Nguyễn Thanh Diễm, 2012). Tuy nhiên bước sóng hấp thụ tối đa trong hầu hết các cơ chất được các nhà khoa học chấp nhận là 517nm (Blois,1958; Zhu et al.,2002).
CHƯƠNG III.PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ tháng 06/2014 đến tháng 12/2014
Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
II. Phương tiện nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu
Cây mồng tơi tím thu hoạch từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ và các tỉnh lân cận như Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long.
2.1.2 Dụng Cụ
Bình hút, chân không bình tam giác 250ml, bình tia, bông gòn, ca nhựa có chia vạch thể tích, chai nắp xanh (500ml, 1000ml), chày, cối sứ, cốc thủy tinh (250 ml, 100ml, 50ml), cuvette, đầu cone, đèn cồn, giấy lọc, micropippet các loại (10-100l, 100-1000l), ống đong, ống nghiệm thủy tinh, ống nhựa.
2.1.3 Thiết Bị
Máy đo pH, máy khuấy từ, tủ sấy, máy đo quang phổ UV-VIS, máy hút chân không, tủ lạnh trữ mẫu, cân điện tử, bể điều nhiệt.
2.1.4 Hóa Chất
Thí nghiệm tách chiết anthocyanin: ethanol 96%, HCl 0.1N, nước cất, Na2HPO4 0,2M, citric acid 0,1M, KCl 0,2M, NaOH 0,1N.
Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa: DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl- hydrazyl-hydrate), methanol.
III.Phương pháp nghiên cứu 3.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Mẫu quả tươi được lấy một phần để xác định độ ẩm, phần còn lại sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tương ứng với các nhân tố.
Mẫu tươi được xử lý qua các thí nghiệm tách chiết và kiểm định các chỉ số hàm lượng, hóa tính và sự thay đổi màu sắc cùng với việc ứng dụng trong an toàn thực phẩm.
3.2. Phương pháp ly trích anthocyanin từ quả mồng tơi
Dựa vào tính chất phân cực của anthocyanin, dung môi được chọn để tách chiết anthocyanin sẽ là các dung môi phân cực dạng protic và aprotic. Quá trình tách chiết xảy ra thông qua việc hình thành liên kết hyrdro giữa anthocyanin và các phân tử dung môi trong điều kiện nhiệt độ khác nhau. Polyphenol phân cực tan trong dung môi sẽ được lọc bằng hệ thống lọc chân không, các chất không phân cực sẽ được giữ lại cùng với phần chất rắn phía trên phễu lọc.
3.3. Phương pháp xác định ẩm độ
3.3.1. Chuẩn bị bình hút ẩm và cốc đựng mẫu
Mở nắp bình hút ẩm, đổ hết hạt hút ẩm cũ ra khay và vệ sinh bình hút ẩm bằng khăn sạch, lau sạch miệng bình và thành bình sau đó dùng vaseline thoa đều trên thành bình và đóng nắp bình hút ẩm lại.
Hạt hút ẩm đặt trong khay nhôm và sấy trong tủ sấy khô ở nhiệt độ 70oC trong 12 giờ cho đến khi hạt hút ẩm chuyển thành màu xanh dương đậm. Chuyển nhanh hạt hút ẩm từ khay vào bình hút ẩm và đậy nắp lại.
Cốc đựng mẫu được sấy ở 70oC cho đến khối lượng không đổi trong 24 giờ. 3.3.2. Xác định độ ẩm
Cân 1g mẫu tươi trong cốc đựng mẫu đã xác định khối lượng không đổi rồi đem sấy ở nhiệt độ 70oC trong 48 giờ đến khối lượng không đổi
Nhanh chóng dùng kẹp lấy cốc đựng mẫu ra khỏi tủ sấy và đặt vào bình hút ẩm có hạt hút ẩm đã chuẩn bị trước đó.
Đem cốc đựng mẫu cân để xác định khối lượng của mẫu. Độ ẩm được tính bằng công thức:
M1: Khối lượng mẫu ban đầu
M2: Khối lượng mẫu sau khi sấy (Khối lượng cốc và mẫu – Khối lượng cốc)
3.4. Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin
Các dung dịch tách chiết sẽ được xác định hàm lượng bằng phương pháp pH Vi Sai. (Huỳnh Thị Kim Cúc et al., 2011)
Dựa trên nguyên tắc: chất màu anthocyanin mồng tơi có tính chất thay đổi theo pH đặc biệt hơn các loại anthocyanin khác trong tự nhiên. Tại pH = 4,5 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 12 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu.
Đo mật độ quang của mẫu tại pH=4,5 và pH=12 tại bước sóng hấp thụ cực đại, so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm. Pha loãng 1ml dịch chiết vào 24ml dung dịch pH buffer trong bình định mức 25ml.
Dựa trên công thức của định luật Lambert-Beer:
C l I Io . . lg (1)
Trong đó: : Đặc trưng cho mức độ ánh sáng yếu dần khi đi qua dung dịch hay còn gọi là mật độ quang, ký hiệu là A
I: Cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch; Io: Cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch; C: Nồng độ chất nghiên cứu, mol/l;
l: Chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua; ԑ: Hệ số hấp thụ phân tử, mol-1 cm-1
Xác định lượng anthocyanin theo công thức
L g l K M A a ; / . . . . (2)
Trong đó: A = (Amax.pH4,5 – A700nm.pH4.5) - (Amax.pH12 – A700nm.pH12)
Với Amax , A700nm: Độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và 700nm, ở pH = 4,5 và pH = 12
ɛ = 26900 L/mol
Từ đó tính được hàm lượng anthocyanin theo phần trăm: % Anthocyanin toàn phần = 100 ).100% . w m V a (3) V: Thể tích dịch chiết, ml. m:khối lượng mẫu
w: độ ẩm của mẫu
3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn và tính chỉ số IC50 DPPH
Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng công thức:
AA% = 100% Abscontrol Abssample - Abscontrol (4)
AA%: hoạt tính chống oxy hóa
Abssample : Độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517nm của mẫu
Abscontrol: Độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517nm của mẫu đối chứng
Các chỉ sồ AA% được thống kê bằng phương pháp oneway anova, sau đó dựng đường chuẩn và tính chỉ số IC50 khi AA% = 50% (y=50) như kết quả sau cùng.
3.6. Phương pháp chuẩn bị dung dịch nhận diện hàn the
Dịch trích từ quả mồng tơi được ly tâm 13000 vòng/phút, sau đó pha loãng ở các nồng độ 20% và 10% với dung dịch đệm pH thích hợp trong bình định mức 25ml và trữ trong các tube 2.2ml trong điều kiện lạnh, không có ánh sáng.
3.7. Thu thập và xử lý số liệu
Các số liệu sẽ được xử lý bằng phần mềm Microsoft Word, Excel. Thống kê số liệu bằng phần mềm thống kê SPSS 20.
IV. Bố trí thí nghiệm
5.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi màu sắc theo các giá trị pH khác nhau
Mục đích: Dịch chiết trực tiếp từ quả mồng tơi sau khi ly tâm 13000 vòng/phút sẽ được sử dụng để khảo sát sự thay đổi màu sắc của Anthocyanin trong các khoảng pH khác nhau, từ đó dự đoán thành phần chính trong Anthocyanin mồng tơi để giải thích kết quả thí nghiệm tách chiết anthocyanin.
Đối tượng: Dịch chiết athocyanin từ quả mồng tơi
Phương pháp thực hiện: Mỗi ống nghiệm sạch được cho vào 1ml dịch chiết và tiến hành điều chỉnh pH trong mỗi ống bằng các dung dịch HCL 1N và NaOH 1N. Các chỉ số pH của dung dịch hiển thị trên pH kế sẽ được điều chỉnh thông qua việc thêm
vào HCl hoặc NaOH. Thí nghiệm sẽ được quan sát và ghi nhận thông qua sự thay đổi màu sắc của 14 ống nghiệm lần lượt trong khoảng pH từ 1 đến 14.
5.2.Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thụ cao nhất
Mục đích: Xác định bước sóng hấp thụ cao nhất để tính hàm lượng anthocyanin Phương pháp thực hiện: lấy 1 ml dịch chiết pha loãng với 24 ml dung dịch đệm pH = 1 trong bình định mức 25 ml. Tiến hành đo mẫu với bước sóng từ 450 đến 650 nm để xác định bước sóng hấp thụ quang phổ cao nhất.
5.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và nhiệt độ đến quá trình tách chiết anthocyanin
5.3.1. Xác định độ ẩm mẫu
Mục đích: xác định độ ẩm của quả mồng tơi tươi để tính hàm lượng anthocyanin toàn phần trong công thức (3).
Đối tượng nghiên cứu: quả mồng tơi.
Phương pháp thực hiện: Sấy mẫu ở nhiệt độ 70oC trong 48 giờ trong cốc sứ, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
5.3.2. Ảnh hưởng của dung môi và nhiệt độ đến quá trình tách chiết Anthocyanin
Mục đích:Thí nghiệm thực hiện nhằm kiểm chứng sự ảnh hưởng của các nhân tố dung môi, nhiệt độ đến hàm lượng Anthocyanin thu được từ quả mồng tơi.
Đối tượng nghiên cứu: hàm lượng anthocyanin toàn phần
Nhân tố dung môi có 3 nghiệm thức gồm Ethanol : H2O (1:1) bổ sung 1% HCl, Acetone : H2O (1:1) bổ sung 0,01% HCl, và H2O bổ sung 0,1% HCl. Nhân tố nhiệt độ gồm 2 nghiệm thức 30oC và 35oC. Phản ứng xảy ra ở điều kiện không có ánh sáng trong 24h. Tổng cộng có 3x2 = 6 nghiệm thức lặp lại 3 lần. (Huỳnh Thị Kim Cúc et al., 2011)
Hình 5. Quy trình thực hiện quá trình tách chiết anthocyanin Nghiền Mẫu Nghiền Mẫu Ethanol : H2O (1:1) bổ sung HCl 1% Acetone : H2O (1:1) bổ sung HCl 0,01% Nước cất bổ sung 0,1% HCl 30oC 35oC E1 A1 H1 E2 A2 H2 Lọc Chân Không
Ủ trong tủ nhiệt độ không có ánh sáng
5.4.Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cuả anthocyainin mồng tơi
Mục đích thí nghiệm: khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của Anthocyanin tách chiết từ quả mồng tơi tím.
Đối tượng nghiên cứu: dịch chiết từ quả cây mồng tơi tím Basella ruba.
Dịch chiết từ quả cây mồng tơi tím sau khi ly tâm 13000 vòng/phút và bảo quản trong điều kiện không có ánh sáng sẽ được khảo sát tính chống oxy hóa thông qua sự đổi màu khả kiến và sự thay đổi trong hấp thụ quang phổ trong phản ứng với DPPH (Brand-Williams et al., 1995; Huang et al., 2005).
Phương pháp thực hiện: lặp lại 3 lần với mỗi loại mẫu
Phản ứng bao gồm 1 ml mẫu, 1 ml DPPH trong Methanol và được ủ 60 phút trong điều kiện không có ánh sáng. Sau khi ủ trong tối, sự thay đổi màu sắc từ tím đậm sang vàng nhạt sẽ được xác định bằng phương pháp đo quang phổ ở 517 nm (Mensor et al., 2001).
Pha loãng dịch trích với nước cất với các nồng độ lần lượt 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 theo tỉ lệ phần trăm.
Mẫu đối chứng bao gồm 1 ml Methanol và 1 ml DPPH.
5.5. Thí nghiệm 5: khảo sát khả năng nhận biết hàn the
Mục đích thí nghiệm: thông qua khảo sát sự thay đổi màu sắc đặc trưng khi cho anthocyanin phản ứng với Natri tetra borate với nồng độ khác nhau sẽ hướng đến phương pháp nhận biết hàn the trong thực phẩm. (nồng độ, pH thích hợp nhận biết hàn the)
Đối tượng nghiên cứu: dịch chiết Anthocyanin
5.3.1. Thí nghiệm nhận biết hàn the
Để phù hợp với điều kiện thực tế về hàm lượng hàn the thường có trong thực phẩm, trong thí nghiệm này, nồng độ dung dịch Sodium tetra borate sẽ có 4 nồng độ lần lượt 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%; dịch chiết có sẽ phản ứng với 4 nồng độ 20%, 10%, 5%. Mỗi nghiệm thức sẽ có 8 thí nghiệm với pH lần lượt từ 1 đến 8.
5.3.2. Sản xuất thử dung dịch anthocyanin nhận diện hàn the
Mục đích: sản xuất dung dịch có khả năng nhận diện nhanh sự có mặt của hàn the.
Đối tượng: dung dịch anthocyanin và dung dịch di sodium tetra borate
Từ sự thay đổi màu sắc đặc trưng khi cho Anthocyanin mồng tơi phản ứng với di sodium tetra borate (Hàn The), tại pH có sự thay đổi màu đặc trưng và dễ nhận biết sẽ được dùng để pha loãng dịch chiết ở các nồng độ 20%, 10%, 5%. Sau cùng, bộ kit dung dịch này sẽ được dùng để nhận biết Hàn The ở 5 nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05%, 0,005%.
Phân bố thí nghiệm:
‒ Dịch chiết có pH thích hợp với nồng độ 20% phản ứng với Hàn The với nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%.
‒ Dịch chiết có pH thích hợp với nồng độ 10% phản ứng với Hàn The với nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%.
5.3.3. Sản xuất thử giấy tẩm anthocyanin dùng nhận diện hàn the
Mục đích: sản xuất giấy tẩm anthocyanin có khả năng nhận diện sự có mặt của hàn the
Đối tượng: sodium tetra borate
Giấy lọc được cắt ra với kích thước 0.5x5 cm và ngâm trong dịch chiết từ quả mồng tơi với các nồng độ 20%, 30%, 40%, 50%, 60% trong 24h. Giấy đã thấm dung dịch sẽ đường vớt ra, làm khô ở nhiệt độ phòng và được dùng để thử dung dịch hàn the ở các nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%.
Bố trí thí nghiệm:
‒ Giấy thử ngâm trong dung dịch đậm đặc với hàn the ở các nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%.
‒ Giấy thử ngâm trong dung dịch 20% với hàn the ở các nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%.
‒ Giấy thử ngâm trong dung dịch 30% với hàn the ở các nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%.
‒ Giấy thử ngâm trong dung dịch 40% với hàn the ở các nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%.
‒ Giấy thử ngâm trong dung dịch 50% với hàn the ở các nồng độ 2%, 1%, 0,1%, 0,05% và 0,005%.
‒ Giấy thử ngâm trong dung dịch 60% với hàn the ở các nồng độ 2%, 1%, 0,1%,