Tối ưu hóa điều kiện chiết tách và khảo sát khả năng kháng oxi hóa của chất màu anthocyanin từ củ khoai lang tím

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CÙ THỊ NGỌC THÚY TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXI HÓA CỦA CHẤT MÀU ANTHOCYANIN TỪ CỦ KHOAI LANG TÍM Chuyên ngành : Hóa hữu Mã số : 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Huỳnh Thị Kim Cúc Đà Nẵng – Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người cam đoan Cù Thị Ngọc Thúy MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Bố cục luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ KHOAI LANG 1.1.1 Mô tả thực vật 1.1.2 Phân loại khoa học 1.1.3 Nguồn gốc phân bố 1.1.4 Công dụng khoai lang 1.2 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT MÀU ANTHOCYANIN 12 1.2.1 Nguyên tắc chiết tách anthocyanin từ thực vật 12 1.2.2 Cấu trúc anthocyanin 15 1.2.3 Đặc tính quang phổ anthocyanin 19 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu anthocyanin 20 1.2.5 Hoạt tính kháng oxi hóa anthocyanin 25 1.2.6 Công dụng anthocyanin 26 1.2.7 Anthocyanin KLT 28 1.2.8 Tình hình nghiên cứu anthocyanin từ KLT liên quan đến đề tài 30 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 NGUYÊN LIỆU 38 2.2 HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 38 2.2.1 Hóa chất 38 2.2.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 38 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.3.1 Chọn mẫu xử lý mẫu 40 2.3.2 Phương pháp xác định độ ẩm 40 2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng kim loại 41 2.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin 41 2.3.5 Phương pháp định danh anthocyanin 43 2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 45 2.3.7 Phương pháp toán học 47 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA KLT 50 3.1.1 Kết xác định độ ẩm 50 3.1.2 Kết xác định hàm lượng kim loại 50 3.1.3 Kết xác định bước sóng hấp thụ cực đại anthocyanin chiết từ củ KLT 51 3.2 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH ANTHOCYANIN TỪ CỦ KLT TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM 52 3.2.1 Ảnh hưởng phương pháp xử lý KLT trước chiết tách anthocyanin 53 3.2.2 Ảnh hưởng loại dung môi đến trình chiết tách anthocyanin từ KLT 56 3.2.3 Ảnh hưởng loại acid hàm lượng acid đến trình chiết tách anthocyanin từ KLT 57 3.2.4 Ảnh hưởng tỷ lệ hệ dung mơi đến q trình chiết tách anthocyanin từ KLT 60 3.2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết tách anthocyanin từ KLT 61 3.2.6 Ảnh hưởng thời gian đến trình chiết tách anthocyanin từ KLT 63 3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến trình chiết tách anthocyanin từ KLT 64 3.3 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CHIẾT TÁCH CHẤT MÀU ANTHOCYANIN TỪ CỦ KLT 65 3.3.1 Chọn yếu tố ảnh hưởng hàm mục tiêu 66 3.3.2 Tổ chức thí nghiệm 66 3.3.3 Xây dựng mơ tả tốn học cho hàm mục tiêu hàm lượng anthocyanin (y) 67 3.4 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH CHẤT MÀU ANTHOCYANIN TỪ CỦ KLT 70 3.5 PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CHẤT MÀU ANTHOCYANIN CHIẾT TỪ CỦ KLT 72 3.5.1 Nghiên cứu làm làm giàu hợp chất anthocyanin từ dịch chiết chất màu anthocyanin 72 3.5.2 Kết xác định thành phần chất màu anthocyanin chiết từ củ KLT 74 3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA CỦA DỊCH CHIẾT ANTHOCYANIN TỪ CỦ KLT 84 3.6.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 85 3.6.2 Kết xác định hoạt tính kháng oxy hóa dịch chiết anthocyanin 87 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO) PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABS Độ hấp thụ ABTS 2,2’-azinobis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) DPPH 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl Ha Hecta HPLC-DAD High-performance liquid chromatography with diode-array detection KLT Khoai lang tím KPH Khơng phát MS Mass spectrometry NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy ORAC Oxygen radical absorbance capacity TE Trolox equivalent lmax Bước sóng hấp thụ cực đại, nm DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu 1.1 Tên bảng Sản lượng khoai lang số nước giới Trang năm 2011 1.2 Cấu trúc số anthocyanidin 17 1.3 Màu chất tương ứng với bước sóng hấp thụ 20 1.4 Phổ khối lượng anthocynin khoai lang tím 28 (Montilla, Hillebrand et al 2011) 3.1 Kết xác định độ ẩm khoai lang tím 50 3.2 Hàm lượng số kim loại khoai lang tím(*) 51 3.3 Ảnh hưởng loại acid hàm lượng acid đến hàm 59 lượng màu anthocyanin 3.4 Điều kiện thí nghiệm yếu tố ảnh hưởng lựa 66 chọn để thực phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp I 3.5 Ma trận kết thực nghiệm trực giao cấp I, k = 67 3.6 Kết khảo sát nồng độ mẫu phân tích 87 3.7 Nồng độ ức chế nửa (IC50) mẫu A, B, C 91 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình Trang 1.1 Hình ảnh củ khoai lang tím giống Nhật 1.2 Cấu trúc flavonoid 14 1.3 Cấu trúc gốc aglycon anthocyanin 16 1.4 Các anthocyanindin phổ biến rau 18 1.5 Một số anthocyanin dạng 3-glucoside 19 1.6 Ảnh hưởng pH đến cấu trúc anthocyanin 22 1.7 Cấu trúc anthocyanin dạng phức 23 1.8 Sơ đồ phân giải anthocyanin pH cao 23 1.9 Cấu trúc khung cyanidin (R1 = H) hay peonidin (R1 29 = CH3) 3-sophoroside-5-glucoside (a); b: caffeic acid (caff); c: ferulic acid (fer); d: p-hydrobenzoic acid (phb) 2.1 Máy quang phổ kế UV – Vis Cary 60 39 2.2 Máy cô quay chân không BUCHI 39 2.3 Phản ứng DPPH chất chống oxi hóa 46 3.1 Bước sóng hấp thụ cực đại dịch chiết anthocyanin từ 52 KLT 3.2 Sơ đồ nghiên cứu quy trình chiết tách anthocyanin từ 53 KLT 3.3 Ảnh hưởng phương pháp chiết đến hàm lượng 54 anthocyanin KLT 3.4 Ảnh hưởng loại dung môi đến hàm lượng 57 anthocyanin KLT 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi ethanol/nước đến hàm lượng anthocyanin 61 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết tách đến hàm lượng 62 anthocyanin 3.7 Ảnh hưởng thời gian chiết tách đến hàm lượng 63 anthocyanin 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm 64 lượng anthocyanin 3.9 Ảnh hưởng thời gian chiết tách tỷ lệ ethanol 69 hệ dung môi đến hàm lượng anthocyanin 3.10 Ảnh hưởng tỷ lệ ethanol nhiệt độ chiết tách đến 69 hàm lượng anthocyanin 3.11 Quy trình chiết tách anthocyanin phịng thí nghiệm 71 3.12 Sơ đồ làm chất màu anthocyanin 73 3.13 Mẫu anthocyanin thô sau làm 74 3.14 Sắc ký đồ HPLC - DAD dịch chiết anthocyanin từ 76 KLT 3.15 Phổ khối lượng MS dịch chiết anthocyanin từ KLT 77 có m/z = 787,3 3.16 Sơ đồ phân mảnh ion phân tử [MH]+ có m/z = 787,2 78 3.17 Phổ khối lượng MS dịch chiết anthocyanin từ KLT 79 có m/z = 1111,2 3.18 Sơ đồ phân mảnh ion phân tử [MH]+ có m/z = 80 1111,2 3.19 Phổ khối lượng MS dịch chiết anthocyanin từ KLT 82 có m/z = 1125,3 3.20 Sơ đồ phân mảnh ion phân tử [MH]+ có m/z = 1125,3 83 3.21 Mẫu thơ A0 pha lỗng thành A1, A2, A3, A4, A5, 86 A6 3.22 Mẫu tinh B0 pha loãng thành B1, B2, B3, B4, B5, 86 B6 3.23 Khả bắt gốc tự DPPH mẫu thô (A) theo 88 nồng độ 3.24 Đồ thị thể khả bắt gốc tự DPPH 88 mẫu A, B, C theo nồng độ 3.25 Đồ thị thể khả bắt gốc tự DPPH mẫu 89 thô (A) theo log nồng độ 3.26 Đồ thị thể khả bắt gốc tự DPPH mẫu 90 tinh (B) theo log nồng độ 3.27 Đồ thị thể khả bắt gốc tự DPPH mẫu vitamin C (C) theo log nồng độ 90 Print of window 38: Current Chromatogram(s) Current Chromatogram(s) ES-API, Pos, Scan, F 11.720 Full MS Ar 5 :1 a e G 79 :2 a e Ar 13.134 160000 12.130 C 9.776 A Ar 95 :1 a e 63 18 11 a: I Ar 00 : ea 52 6 :1719 82 a e 34 Aar: a: e re Ar A J Ar 78 :6 a e E 73 46 24 :2 58 a e : Ar ea Ar 13.674 D 120000 e Ar H 180000 140000 71 06 +0 e 15.805 16.079 16.396 B 10.613 200000 33 :0 ea0 A1er + 28 F 15.320 06 +0 e 14.610 Norm 220000 K 16.866 MSD1 TIC, MS File (D:\LC-DAD-MS\DATA\DAD-MS\ANTHOXYANIN\200914D\MAU KLT 2014-09-20 16-14-56.D) 04 00 100000 80000 60000 40000 2.5 Instrument 9/21/2014 4:29:35 PM SYSTEM 7.5 10 12.5 15 17.5 20 Page of Phụ lục Kết phân tích hoạt tính kháng oxi hóa từ củ KLT Bảng 7.1 Kết phần trăm khử gốc tự DPPH mẫu thô (A) Vmethanol VDPPH Vmẫu (ml) (ml) (ml) M0 1ml 4ml 0,7606 M0 1ml 4ml 0,7624 M1A0 4ml 1ml 0,0678 M1A0 4ml 1ml 0,0686 M2A0 4ml 1ml 0,0134 M2A0 4ml 1ml 0,0135 M1A1 4ml 1ml 0,1518 M1A1 4ml 1ml 0,1515 M2A1 4ml 1ml 0,0114 10 M2A1 4ml 1ml 0,0130 11 M1A2 4ml 1ml 0,3561 12 M1A2 4ml 1ml 0,3588 13 M2A2 4ml 1ml 0,0069 14 M2A2 4ml 1ml 0,0079 15 M1A3 4ml 1ml 0,5212 16 M1A3 4ml 1ml 0,5298 17 M2A3 4ml 1ml 0,0055 18 M2A3 4ml 1ml 0,0059 19 M1A4 4ml 1ml 0,6372 20 M1A4 4ml 1ml 0,6385 21 M2A4 4ml 1ml 0,0069 22 M2A4 4ml 1ml 0,0070 STT Mẫu A515 Trung bình % khử 0,7615 0,0682 92,810 0,0135 0,1517 81,687 0,0122 0,3575 54,032 0,0074 0,5255 31,740 0,0057 0,6379 17,150 0,0070 23 M1A5 4ml 1ml 0,6972 24 M1A5 4ml 1ml 0,7016 25 M2A5 4ml 1ml 0,0055 26 M2A5 4ml 1ml 0,0053 27 M1A6 4ml 1ml 0,7434 28 M1A6 4ml 1ml 0,7371 29 M2A6 4ml 1ml 0,0056 30 M2A6 4ml 1ml 0,0053 0,6994 8,864 0,0054 0,7403 3,506 0,0055 Bảng 7.2 Kết phần trăm khử gốc tự DPPH mẫu tinh (B) STT Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M0 M0 M1A0 M1A0 M2A0 M2A0 M1A1 M1A1 M2A1 M2A1 M1A2 M1A2 M2A2 M2A2 M1A3 M1A3 M2A3 M2A3 M1A4 M1A4 M2A4 M2A4 M1A5 M1A5 M2A5 M2A5 M1A6 M1A6 M2A6 M2A6 Vmethanol (ml) 1ml 1ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml VDPPH (ml) 4ml 4ml 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 Vmẫu (ml) 0 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml A515 0,7966 0,7987 0,0852 0,0824 0,0252 0,0230 0,2147 0,2178 0,0092 0,0093 0,4060 0,3964 0,0079 0,0073 0,5616 0,5732 0,0063 0,0060 0,7253 0,7189 0,0074 0,0066 0,7660 0,7701 0,0078 0,0059 0,7943 0,7958 0,0056 0,0053 Trung bình % khử 0,7977 0,0838 92,516 0,0241 0,2163 74,049 0,0093 0,4012 50,655 0,0076 0,5674 29,637 0,0062 0,7221 10,349 0,0070 0,7681 4,570 0,0069 0,7951 1,009 0,0055 Bảng 7.3 Kết phần trăm khử gốc tự DPPH mẫu vitamin C (C) STT Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M0 M0 M1A0 M1A0 M2A0 M2A0 M1A1 M1A1 M2A1 M2A1 M1A2 M1A2 M2A2 M2A2 M1A3 M1A3 M2A3 M2A3 M1A4 M1A4 M2A4 M2A4 M1A5 M1A5 M2A5 M2A5 M1A6 M1A6 M2A6 M2A6 Vmethanol (ml) 1ml 1ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml VDPPH (ml) 4ml 4ml 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 4ml 4ml 0 Vmẫu (ml) 0 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml A515 0,809 0,809 0,068 0,066 0,004 0,001 0,199 0,198 0,002 0,002 0,361 0,356 0,004 0,002 0,537 0,539 0,003 0,002 0,655 0,665 0,003 0,002 0,739 0,739 0,004 0,002 0,782 0,789 0,004 0,005 Trung bình % khử 0,809 0,067 92,027 0,003 0,199 75,711 0,002 0,359 56,057 0,003 0,538 33,807 0,003 0,660 18,727 0,003 0,739 9,023 0,003 0,786 3,461 0,005 Bảng 7.4 Khả bắt gốc tự DPPH theo nồng độ Mẫu A0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 Nồng độ (μg/ml) 22,205 11,103 5,551 2,776 1,388 0,694 0,347 21,450 10,725 5,362 2,681 1,341 0,670 0,335 24,553 12,276 6,138 3,069 1,535 0,767 0,387 Log nồng độ (μg/ml) 1,346 1,045 0,744 0,443 0,142 -0,159 -0,460 1,331 1,030 0,729 0,428 0,127 -0,174 -0,475 1,390 1,089 0,788 0,487 0,186 -0,115 -0,413 % khử 92,810 81,687 54,032 31,740 17,150 8,864 3,506 92,520 74,049 50,655 29,637 10,350 4,570 1,010 92,027 75,711 56,057 33,807 18,727 9,023 3,461 ... hóa điều kiện chiết tách chất màu anthocyanin từ củ khoai lang tím - Xây dựng quy trình cơng nghệ chiết tách chất màu anthocyanin từ củ khoai lang tím - Xác định số tiêu chất màu anthocyanin Đối... kháng oxi hóa chất màu anthocyanin từ củ khoai lang tím? ?? nhằm mục tiêu hướng vào việc sử dụng nguồn nguyên liệu củ khoai lang tím để thu nhận anthocyanin Mục tiêu nghiên cứu - Tối ưu hóa điều kiện. .. - Củ khoai lang tím thu hoạch huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long Phạm vi nghiên cứu - Chiết tách chất màu anthocyanin từ củ khoai lang tím quy mơ phịng thí nghiệm - Tối ưu hóa điều kiện chiết tách