TỐI ưu hóa điều KIỆN TÁCH CHIẾT POLYPHENOL từ lá đào TIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP RSM và KHẢO sát KHẢ NĂNG KHÁNG OXY hóa từ lá và QUẢ đào TIÊN (crescentia cujute)

Từ đó, các hợp chất tự nhiên có trong thảo dược như flavonoid, vitamin A, vitamin E, anthocyanin,… được chú ý đến và sử dụng vì có thể bảo vệ cơ thể bằng khả năng trung hòa các gốc tự do

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ LÁ ĐÀO TIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP RSM VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA

TỪ LÁ VÀ QUẢ ĐÀO TIÊN (Crescentia

TÓM TẮT

Đề tài:”Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ lá đào tiên bằng phương pháp RSM và khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ lá và quả đào tiên

(crescentia cujute L.)”.

Giảng viên hướng dẫn: Th.S Đoàn Thiên Thanh

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Hóa Nông – Viện Công Nghệ Hóa Học Thành phố Hồ Chí Minh

Đề tài này thực hiện nhằm khảo sát điều kiện thích hợp nhất để tách chiết polyphenol từ lá và quả đào tiên Từ đó, tối ưu hóa quy trình tách chiết polyphenol

từ mẫu có hàm lượng polyphenol cao hơn để thu nhận hàm lượng polyphenol cao nhất và đánh giá sự tương tác qua lại giữa các yếu tố khảo sát ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol Bên cạnh đó, còn khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ cao chiết

lá và quả đào tiên Kết quả của đề tài nghiên cứu như sau:

Điều kiện thích hợp nhất để thu hàm lượng polyphenol từ lá đào tiên là: dungmôi methanol 60% với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:20 trong thời gian 24 giở

ở nhiệt độ phòng Và sau khi thực hiện phương pháp RSM, thì giá trị tối ưu để thu được hàm lượng polyphenol từ lá đào tiên là dung môi methanol 59,3% với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:23,3 trong thời gian 30,73 giở ở nhiệt độ phòng Điều kiện thích hợp nhất để thu hàm lượng polyphenol từ quả đào tiên là: dung môi methanol 70% với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:15 trong thời gian 24 giở ở nhiệt độ phòng

Cao chiết từ lá đào tiên thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao với giá IC50 của khả năng bắt gốc tự do DPPH là 39,79 (mg/mL) Cao chiết từ lá đào tiên thể hiện hoạt tính chống oxy hóa với giá IC50 của khả năng bắt gốc tự do DPPH

là 77,22 (mg/mL)

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ từ thiên nhiên để chữa bệnh và làmnguồn dược liệu quí báu trong dân gian Nước ta có diện tích tương đối không rộng lớn nhưng có đường bờ biển dài và khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa hằng nămkhá cao Những điều kiện thuận lợi như vậy đã góp phần tạo nên một hệ sinh thái thực vật đa dạng và phong phú Theo thống kê gần đây, ước tính đất nước Việt Nam

có khoảng 10.000 loài, và có khoảng hơn 3.000 loài thực vật được sử dụng để làm dược liệu trong dân gian Vậy nên còn rất nhiều loài cây chưa được khai thác và đàosâu vào công dụng của nó hoặc tìm hiểu được công dụng nhưng rất ít phổ biến rộng rãi

Ngày nay, khi con người luôn luôn dành sự quan tâm đặc biệt cho các vấn đề liên quan đến sức khỏe và sắc đẹp thì các hợp chất thiên nhiên trong các loại cây cỏ thiên nhiên lại được chú ý đến rất nhiều Gốc tự do là một trong nguyên nhân gây ranguyên nhân lão hóa và rất nhiều bệnh tật bao gồm các bệnh lý về não, mắt, hệ miễn dịch,… Ở mức độ nặng, gốc tự do còn gây nên ung thư các cơ quan Từ đó, các hợp chất tự nhiên có trong thảo dược như flavonoid, vitamin A, vitamin E, anthocyanin,… được chú ý đến và sử dụng vì có thể bảo vệ cơ thể bằng khả năng trung hòa các gốc tự do của chúng

Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra được rất nhiều hợp chất tự nhiên có tác dụng nhất định đối với cơ thể trong các loài thảo dược, đưa các hợp chất này dưới dạng thực phẩm chức năng và đưa ra thị trường Các hợp chất tự nhiên có những ưuđiểm vượt trội hơn so với các hợp chất hóa học tổng hợp như hoạt tính kháng oxy hóa, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm,…

Cây đào tiên (crescentia cujute L.) được biết đến như là một loài thực vật

được sử dụng để lấy dược liệu chữa bệnh trong dân gian như ho, nhuận tràng, kích thích tiêu hóa,… rất hiệu quả Từ các bài báo cáo về nghiên cứu sơ bộ của đào tiên,

người ta tìm thấy trong thành phần hóa học của cây có chứa một lượng polyphenol Đây là một trong những hợp chất tự nhiên trong thực vật có hoạt tính kháng oxy hóa, có ý nghĩa đối với sức khỏe con người.

Quá trình trích ly được biết đến rộng rãi như là một quá trình tách chiết hợp

chất có hoạt tính sinh học từ nguyên liệu (Chew et al.,2011) Quy trình khảo sát các

yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly hợp chất tự nhiên nhằm tìm được các điều kiện thích hợp nhất cho hàm lượng hợp chất cao nhất thường được thực hiện theo phương pháp truyền thống Đó là, thay đổi theo các mức độ của một yếu tố và cố định thông số của các yếu tố còn lại Tuy nhiên, phương pháp truyền thống không thể hiện được sự tương quan qua lại giữa các yếu tố với nhau trong một quy trình

Để giải quyết vấn đề nêu trên thì phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Method) ra đời Đây là là phương pháp sử dụng toán học và xử lí thống kê cho phépnghiên cứu sự tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của quy trình, đồng thời đưa ra dự đoán về giá trị tối ưu của các yếu tố (Plackett & Burman, 1946)

Từ những điều trên, đề tài:”Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ

lá đào tiên bằng phương pháp RSM và khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ lá

và quả đào tiên (crescentia cujute L.)” được thực hiện.

1.3 Yêu cầu

Xác định các điều kiện cơ bản thích hợp nhất để tách chiết polyphenol từ lá và quả đào tiên Xác định được các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tách chiết được và thể hiện được sự tương tác giữa các yếu tố.Xác định khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ lá và quả đào tiên

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về cây đào tiên

(không phân hạng): Angiospermae

(không phân hạng): Eudicots

(không phân hạng): Asterids

Loài: Crescentia cujute L (Đỗ et al.,2004)

Tên gọi khác: Cây bòng, cây trường thọ

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Đào tiên là cây thuộc dạng thân gỗ trung bình, trong điều kiện tự nhiên có thể đạt chiều cao trên 6m, tán lá rộng, xanh tươi quanh năm Cây ra hoa và quả quanh năm, sinh trưởng với tốc độ trung bình, sống được ở các điều kiện thời tiết

khác nhau Cây ưa sáng, nhu cầu nước trung bình, nhân giống từ hạt (Phạm et al.,1999)

Lá xanh đậm, nhẵn, dày cứng, dạng thuôn dài mọc thành vòng, lá hình muỗng, thon hẹp dài ở gốc, chóp thon, dài 10-15cm, rộng 3-4 cm, mọc khít nhau thành chùm 3 lá hay hơn, đuôi lá men cuống (Hình 2.2a)

Hoa thường mọc đơn độc ở đầu cành hay kẽ lá, to, buông rũ xuống, với cánh tràng màu vàng xanh, gốc màu đỏ tía, điểm các hạt nhỏ, hợp thành ống loe ở đỉnh trên chia thành 2 môi, có 4 nhị (Hình 2.2b)

Quả mọng hình cầu hoặc hình trứng đường kính 6-12 cm, giống dạng quả bưởi, vỏ quả cứng có màu xanh; trong quả có thịt (còn gọi là cơm hay nạc), màu trắng, vị chua, trong đó có nhiều hạt dẹt nhỏ, vỏ hạt dày và cứng Nhưng cơm quả một khi nạo ra, để ngoài trời rất nhanh chóng bị chuyển sang màu đen (Hình 2.2a)

Hình 2.2 Bộ phận của cây đào tiên

a) Quả và lá b) Hoa

(Nguồn: http://www.richardlyonsnursery.com/crescentia-cujete-calabash-tree2/

https://www.flickr.com/photos/mazuu/14201799773)

ba

2.1.3 Nguồn gốc, phân bố

Họ núc nác (Bignoniaceae) là một họ lớn với rất nhiều chi, chủ yếu là ở vùngnhiệt đới trừ một số chi ở vùng ôn đới Chi Crescentia là một chi của 7 loài ở vùng nhiệt đới châu Mỹ từ Mexico và Tây Ấn đến vùng Amazon của Brazil Cây đào tiên

(Crescentia cujute) là một loài cây được trồng rộng rãi trong suốt thời tiền sử và phạm vi ban đầu của nó vẫn chưa được khám phá ra (Phạm et al., 2006)

Ngày nay, đào tiên được trồng ở hầu khắp các nước nhiệt đới Cựu lục địa

Có hai loài được nhập vào Đông Nam Á là C alata và C cujete Ở Việt Nam, chi Crescentia chỉ có một đại diện là đào tiên (C cujete), và được trồng ở chủ yếu là

các tỉnh ở phía nam, từ Quảng Ngãi, Bình Định đến hầu hết các tỉnh ở đồng bằng sông Cửu Long

Cây đào tiên là cây ưa sáng, ưa khí hậu nóng ẩm của vùng nhiệt đới, cũng có thể sinh sống ở mọi điều kiện khác nhau kể cả điều kiện khắc nghiệt nhất, trồng được trên nhiều loại đất Tuy nhiên cũng cần phải chăm sóc cây đúng cách không nên để cây thiếu nước sẽ héo cho ra quả không mọng, đẹp Thời điểm thích hợp nhất để trồng cây non chính là mùa xuân, khi đất ẩm ướt và có mưa phùn Cây con

sẽ phát triển nhanh đặc biệt là không phải chăm quá nhiều

Muốn cho cây đào tiên được ra hoa và kết được nhiều quả, chúng ta cần có những kế hoạch cũng như cách chăm sóc vô cùng kỹ lưỡng Bởi lẽ cây đào tiên có quả mang lại giá trị vô cùng lớn Yêu cầu về đất trồng phải đảm bảo đủ dinh dưỡng

ở mức trung bình, thông thoáng và thoát nước tốt, có hàm lượng hữu cơ cao Trong quá trình trồng cây Đào tiên cần phải bón phân lân và phân đạm để kích thước tăng trưởng cho cây Mỗi năm nên bón khoảng 4 lần chia đều theo các tháng

Quá trình trồng cây đào tiên cần để ý tới các loại sâu bệnh như thối gốc, chảy

mủ…Những loại bệnh này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho loài nấm Phythopthora spp phát triển Cần phải tránh những loại bệnh này bằng cách phun thuốc Aliette

2,5%, Ridomil 2% để phòng bệnh Ngoài ra cây đào tiên cũng hay bị bệnh loét, sâu

bò vẽ, bọ xít xanh, sâu đục thân đục cành cần phòng trừ bệnh ngay từ đầu Để đảm

bảo không bị hưởng bởi thuốc bảo vệ thực vật có thể tự bắt sâu bằng móc sắt, hoặc phun những loại thuốc đặc trị theo hướng dẫn trên bao bì.

Cây đào tiên có thời gian trồng và thời gian thu hoạch khoảng từ 4-5 năm so với các giống cây ăn quả khác Quả đào tiên có hình cầu hoặc hình trứng, trông giống như quả bưởi, lớp vỏ màu xanh, lúc non mỏng, già vỏ cứng dần

2.1.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Vỏ rễ đào tiên chứa β – sitosterol, acid ursolic, acid vanillic và acid 4 – hydroxybenzoic Quả thu hái ở Việt Nam chứa 15 chất, trong đó có 3 iridoid

glucosid, 5 iridoid, 2 chất 3 – hydroxyoctanol glycoside, 3 chất 2,4 – pentanediol

glycoside và 2 chất 4 – hydroxyl – 2 pentanon (Đỗ et al.,2004)

Cao methanol vỏ rễ đào tiên có tác dụng ức chế các vi khuẩn gram dương Acid vanillic có nồng độ ức chế thấp nhất là 125 và 175 µg/ml đối với

Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis tương ứng; và acid 4 – hydroxybenzoic

có nồng độ ức chế thấp nhất là 250 µg/ml đối với cả hai chủng vi khuẩn (Đỗ et al.,2004)

2.1.5 Công dụng

Quả đào tiên có thể ăn được nhưng phần lớn loại quả này được dùng làm thuốc chữa bệnh Do thành phần quả đào tiên có nhiều dược tính có thể điều trị đươc khá nhiều loại bệnh có thể kể đến như nhuận trường, tẩy xổ và trị tình trạng

mất ngủ khá hiệu quả (Đỗ et al.,2004).

Theo một số tài liệu cũng có nói rằng quả đào tiên có tác dụng tăng cường tuổi thọ, trị được suy nhược cơ thể, dưỡng sinh lực và điều hòa được kinh lạc Ngoài ra, đào tiên còn làm siro trị viêm họng, ho, viêm họng mạn Nhân hạt đào vị đắng ngọt, tính bình, có công hiệu phá huyết tan ứ, có tác dụng hoạt huyết hành huyết, làm tan huyết tự ứ, làm tan đờm, nhuận tràng, điều hòa chức năng cơ quan hôhấp, giảm ho

Trong điều trị lâm sàng, đào nhân còn thường dùng chữa trị bế kinh, đau bụng kinh, cao huyết áp, viêm ruột thừa, tụ huyết sưng đau do chấn thương Đối vớichứng liệt nửa người do tắc nghẽn mạch máu, đào nhân cũng có tác dụng điều trị nhất định Còn phần rễ đào dùng ngoài da có tác dụng chữa sưng đau, sắc uống có thể chữa bệnh viêm gan vàng da Nếu thường xuyên ăn trái đào tiên này nó còn giúpbạn tăng cường tuổi thọ, trị được những suy nhược cơ thể hàng ngày, giúp điều hòa kinh lạc…Nếu lấy trái đào tiên còn chưa chín hết sẽ có công dụng đặc biệt giúp nhuận tràng, chống táo bón

Ở một số nước khác, phần cơm của quả đào tiên được người ta nấu chín với đường tạo thành một chất siro chữa ho hiệu quả Phần vỏ đào tiên còn được các nghệ nhân sử dụng để tạp hình, khắc chữ, khắc hình họa lên vỏ làm đồ thủ công mỹ nghệ rất đẹp và đem lại giá trị kinh tế cao Còn với người Việt ta, theo như kinh nghiệm dân gian cha ông ta để lại, cây đào tiên có tính thảo dược, người ta dùng quả

để chữa nhiều bệnh như nhuận trường, tẩy xổ, làm mứt dẻo, chữa các chứng mất ngủ, ăn không ngon…

 Một số bài thuốc kết hợp từ quả đào tiên:

Lấy quả chín xào với rượu đế trắng, còn nóng để vào vải mỏng, đắp lên chỗ đau,

bó lại hoặc bóp tay chân, có thể trị đau nhức khớp Nếu dùng quả chín phơi thả sương 1 đêm, sau đó phơi 2 nắng, ngâm rượu đế thơm ngọt và uống, sẽ có tác dụng trị nhức mỏi

Cơm quả đào tiên phơi khô cho héo, đem sắc nước uống sẽ giúp ăn được, ngủ được; làm êm dịu những trường hợp bị căng thẳng thần kinh, tim hồi hộp; giúp người gầy yếu, suy dinh dưỡng cảm thấy khỏe hơn; giúp bổ phổi, chữa ho và làm dễthở trong những trường hợp bị suyễn

Bên cạnh đó, lấy cơm trái đào tiên cho vào rượu gạo với tỉ lệ 1:5 rồi ngâm từ 7-

10 ngày, sau khi ngâm mỗi ngày bạn uống từ 2-3 lần, mỗi lần 30ml trước khi ăn đảm bảo bạn sẽ ăn ngon miệng hơn rất nhiều đặc biệt nó rất tốt cho tiêu hóa nữa

Nhuận trường, tẩy xổ, bằng cách dùng ruột quả đào tiên làm mứt dẻo, ngày dùng

3 lần, mỗi lần khoảng 10g sau bữa ăn

Làm thuốc trị tình trạng ăn uống kém, mất ngủ và dùng làm thuốc bổ bằng cách sau khi hái quả đào tiên xuống, để từ lúc có vỏ màu xanh chuyển sang màu đen, đậplấy phần thịt bên trong (cũng màu đen) để ngâm rượu Cứ ngâm 200g thịt quả đào tiên kèm 10 quả chuối sứ khô nướng vàng và đem ngâm với 2 lít rượu ngon, ngâm

10 ngày là có thể lấy ra dùng được Ngày dùng 3 lần, mỗi lần một ly nhỏ Nên dùng trước bữa ăn

Giúp hỗ trợ trị ung thư gan, bổ thận bằng quả đào tiên già chín cây cắt làm đôi,

lấy ruột đen đem xào với khoảng 100g đường phèn Nên nhớ: không đổ nước lã

vào, để lửa nhỏ, xào liên tục trong khoảng 40 phút (giống như nấu chè đặc) Bên cạnh đó, bài thuốc này có thể giúp dễ đi tiêu và tăng cường khả năng chịu đựng của con người với khí hậu nóng, lạnh bên ngoài, làm hạ huyết áp, êm dịu thần kinh

Ở một số địa phương khác, quả đào tiên thường được dùng để ngâm rượu giúp bồi bổ sức khỏe, trị ăn kém, mất ngủ Bằng cách hái quả đào tiên để từ quả có vỏ màu xanh chuyển sang màu đen, đập lấy phần thịt bên trong (cũng màu đen) để ngâm rượu Cứ ngâm 200 gram thịt đào tiên thì kèm 10 trái chuối sứ khô nướng vàng và đem ngâm với hai lít rượu ngon, ngâm 10 ngày là có thể lấy ra dùng được Ngày dùng 3 lần, mỗi lần một ly nhỏ (30 ml), dùng trước bữa ăn

2.1.6 Một số nghiên cứu về cây đào tiên

2.1.6.1 Một số nghiên cứu trong nước

Mặc dù có rất nhiều ứng dụng trong y học dân gian nhưng những nghiên cứukhoa học về cây đào tiên trong nước vẫn còn rất hạn chế, hầu như không có

Nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của vỏ cây đào tiên ở Phòng thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên và Hóa dược, Khoa Hóa, Trường Đại

học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG Tp Hồ Chí Minh được thực hiện bởi Phạm Đức Nhuận, Nguyễn Thị Thảo Ly, Nguyễn Diệu Liên Hoa vào năm 2015 Kết quả cho thấy sự hiện diện của hợp chất acid oleanolic, acid 4-hydroxybenzoic, methyl 4-

hóa học của 5 hợp chất trên từ cao etyl acetat của vỏ cây đào tiên thu hái ở thành

phố Hồ Chí Minh (Phạm et al.,2015)

2.1.6.2 Một số nghiên cứu của nước ngoài

Nghiên cứu về hợp chất tự nhiên iridoids và iridoids glucosides từ quả đào tiên do Tetsuo Kaneko, Nguyen Minh Duc và các cộng sự thực hiện vào năm 1997 Nghiên cứu này sử dụng phương pháp NMR để xác nhận sự hiện diện của 8 hợp chất iridoids và iridoid glucosides trong đó có 5 hợp chất iridoids mới có tên là crescentins I, II, III, IV, V và 3 hợp chất iridoid glucosides mới có tên là

crescentosides A, B, C (Kaneko et al.,1997)

Cùng năm dó, nghiên cứu về hợp chất tự nhiên n-alkyl glycosides và hydroxybenzoyloxy glucose từ quả đào tiên do Tetsuo Kaneko, Nguyen Minh Duc

p-và các cộng sự thực hiện Nghiên cứu này chỉ ra rằng quả đào tiên có chứa 8 hợp chất mới cùng với 4 hợp chất đã biết, acanthoside D, β-D-glucopyransoyl benzoate, (R)-l-O-β-D-glucopyranosyl-l,3-octanediol, and β-D-fructofuranosyl 6-O-(p-

hydroxybenzoyl)-α-D-glucopyranoside Cấu trúc của những glycosides mới này đượccấu tạo bởi 3 glycosides của (2R,4S)-2,4-pentanediol, 2 glycosides của (R)-4-hydroxy-2-pentanone, 2 glycosides của (R)-l,3-octanediol và 6-O-(p-

hydroybenzoyl)-D-glucose bằng phương pháp quang phổ và hóa học (Kaneko et

al.,1998)

Nghiên cứu hoạt tính kháng nọc độc rắn của dịch chiết ethanol từ quả đào tiên được thí nghiệm ở Mangalore, Ấn Độ vào năm 2012 do Shastry CS, Bhalodia Maulik, và Aswathanarayana BJ thực hiện Phát hiện của nghiên cứu này xác nhận khả năng trung hòa nọc rắn trung bình của chiết xuất ethanol của quả đào tiên nhờ

vào sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên alkaloid, flavonoid, glycoside, steroid vàtannin cần thiết cho sự phát triển của thuốc giải độc hóa học đối với nọc rắn

(Shastry et al.,2012)

2.2 Dung môi tách chiết

Vì cây cỏ hoặc sinh khối (biomass) có cấu tạo hóa học thường là những chất liệu đại phân tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ Do đó việc khảo sát hợp chất tự nhiên được thực hiện bằng cách chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu(lyophilic) có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước (hydrophilic) Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăngdần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)

Lựa chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát; sau khi tách chiết xong dung môi đó có thể được loại bỏ dễ dàng Cần tránh các loại dung môi độc như benzene hoặc dễ cháy

do có nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether

Các dung môi được chia thành các nhóm không phân cực, phân cực aprotic,

và phân cực protic và được sắp xếp theo độ phân cực tăng dần Độ phân cực được

tính bằng hằng số điện môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Bảng 2.1 Tính chất của các dung môi phổ biến (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Dung môi Công thức hóa

học

Điểm sôi

Hằng số điện môi

Tỷ trọng

Moment phân cực Dung môi không phân cực

Formic acid H-C(=O)OH 101°C 58 1.21 g/

Các chất chống oxy hóa là các chất làm ngăn chặn, làm chậm hoặc đảo

ngược quá trình quá trình oxy hóa các hợp chất trong tế bào của cơ thể (Jovanovic

& Simic, 2000; Lachman et al., 2000; Singh & Rajini, 2004) Dựa trên nguyên tắc

hoạt động, chất chống oxy hóa được phân loại thành bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do dokìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa Ở bậc hai, các chất này kìm hãm sự tạo thành gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím, tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe, vô hoạt oxy đơn)

(Singh & Rajini, 2004; Rolland, 2004)

Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp từ bên

trong và bên ngoài Bên trong bao gồm các protein (ferritine, transferrine, albumine,protein sốc nhiệt) và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase) Các chất oxy hóa từ bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường ăn uống như các loại vitamin C, E, các carotenoid, và cáchợp chất phenolic, các chất này có nhiều trong rau củ quả Và được coi là các chất

chống oxy hóa tự nhiên hay còn gọi là hợp chất thứ cấp (Niki et al.,1995; Lachman

et al.,2000; Pincemail et al.,1998; Vansant et al.,1998) Chất chống oxy hóa được

coi như là chất dinh dưỡng có tác dụng giảm tác hại của các gốc tự do trên các tế bào của cơ thể, và nó làm giảm những tổn thương bị các gốc tự do gây nên Bên cạnh đó, chất chống oxy hóa sẽ loại bỏ các gốc tự do để ngừa bệnh tật và giúp cải thiện sức khỏe con người.

Chế độ ăn uống có nhiều rau quả là cách hiệu quả và đơn giản nhất nhằm tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa (Lại Thị Ngọc Hà & Vũ Thị Thư, 2009)

Nhóm hợp chất phenol C6-C1: acid gallic

Nhóm hợp chất phenol C6-C3: acid cafeic

Nhóm hợp chất phenol C6-C3-C6: catechin, flavonoid

Phần lớn các hợp chất phenolic (và đặc biệt là flavonoids) có thể được phát hiện trên sắc ký đồ dựa trên màu sắc hoặc phát huỳnh quang dưới tia cực tím Các sắc tố phenolic được nhận thấy rõ ràng màu vì vậy chúng được dễ dàng theo dõi trong quá trình cô lập và tinh sạch Các hợp chất phenolic đều có nhân thơm, do đó đều cho thấy cường độ hấp thụ cao trong vùng UV của quang phổ Vì vậy, phương pháp quang phổ đặc biệt quan trọng đối với việc xác định và phân tích định lượng hàm lượng polyphenol (Harbone, 1973)

Hợp chất polyphenol tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái

mà đa số là thực vật Ảnh hưởng của chúng trong các mô thực vật có thể được chia thành các loại sau:

 Giải phóng và ức chế hormone tăng trưởng như auxin

 Chống bức xạ ion hóa và cung cấp sắc tố thực vật (V Lattanzio et al., 2006)

 Phòng chống các bệnh nhiễm trùng vi khuẩn (phytoalexins)

 Là phân tử tín hiệu trong sự chín của quả và quá trình phát triển khác

(Huber et al.,2003)

Hình 2.3 Cấu tạo của theaflavin-3-galatte, là polyphenol có nguồn gốc từ thực vật

(ester của acid gallic và một gốc theaflavin)

Các gốc tự do được sinh ra và tích luỹ trong cơ thể, là nguyên nhân dẫn đến bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hoá cơ thể con người Hợp chất

polyphenols trong tanin có tác dụng khử các gốc tự do ở mức độ cao Ví dụ, acid gallic và isoflavones có thể hấp thụ khoảng 5% với lượng catechin (flavonoid hay flavan-3-ols) và glucoside thường thấp hơn Các phenol hấp thụ ít nhất là

proanthocyanidins, galloylated catechin trong lá chè và anthocyanin (Manach et

al.,2005).

Acid gallic (tannin thủy phân) Phloroglucinol (Phlorotannin)

Hình 2.4 Cấu tạo hóa học của acid gallic và phloroglucinol

(Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tannin)

2.4.3 Terpenoid

Terpenoid, đôi khi được gọi là isoprenoid, là một nhóm lớn và đa dạng của hợp chất hữu cơ tự nhiên có nguồn gốc từ terpen Khoảng 60% sản phẩm tự nhiên được biết đến là có chứa terpenoid, terpenoid chứa nhóm chức năng bổ sung thường

có oxy (Firn R.,2010)

Terpenoid là dạng biến đổi của terpen, mà trong đó các nhóm methyl đã được di chuyển hoặc bị loại bỏ, hoặc được thêm vào các nguyên tử oxy Giống như terpens, các terpenoid có thể được phân loại theo số lượng đơn vị isoprene bao gồm các terpene gốc:

Hemiterpenoids, 1 đơn vị isoprene (5 carbon)

Monoterpenoids, 2 đơn vị isoprene (10C, có nguồn gốc từ monoterpen)Sesquiterpenoids, 3 đơn vị isoprene (15C, có nguồn gốc từ sesquiterpen)Diterpenoids, 4 đơn vị isoprene (20C, có nguồn gốc từ diterpen) Ví dụ:

Polyterpenoid với một số lượng lớn của các đơn vị isoprene

Terpenoid từ thực vật được sử dụng rộng rãi nhờ vào các phẩm chất hương thơm của nó và đóng vai trò quan trọng các phương thuốc thảo dược truyền

thống Terpenoid tạo nên hương thơm của bạch đàn, hương quế, đinh hương, gừng, màu vàng trong hoa hướng dương và màu đỏ trong cà chua Những terpenoid phổ biến thường được biết đến bao gồm tinh dầu bạc hà, long não, cannabinoid tìm thấy

trong cần sa, ginkgolide và bilobalide được tìm thấy ở loài Ginkgo biloba và

curcuminoid được tìm thấy trong củ nghệ và hạt giống mù tạt Phương pháp

Salkowski có thể được sử dụng để xác định sự hiện diện của terpenoid (Ayoola, 2008)

Hình 2.5 Cấu tạo của retinol (retinol là một diterpenoid)

(Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Terpenoid)

2.4.4 Alkaloid

Alkaloid là một nhóm các hợp chất hữu cơ tự nhiên mà hầu hết đều có chứa nguyên tố nitơ Nhóm chất này cũng bao gồm một số hợp chất có tính trung hòa hoặc acid yếu Một số hợp chất có cấu trúc tương tự cũng có thể được coi như là

alkaloid Ngoài các nguyên tố carbon, hydro và nito, alkaloid cũng có thể chứa oxy, lưu huỳnh và các nguyên tố ở nhóm halogen và photpho (Manske, 1965)

Alkaloid được sản xuất bởi một loạt các sinh vật gồm vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật, và có thể được tinh sạch từ dịch chiết thô từ những sinh vật trên bằng chiết bằng acid-base Alkaloid có nhiều dược tính bao gồm chống ung thư (ví

dụ như homoharringtonine), (Kittakoop et al.,2014), thuốc giảm đau (ví dụ như morphine), (Raymond et al.,2010) kháng khuẩn (ví dụ như chelerythrine) (Qiu et al.,2014)

Hình 2.6 Cấu tạo hóa học của colchicine alkaloid

2.4.5 Saponin

Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Saponin có trong nhiều loài thực vật, cả thực vật hoang dại lẫn thực vật gieo trồng Có hai loại saponin, đó là saponin acid (triterpenoid saponin) và saponintrung tính (steroid saponin) Saponin acid có mặt chủ yếu trong thực vật gieo trồng còn saponin trung tính có mặt chủ yếu trong thực vật hoang dại, đặc biệt là trong thảo dược Nhóm cây đậu như đậu tương, đậu Hà lan, cỏ luzern… và một số cây cỏ

có tính chất tạo bọt như rễ cây sà phòng (soap root), vỏ cây sà phòng (soap bark)…

khá giàu saponin (Sapa et al., 2009) Dựa vào cấu trúc của phần sapogenin, người

ta chia saponin ra làm 3 nhóm lớn là triterpenoid saponin, steroid saponin và

glycoalkaloid dạng steroid (Riguera & Ricardo, 1997)

saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường Các đường phổ biến là D-glucose, D-galactose,L-arabinose, acid galactunoic, acid D-glucuronic Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi hoặc sapogenintriterpen dạng β-amirin (acid olenoic), dạng α-amirin (acid asiatic), dạng lupol (acid buletinie) hoặc triterpen bốn vòng (Hostettmann & Marston, 1995)

Hình 2.6 Cấu tạo hóa học của saponin solanine

2.5 Giới thiệu về phương pháp Response Surface Methods (RSM)

Tối ưu hóa đề cập đến việc cải thiện hiệu suất của một hệ thống, một quy trình hoặc một sản phẩm để có được lợi ích tối đa từ nó Thuật ngữ tối ưu hóa đã được sử dụng phổ biến trong hóa học phân tích như là một phương tiện để tìm ra các điều kiện để áp dụng một quy trình tạo ra phản ứng tốt nhất có thể Theo truyền thống, tối ưu hóa trong hóa học phân tích đã được tiến hành bằng cách theo dõi ảnh hưởng của một yếu tố tại một thời điểm trên một phản ứng thử nghiệm Kỹ thuật tối

ưu hóa này được gọi là một biến tại một thời điểm Nhược điểm chính của nó là không bao gồm các hiệu ứng tương tác giữa các biến được nghiên cứu Để khắc

phục vấn đề này, việc tối ưu hóa các quy trình phân tích đã được thực hiện bằng

cách sử dụng các kỹ thuật thống kê đa biến (Bezerra et al.,2008)

Trong số các kỹ thuật đa biến được sử dụng phổ biến trong tối ưu hóa phân tích là phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Phương pháp phản ứng bề mặt là tập hợp các kỹ thuật toán học và thống kê dựa trên sự phù hợp của phương trình đa thứcvới dữ liệu thực nghiệm Nó có thể được áp dụng tốt khi một phản ứng hoặc một nhóm các phản ứng quan tâm bị ảnh hưởng bởi một số biến Mục tiêu là để tối ưu

hóa mức độ của các biến này để đạt được hiệu năng quy trình tốt nhất (Bezerra et al.,2008)

2 Lựa chọn thiết kế thí nghiệm và thực hiện các thí nghiệm theo ma trậnthí nghiệm đã chọn

3 Xử lý thống kê về toán học của dữ liệu thực nghiệm thu được thông qua sự phù hợp của hàm đa thức

4 Đánh giá hiệu suất của mẫu

5 Xác minh sự cần thiết và khả năng thực hiện chuyển vị hướng tới khu vực tối ưu

6 Có được các giá trị tối ưu cho từng biến được nghiên cứu

Nhiều biến số có thể ảnh hưởng đến phản ứng của hệ thống nghiên cứu và thực tế không thể xác định và kiểm soát các ảnh hưởng nhỏ từ mỗi biến số Do đó, cần phải chọn các biến có tác dụng chính Thiết kế sàng lọc nên được đưa ra để xác

định biến nào trong số một số biến thực nghiệm và tương tác của chúng có ảnh hưởng quan trọng hơn Thiết kế giai thừa hai cấp đầy đủ hoặc phân đoạn có thể được sử dụng cho mục tiêu là chủ yếu vì chúng hiệu quả.

Mô hình đơn giản nhất có thể được sử dụng trong RSM dựa trên hàm tuyến tính Đối với ứng dụng của nó, điều cần thiết là các phản ứng thu được phải phù hợpvới phương trình sau:

y=β0∑

i=1

k

β i x i+ε

Trong đó, k là số lượng biến, β0 là số hạng không đổi, βi là các hệ số của các tham

số tuyến tính, xi đại diện cho các biến số và ε là phần dư liên quan đến các thí nghiệm

Do đó, để đánh giá độ cong, phải sử dụng đến mô hình bậc hai và một điểm

trung tâm trong thiết kế giai thừa hai cấp có thể được sử dụng (Bezzera et al.,2008)

2.5.2 Công dụng của phương pháp RSM

 Là một phương pháp thống kê thực tế hiệu quả được áp dụng vào những quy trình, thí nghiệm, thử nghiệm nhằm tiên đoán giá trị tối ưu của các yếu tố, qua đó có thể tiết kiệm được chi phí và thời gian

 Thể hiện được sự phản hồi qua lại lẫn nhau giữa các yếu tố khảo sát

 Thu gọn phạm vi của các mức yếu tố khác nhau dẫn đến làm hợp lý hóa các thông số kỹ thuật yêu cầu của nghiên cứu hoặc quy trình đó

 Đảm bảo sự tương quan giữa các mô hình dự đoán và kết quả thực nghiệm

 Mô tả kết quả tối ưu thông qua việc tối ưu hóa các yếu tố đưa ra của nghiên cứu (Khuri & Mukhopadhyay, 2010)

2.5.3 Ưu, nhược điểm của phương pháp RSM

 Ưu điểm:

- Có giá trị thực tế vì dữ liệu có được dựa trên thực nghiệm

- Có thể áp dụng được nhiều quy trình, hệ thống, thí nghiệm nào có các yếu tố khảo sát và sự ảnh hưởng nhất định của các yếu tố đó.

- Thiết kế được thí nghiệm tối ưu một cách dễ dàng, nhanh chóng

- Tiết kiệm được chi phí và thời gian của đơn vị thực hiện (Khuri &Mukhopadhyay, 2010)

 Nhược điểm:

- Chưa chính xác hoàn toàn vì sự phản hồi sẽ không có giá trị đối với những ảnh hưởng khác nằm ngoài các yếu tố được khảo sát (Khuri & Mukhopadhyay, 2010)

2.5.4 Một số mô hình thí nghiệm phổ biến trong phương pháp RSM

2.5.4.1 Mô hình Box-Behnken design (BBD)

Thiết kế này được phát triển bởi Box và Behnken vào năm 1960, nó cung cấp 3 cấp độ cho mỗi yếu tố và bao gồm một tập hợp con cụ thể của các yếu tố Box

và Behnken đã đề xuất cách chọn điểm từ sắp xếp của giai thừa ba cấp, cho phép ước tính hiệu quả các hệ số bậc nhất và bậc hai của mô hình toán học.Theo cách này, thí nghiệm sẽ hiệu quả và tiết kiệm hơn đối với thiết kế 3k tương ứng của chúng Việc sử dụng thiết kế BBD rất phổ biến trong nghiên cứu hoặc công nghiệp

vì đây là một thiết kế kinh tế và chỉ yêu cầu 3 cấp độ cho mỗi yếu tố được thiết lập

là −1, 0, 1 Bên cạnh đó, mô hình BBD được sắp xếp trong một khối đa diện, gần như một hình cầu Số thí nghiệm phải thực hiện là N= 2k (k-1) + cp trong đó k là các yếu tố và cp (central points) là số thí nghiệm ở giá trị trung tâm được thực hiện lặp lại (Pazman, 1986)

Hình 2.6 Mô hình mô phỏng Thiết kế thí nghiệm dựa trên nghiên cứu tất cả các yếu tố ở 3 cấp độ: thiết kế giai thừa ba cấp để tối ưu hóa (a) 2 yếu tố và (b) 3

yếu tố (c) Thiết kế Box Behnken để tối ưu hóa 3 yếu tố (Bezarra et al., 2008).

Ta có thể dễ dàng nhận thấy hình 2 (c) mô phỏng thiết kế Box Behnken để tối ưu hóa 3 yếu tố với 13 điểm thử nghiệm Trong khi đó thiết kế giai thừa tối ưu hóa 33 ban đầu với 27 thí nghiệm (Hình 2 (b)), thì rõ ràng phương pháp RSM – BBD kinh tế và hiệu quả hơn

Mô hình BBD được áp dụng cho 3 yếu tố bao gồm tổ hợp 15 thí nghiệm, trong đó có thí nghiệm trung tâm được thực hiện lặp lại 3 lần theo ma trận sau:

Bảng 2.2 Mô hình thiết kế thí nghiệm theo phương pháp RSM – BBD

B11, B22, B33: các hệ số bậc 2

B12, B13, B23: các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố

B0: hệ số tự do

X1, X2, X3, X11, X22, X33, X12, X13, X23: các biến độc lập

Xử lí các số liệu thống kê, tính toán, lập phương trình hồi quy và chọn điểm tối

ưu của các yếu tố cho sản lượng cao nhất từ mô hình Dựa vào điểm đó, tiến hành

thí nghiệm kiểm chứng các giá trị tối ưu của các yếu tố đó (Draper et al.,2007) 2.5.4.2 Mô hình Central Composite Design (RSM – CCD)

Mô hình thiết kế hỗn hợp trung tâm (RSM – CCD) là thí nghiệm thiết kế bề mặt đáp ứng được sử dụng phổ biến nhất Thiết kế hỗn hợp trung tâm là một thiết

kế giai thừa hoặc phân đoạn với các điểm trung tâm, được tăng thêm một nhóm các điểm trục (còn gọi là điểm sao) cho phép ước tính độ cong

Ma trận thiết kế phức hợp trung tâm CCD được mô tả lần đầu tiên bởi hai nhà khoa học Box và Wilson bao gồm các phần sau:

1) Thiết kế thừa số phân đoạn trên các mức mã hóa: mức trung bình (0), mứcthấp (-1) và mức cao (+1);

2) Thiết kế thêm các điểm nằm ngoài vùng phân đoạn, cách vị trí trung tâm (0) một khoảng

3) Biểu diễn lặp lại các điểm trung tâm của phương pháp

Hình 2.7 Mô hình mô phỏng thiết kế hỗn hợp trung tâm RSM – CCD để tối

ưu hóa thí nghiệm gồm 2 yếu tố (a) hoặc 3 yếu tố (b) (Bezarra et al., 2008).

Số thí nghiệm k2 + 2k + cp với k các yếu tố còn cp là số thí nghiệm ở trung tâm được thực hiện lặp lại Nếu k>5 có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương án yếu tố từng phần 2k-1 Các yếu tố phân loại được thêm vào, thiết

kế sẽ tổng hợp sẽ nhân đôi cho mỗi sự kết hợp của các cấp yếu tố phân loại Giá trị

α phụ thuộc vào số lượng các yếu tố Trong đó, alpha (α) là khoảng cách của mỗi điểm trục (còn gọi là điểm sao) từ tâm trong thiết kế hỗn hợp trung tâm Đối với hai, ba và bốn yếu tố, α lần lượt là 1,41; 1,68 và 2,00 (Bảng 2.3 & 2.4)

Các yếu tố chính trong RSM – CCD được xác định giá trị tối ưu và được

nghiên cứu ở 5 mức (-α, -1, 0, +1, +α) (Bezarra et al., 2008).

Mô hình RSM – CCD được áp dụng cho 2 và 3 yếu tố có 5 thí nghiệm trung tâm được thiết kế theo các ma trận sau:

Bảng 2.3 Mô hình thiết kế thí nghiệm theo phương pháp RSM – CCD áp

Bảng 2.4 Mô hình thiết kế thí nghiệm theo phương pháp RSM – CCD áp

Hàm đáp ứng được chọn là Y Mô hình hóa được biểu diễn bằng phương trình bậc 2:

2.6 Giới thiệu về phương pháp DPPH

Các mối quan tâm ngày càng tăng đối với các chất chống ung thư, đặc biệt làtrong các mục đích ngăn chặn các tác động có hại được cho là của các gốc tự do trong cơ thể con người, và để ngăn chặn sự suy giảm chất béo và các thành phần khác của thực phẩm Trong cả hai trường hợp, có sự ưu tiên cho các chất chống oxyhóa từ tự nhiên hơn là từ các nguồn tổng hợp (Abdalla và Roozen, 1999)

Để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do, phương pháp DPPH được dùng khá phổ biến vì đơn giản, hữu hiệu, nhanh, đáng tin cậy và không yêu cầu một phản ứngđặc biệt hay thiết bị nào Năm 1922, Goldschmid và Renn đã phát hiện ra hợp chất bền có màu tím đậm, ít bị phân hủy và không phản ứng với oxy đó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) DPPH là hợp chất có màu tím giống như màu của KMnO4, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ Hợp chất

DPPH, ở bước sóng cực đại ở 517nm, có thể dễ dàng nhận được một điện tử hoặc hydro từ các phân tử chống oxy hóa để trở thành một phân tử nghịch từ ổn định

(Soares et al., 1997) Các hoạt động khử gốc tự do của các chất chiết xuất phụ thuộcvào khả năng của các hợp chất chống oxy hóa làm mất hydro và cấu trúc cấu trúc

của các thành phần này (Shimada et al., 1992; Fukumoto & Mazza, 2000) Thử

nghiệm này dựa trên sự cho nhận điện tử của các chất chống oxy hóa để vô hiệu hóagốc DPPH, đi kèm với sự thay đổi màu sắc được đo ở bước sóng 517nm Sự đổi màu hoạt động như một chỉ số về hiệu quả chống oxy hóa và có thể được báo cáo là

IC50, được định nghĩa là nồng độ của chất chống oxy hóa cần thiết để giảm nồng độ DPPH ban đầu xuống 50% Sự đổi màu từ tím sang vàng xảy ra do số lượng gốc DPPH trong môi trường giảm, do đó, sự đổi màu của DPPH phản ánh hoạt động

“dọn dẹp” triệt để của dịch chiết được phân tích (Guo et al., 2007; Molyneux,

2004) Từ kết quả đo được, ta xác định khả năng ức chế gốc tự do theo công thức sau:

%DPPH = OD blank OD−OD sample

Trong đó:

ODblank: độ hấp thụ quang của mẫu trắng

ODsample: độ hấp thụ quang của mẫu khảo sát

Từ đó, ta lập dãy dữ liệu tuyến tính để suy ra được hàm y = ax + b, sau đó dùng phương pháp nội suy để tính giá trị IC50 tức là nồng độ cần thiết để giảm nồng

độ DPPH ban đầu xuống 50% Dựa vào đó, ta có cơ sở so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa các mẫu với vitamin C (acid ascorbic) Mẫu nào có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm chuyên đề - Viện Công nghệ Hóahọc – Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố

Hồ Chí Minh

3.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 09/2018 đến tháng 01/2019

3.3 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu lá cây và quả của cây Đào Tiên được thu thập tại vườn cây địa phương thuộc xã Nhơn Đức, huyện Nhà Bè, Thành phố Hồ Chí Minh

3.3.1 Thiết bị, dụng cụ thực hiện thí nghiệm

3.3.2 Hóa chất thực hiện thí nghiệm

Bảng 3.2 Hóa chất thí nghiệm

Hóa chất Hãng sản xuất

Thuốc thử DPPH (

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl )

Đức