KHẢO sát KHẢ NĂNG KHÁNG OXY hóa của các PROTEIN THỦY PHÂN BẰNG ENZYME từ NHUNG hươu

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN/ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC PROTEIN THỦY PHÂN BẰNG ENZYME TỪ NHUNG HƯƠU Người hướng dẫn: Ths NGUYỄN THỊ HỒNG NƠ Người thực hiện: NGUYỄN DUY Lớp : 14060302 Khoá : 18 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN/ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC PROTEIN THỦY PHÂN BẰNG ENZYME TỪ NHUNG HƯƠU Người hướng dẫn: Ths NGUYỄN THỊ HỒNG NƠ Người thực hiện: NGUYỄN DUY Lớp : 14060302 Khố : 18 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC VIẾT TẮT AU/g BSA DNA DPPH EDTA IC LDL MW RNS ROS SGI UV/Vis Anson Units per gram Bovine serum albumin Deoxyribonucleic acid 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Ethylenediaminetetraacetic acid Inhibitory concentration Low density lipoprotein Molecular weight Reactive nitrogen species Reactive oxygen species Simulated gastrointestinal digestion Ultraviolet–visible spectroscopy CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần đây, tác dụng phụ mà tân dược mang lại nhận thức việc sử dụng sản phẩm, dược phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên nâng cao Tuy nhiên, nghiên cứu công bố chủ yếu thực vật, nghiên cứu thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức từ động vật hạn chế Mặc dù dược liệu từ động vật chứng minh có chứa nhiều chất dinh dưỡng quan trọng khác như: protein, phân đoạn peptide, acid béo, glycosaminoglycan, prostaglandin, vitamin, chất khoáng, chất xơ, tinh dầu carotenoid [1, 2], chất sử dụng để phòng chữa nhiều loại bệnh Trong đó, nhung hươu, loại dược liệu dùng từ 2000 năm trước, có tác dụng hỗ trợ khả miễn dịch, thể lực tăng cường sinh lý [3, 4] sử dụng nhiều quốc gia giới: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Úc, Nga Theo ước tính sản lượng nhung hươu toàn cầu thu khoảng 1300 tấn/năm, tiếp tục tăng để đáp ứng nhu cầu thị trường [3, 5] Những năm gần đây, để phát huy khả chữa bệnh nhung hươu cách triệt để, nhà khoa học nghiên cứu để tách hợp chất có hoạt tính sinh học nhung hươu nhiều phương pháp khác Tại Việt Nam, nhung hươu xem loại dược liệu quý, theo kết nghiên cứu nhung hươu đứng thứ hai tứ đại bảo dược “Sâm-Nhung-Quế-Phụ” y học cổ truyền, có chứa khoảng 19 loại amino acid bào gồm loại amino acid khơng thay [6], đoạn peptide protein xem thành phần có hoạt tính sinh học bật Tuy nhiên dùng nhung hươu theo kinh nghiệm dân gian Do đó, việc xuất nhằm phân lập thành phần có hoạt tính nhung hươu cần thiết để tăng cường hiệu sử dụng y học Trong phương pháp phân lập, việc sử dụng enzyme để thuỷ phân nghiên cứu năm gần hạn chế, nghiên cứu thực để khảo sát hoạt tính protein thuỷ phân từ nhung hươu loại enzyme khác 1.2 Mục đích đề tài Tìm hiểu tổng quan loại enzyme, thuỷ phân protein từ nhung hươu enzyme Thủy phân nhung hươu hệ enzyme đơn kết hợp hai enzyme Xác định khả thủy phân Xác định khả kháng oxy hoá đoạn peptide thuỷ phân phương pháp khác Xác định nguyên nhân gây vị đắng dịch thuỷ phân phương pháp khử đắng 1.3 Ý nghĩa Kết đề tài nghiên cứu có giá trị tham khảo mức độ thuỷ phân protein thuỷ phân từ Nhung hươu, khả kháng oxy hoá dịch thuỷ phân, tiền đề để phân tích thu nhận đoạn peptide có hoạt tính sinh học dùng để ứng dụng lĩnh vực y học, thực phẩm chức dùng làm dược liệu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 2.1 Sơ lược nguyên liệu 2.1.1 Khái quát lịch sử tình hình nuôi hươu Việt Nam Theo số tài liệu ghi nhận hươu ban đầu nuôi tự phát hộ gia đình vùng Nghệ An, Hà Tĩnh cách bắt hươu rừng nuôi hố từ năm 1929 Vì nhận thấy tiềm giá trị kinh tế cao nên việc nuôi hươu phát triển mạnh vào năm từ 1945-1949, sau số lượng hươu nuôi bị giảm mạnh trận lụt lớn năm 1950 1960 Năn 1964, ngành Lâm Nghiệp triển khai nuôi hươu Vường Quốc gia Cúc Phương Từ năm 1967, ngành Nông Nghiệp xây dựng trại chăn nuôi hươu giống Hương Sơn, Hà Tĩnh Do có nhiều điều kiện thuận lợi cho việc chăn nuôi nên nghề nuôi hươu phát triển mạnh hai tỉnh Nghệ An Hà Tĩnh năm 1980-1995, tổng số hươu nuôi đạt 15.000 Trong giai đoạn từ 19961998, lượng hươu nuôi vùng Nghệ An Hà Tĩnh bị giảm số lượng biến động giá Đến nay, nghề nuôi hươu đà phát triển ổn định mở rộng thêm số địa phương nước, có điều kiện tốt để phát triển nghề nuôi hươu nên nghề nuôi hươu phát triển mạnh tỉnh thành như: Đồng Nai, Nghệ An, Hà Tĩnh Là vùng nuôi hươu sử dụng làm nguyên liệu chính, huyện Vĩnh Cửu tỉnh Đồng Nai theo thông tin cập nhật vào tháng 01/2018 số lượng hươu nuôi đạt khoảng gần 3000 10 2.1.2 Phân loại danh pháp  Phân loại: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Mammalia Bộ: Artiodactyla Họ: Cervidae Phân họ: Cervinae Chi: Cervus Loài: Cervus nippon  Danh pháp: Tên tiếng anh: Sika Deer Hình 2.1: Ảnh chụp hươu Tên khoa học: Cervus nippon 2.1.3 Thành phần hoá học giá trị dinh dưỡng nhung hươu Nhung hươu giàu acid amin, polipeptide protein, coi thành phần có hoạt tính sinh học bật Đến nay, có khoảng 19 loại amino acid phân lập bao gồm loại amino acid không thay (Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan, Valine Histidine) Trong đó, amino acid như: Aspartic acid, Aspartic acid, Proline, Glycine Arginine chiếm khoảng 32.5-37.2% tổng số amino acid [8] Những nghiên cứu Khoa học chứng minh nhung gạc có nhiều chức năng, chẳng hạn điều hòa miễn dịch, chống ung thư, chống mệt mỏi, chống lỗng xương, chống viêm, chống oxy hóa, chữa bệnh hỗ trợ điều hoà thể Nhung hươu sử dụng loại thuốc bổ sức khỏe quan trọng với giá trị dinh dưỡng dược liệu tuyệt vời, sản phẩm nhung hươu nghiên cứu sâu nhằm đưa vào ứng dụng thuốc chữa bệnh[7] 27 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 TN10 TN11 TN12 TN13 TN14 TN15 TN16 TN17 TN18 TN19 TN20 TN21 TN22 TN23 TN24 TN25 TN26 TN27 Protamex (4 giờ) α-Amylase (4 giờ) Cellulase (4 giờ) Không enzyme (-) (4 giờ) Protamex (4giờ) + Flavourzyme (2 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) 21/09/2018 25/09/2018 27/09/2018 28/09/2018 26/09/2018 29/10/2018 30/10/2018 02/11/2018 26/10/2018 01/11/2018 31/10/2018 31/10/2018 31/10/2018 31/10/2018 22/11/2018 22/11/2018 22/11/2018 22/11/2018 22/11/2018 26/12/2018 26/12/2018 26/12/2018 26/12/2018 28 3.3.2 Giải thích quy trình thí nghiệm Xây nhuyễn Ngun liệu sau xử lý sơ ban đầu xây nhuyễn nguyên liệu giúp tăng diện tích tiếp xúc chất enzyme, nhằm tạo điều kiện cho enzyme hoạt động tốt diện tích tiếp xúc lớn trình thuỷ phân diễn nhanh hiệu Hoà vào nước Tỷ lệ nước thêm vào yếu tố quan trọng nước có ảnh hưởng trực tiếp dến hiệu suất thủy phân enzyme Nó có khả điều chỉnh phản ứng thủy phân, lẽ nước môi trường khuếch tan enzyme chất tạo điều kiện cho tốc độ phản ứng xảy Tỉ lệ nước sử dụng thuỷ phân nguyên liệu nhung hươu lựa chọn 1:20 Thuỷ phân enzyme Khi thuỷ phân enzyme cần dùng nhiệt độ điều kiện ơn hồ vào khoảng 4050°C Sử dụng nguồn enzyme từ chế phẩm enzyme thương mại, kết hợp nhiều loại enzyme với để tăng hiệu suất thủy phân Sử dụng enzyme để thuỷ phân giúp hạn chế sử dụng hóa chất nên làm biến đổi acid amine, sản phẩm an toàn giá trị dinh dưỡng khơng giảm nhiều Ly tâm Mục đích việc ly tâm để loại cặn, thu dịch protein hồ tan để chuẩn bị cho bước sấy đơng khơ Dịch thuỷ phân tuỳ mức độ lắng enzyme dùng thuỷ phân khác mà có tốc độ ly tâm khác thường khoảng 3000 vòng/phút dịch thuỷ phân lắng tốt Sấy đông khô Sấy đông khơ q trình tách ẩm khỏi vật liệu sấy cách thăng hoa, nước bên chuyển trực tiếp từ thể rắn sang thể mà không qua trạng thái lỏng, sản phẩm thu dễ dàng bảo quản, khơng ảnh hưởng nhiều đến cấu 29 trúc vật liệu sấy Đối với dịch thuỷ phân thu khoảng 16-18mL mẫu dùng 1g nguyên liệu thời gian sấy khoảng 24 Sản phẩm sau bảo quản tủ đơng -4°C, cần kiểm tra mẫu để mẫu hết lạnh bình hút ẩm khoảng 30 phút lấy mẫu để tránh tượng mẫu bị nhiễm ẩm lại 3.4 Xác định hàm lượng protein hòa tan phương pháp Lowry Nguyên tắc Phương pháp dựa phản ứng tạo màu protein thuốc thử Folin bước sóng 660 nm Màu dung dịch đậm chứng tỏ nồng độ protein dung dịch cao Nồng độ protein xác định dựa đồ thị đường chuẩn protein Chuẩn bị Pha dịch A lowry: cân xác 0.4g NaOH (0.1M) 2g Na 2CO3 hồ tan 100mL nước khử ion Pha dịch B lowry: cân xác 0.5g CuSO4.5H2O định mức lên đến 100mL dung dịch natri citrate 1% Dung dịch C: pha hỗn hợp dung dịch A B theo tỉ lệ 49:1 Các dung dịch pha sử dụng ngày Thuốc thử Folin BSA làm dung dịch chuẩn Tiến hành Xác định nồng độ protein mẫu thí nghiệm: Cho 1mL dịch mẫu pha lỗng vào ống nghiệm, cho thêm mL dung dịch C, lắc Thêm 0.5 mL folin vào hỗn hợp trên, lắc để ổn định màu 30 phút, đo OD dung dịch bước sóng 660nm Màu dịch chuyển từ màu vàng sang màu xanh dương Mẫu đối chứng: ta thay mL dịch mẫu pha loãng 1mL nước cất thực bước tương tự Xây dựng đồ thị đường chuẩn: chất chuẩn BSA sử dụng để xây dựng đường chuẩn nồng độ xác định 30 Cân xác 0.01g BSA hòa vào 10 mL nước cất, ta dung dịch có nồng độ 1000µg/mL Pha lỗng xuống nồng độ 200, 400, 600, 800, 1000µg/mL để xây dựng đường chuẩn Cho 1mL Albumin vừa pha loãng nồng độ khác vào ống nghiệm, thực thao tác tương tự với mẫu thí nghiệm Bảng 3.3: xây dựng đường chuẩn BSA nồng độ khác Nồng độ (µg/mL) 200 400 600 800 1000 Albumin mg/mL 0.2 0.4 0.6 0.8 Nước cất 0.8 0.6 0.4 0.2 Dựng đường chuẩn Albumin phần mềm Microsoft Excel 2010, từ phương trình đường chuẩn ta tính nồng độ protein hồ tan có mẫu kiểm tra 3.5 Xác định hàm lượng protein hoà tan phương pháp Ninhydrin Nguyên tắc Ninhydrin chất có khả oxy hố mạnh, đoạn peptiede bị oxy hoá giảm bớt nguyên tử carbon, tạo thành aldehyde, carbondioxyde amoniac Tiếp theo, phân tử amoniac tạo thành phản ứng với ninhydrin tạo thành hydrindatin chất tạo phức chất có màu xanh tím với ninhydrin Đo cường độ màu bước sóng 570nm để xác định lượng protein hồ tan có mẫu kiểm tra Phản ứng màu ninhydrin xảy với acid amin mạch bên peptide protein với muối amoni, glucozamin ammoniac.Để định lượng xác acid amin, dung dịch nghiên cứu phải khơng có hợp chất 31 Hình 3.3: Ngun tắc phản ứng Ninhydrin Chuẩn bị Dung dịch mẫu 1% pha loãng nước khử ion nồng độ Dung dịch đệm citrate 0,4M; pH = Dung dịch etanol 50% Dung dịch ninhydrin cân 0.5g ninhydrin hoà 30mL ethanol 50% vào 20mL đệm acetate 0.1M pH=5.5 lắc sau bỏ bình tối sử dụng ngày Dung dịch chuẩn Glycine nồng độ 100μg/mL Tiến Hành Lấy 2mL dung dịch mẫu pha loãng nồng độ cho vào ống nghiệm Cho thêm 2mL ninhydrin, lắc đun sơi 15-20 phút Sau đó, lấy làm nguội nhanh nước lạnh, để ổn định màu dung dịch khoảng phút Đo giá trị hấp thu OD bước sóng 570 nm Cân xác 0.01g BSA hòa vào 100 mL nước cất, ta dung dịch có nồng độ 100µg/mL Pha lỗng xuống nồng độ 20, 40, 60, 80, 100µg/mL để xây dựng đường chuẩn Xây dựng đường chuẩn Glycine từ 20 – 100 μg/mL để thực tính tốn Bảng 3.4: xây dựng đường chuẩn Glycine nồng độ khác 32 Nồng độ (µg/mL) 20 40 60 80 100 Glycine 100µg/mL 0.4 0.8 1.2 1.6 Nước cất 1.6 1.2 0.8 0.4 Dựng đường chuẩn Glycine phần mềm Microsoft Excel 2010, từ phương trình đường chuẩn ta tính nồng độ protein hồ tan có mẫu kiểm tra 3.6 Xác định hoạt tính kháng oxy hố phương pháp bắt gốc tự DPPH Nguyên tắc DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) chất hữu cơ, có gốc N tự do, gây oxy hóa DPPH có màu hồng dạng tinh thể pha vào dung dịch Các chất có khả kháng oxy hóa bắt lấy gốc tự dung dịch DPPH tạo phức có màu vàng Màu DPPH đo hấp thụ bước sóng 517 nm, dung dịch bị màu cường độ hấp thu ánh sáng bước sóng 517 nm giảm Do đó, khả kháng oxy hóa xem khả làm màu DPPH Chuẩn bị Pha dung dịch DPPH 100µM: cân xác 0.004g DPPH (M=394.32, p>99.5%), pha vào 40mL cồn >99.5%, hoà tan Định mức lên đến 100mL cồn >99.5% Pha Vitamin C (acid ascorbic) 100µg/mL: cân 0.01g vitamin C hồ tan vào 100mL nước khử ion Tất dung dịch pha sử dụng ngày Chứa lọ sẫm màu gói kỹ giấy bạc, tránh tiếp xúc với ánh nắng trực tiếp nhiệt độ cao Tiến hành Pha mẫu 1% dùng để đem phân tích, pha lỗng xuống nồng độ xác định Hút 2mL mẫu phân tích cho vào ống nghiệm, thêm 0.5mL DPPH 100 µM lắc đều, để yên 30 phút Mẫu kiểm soát thực tương tự thay 100µL dịch mẫu peptide 100µL nước cất lần 33 Khả bắt gơc tự mẫu phân tích mẫu đối chứng đo bước sóng 517nm Kết xác định cơng thức bên Tính kết Cơng thức tính khả kháng oxy hố DPPH (IC%): IC% = Trong đó: OD control: giá trị độ hấp thu mẫu kiểm soát bước sóng 517 nm OD sample: giá trị độ hấp thu mẫu phân tích bước sóng 517nm 3.7 Xác định hoạt tính kháng oxy hố phương pháp khử H2O2 thuốc thử 1,10-phenanthroline Nguyên tắc Phương pháp dựa phản ứng ion sắt II (Fe 2+) với dung dịch 1,10phenanthroline, cho vào dung dịch ion sắt II kết hợp với 1,10-phenanthroline tạo thành phức hợp tri-phenanthroline có màu đỏ cam, hấp thụ tối đa bước sóng 570nm Khi có diện H2O2 dung dịch trước thêm 1,10-phenanthroline, Thì H2O2 oxy hoá tất ion sắt II thành sắt III nên khơng khả tạo thành phức hợp tri-phenanthroline màu đỏ cam Do đó, khả kháng oxy hoá theo phương pháp xác định khả bắt gốc H2O2 mẫu kiểm tra Chuẩn bị Pha dung dịch ferrous ammonium sulfate 1mM: cân xác 0.04g ferrous ammonium sulfate (M=392,138) hoà vào 95mL nước khử ion sau định mức đến 100mL H2SO4 0,01N Pha dung dịch 1,10-phenanthroline 1mM: cân xác 0.02g 1,10phenanthroline (M=198,22) hoà 100mL cồn 60% chứa 0.3% DMSO Pha dung dịch H2O2 5mM Chuẩn bị dung dịch Vitamin C 100µM/mL để làm chất chuẩn Lưu ý: cần bọc giấy bạc tất ống nghiệm, chứa dung dịch pha bình sẫm màu bảo quản ngăn mát tủ lạnh (4°C) sau sử dụng Tiến hành Chuẩn bị ống nghiệm cần kiểm tra, cho 0,25mL ferrous ammonium sulphate thêm vào Sau đó, thêm 1.5mL mẫu kiểm tra nồng độ khác Thêm 34 62.5µL H2O2 0.5mM ủ phút điều kiện tối Sau ủ, cho thêm 1.5mL dung dịch 1,10-phenanthroline 1mM lắc ủ tiếp 10 phút Đối với mẫu trắng thay 1.5mL mẫu phân tích 1.5mL nước khử ion Đối với mẫu chứng âm thay 1.5mL mẫu phân tích 62.5µL H 2O2 5mM 1.5625mL nước khử ion Tính kết Cơng thức tính khả kháng oxy hố H2O2 (IC%): IC% = Trong đó: OD sample: giá trị độ hấp thu mẫu kiểm tra bước sóng 510 nm OD control: giá trị độ hấp thu mẫu chứng âm bước sóng 510nm OD bannk: giá trị độ hấp thu mẫu trắng bước sóng 510nm 3.8 Phương pháp loại đắng 2-butanol Nguyên tắc Các phân đoạn peptide kỵ nước tách khỏi dung dịch cách sử dụng 2-butanol (Adler-Nissen 1986) Độ phân cực 2-butanol khoảng 0.506 lần so với nước, hồ tan tách phân đoạn peptide kỵ nước khỏi dung dịch Phương pháp Tiến hành Pha mẫu protein với hàm lượng 5% (cân 0.25g hoà vào 5mL nước khử ion), sau thêm vào 5mL 2-butanol lắc năm phút Tiếp theo, chuyển dung dịch hoà vào phễu để lắng vòng giờ, phần dịch 2butanol có tỷ trọng nhẹ nước nên nằm phía Khi kết thúc thời gian, thu nhận dịch vào hai lọ thuỷ tinh nhỏ, đem sấy khơ để tính phần trăm lượng protein hồ tan có dịch thu 35 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết nghiên cứu 4.1.1 Một số kết thực nghiệm nguyên liệu Bảng 4.1: Một số kết nguyên liệu Chỉ tiêu Nguyên liệu Phương pháp Độ ẩm (%) TCVN 426:2001 Hàm lượng protein tổng (%) 56.875 Kjeldahl Hàm béo (%) 1.87 CO2 siêu tối hạn Bảng 4.2: Kết xác định amino acid nguyên liệu STT Chỉ tiêu kiểm nghiệm Kết (%) 4-Hydroxyproline 2.61 Alanine 2.15 Arginine 4.33 Aspartic acid 3.37 Glutamic acid 5.38 Glycine 6.02 Histidine 1.01 Hydroxylysine 0.36 Isoleucine 1.38 10 Leucine 3.67 11 Lysine 2.39 12 Methionine 0.31 13 Phenylalanine 1.48 14 Proline 2.69 15 Serine 1.56 16 Threonine 1.81 17 Tryptophan 0.294 18 Tyrosine 0.92 19 Valine 2.81 Tổng 44.544% 36 4.1.2 Đánh giá hiệu suất thuỷ phân phương pháp lowry STT TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 TN10 TN11 TN12 TN13 TN14 TN15 TN16 TN17 TN18 TN19 TN20 TN21 TN22 TN23 TN24 TN25 TN26 TN27 Bảng 4.3: bảng kết hiệu suất thu hồi protein phương pháp lowry Enzyme thời gian thuỷ phân Tổng thời gian Hiệu suất (giờ) thu hồi protein (%) Alcalase (4 giờ) 86 Flavourzyme (4 giờ) 56 Neutrase (4 giờ) 35 Pepsin (4 giờ) 43 Protamex (4 giờ) 70 α-Amylase (4 giờ) 37 Cellulase (4 giờ) 60 Không enzyme (-) (4 giờ) 13 Protamex (4giờ) + Flavourzyme (2 giờ) 74 α-Amylase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) 62 α-Amylase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) 36 α-Amylase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) 100 α-Amylase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) 12 α-Amylase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) 34 Pepsin (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) 46 Pepsin (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) 84 Pepsin (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) 28 Pepsin (3 giờ) + Protamex (4 giờ) 69 Cellulase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) 38 Cellulase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) 95 Cellulase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) 45 Cellulase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) 43 Cellulase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) 98 Neutrase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) 4.1.3 Đánh giá hiệu suất thuỷ phân phương pháp Ninhydrin Bảng 4.4: bảng kết hiệu suất thu hồi protein phương pháp Ninhydrin 37 STT Enzyme thời gian thuỷ phân Tổng thời gian (giờ) TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 TN10 TN11 TN12 TN13 TN14 TN15 TN16 TN17 TN18 TN19 TN20 TN21 TN22 TN23 TN24 TN25 TN26 TN27 Alcalase (4 giờ) Flavourzyme (4 giờ) Neutrase (4 giờ) Pepsin (4 giờ) Protamex (4 giờ) α-Amylase (4 giờ) Cellulase (4 giờ) Không enzyme (-) (4 giờ) Protamex (4giờ) + Flavourzyme (2 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) 4 4 4 4 7 7 7 7 7 7 7 7 7 Hiệu suất thu hồi protein (%) 89 20 14 22 68 21 39 11 44 50 44 40 15 79 39 88 57 100 51 84 70 92 98 4.1.4 Kết khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH STT Bảng4.5: kết khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH Enzyme thời gian thuỷ phân IC50 (μg/mL) 38 TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 TN10 TN11 TN12 TN13 TN14 TN15 TN16 TN17 TN18 TN19 TN20 TN21 TN22 TN23 TN24 TN25 TN26 TN27 Alcalase (4 giờ) Flavourzyme (4 giờ) Neutrase (4 giờ) Pepsin (4 giờ) Protamex (4 giờ) α-Amylase (4 giờ) Cellulase (4 giờ) Không enzyme (-) (4 giờ) Protamex (4giờ) + Flavourzyme (2 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) 223,77 163,77 202,62 319,36 115,31 176,34 238,87 306,40 114,60 600,73 396,72 477,32 554,58 440,39 318,98 396,92 494,17 276,02 364,60 235,09 307,13 163,86 238,16 39 4.1.4 Kết khả kháng oxy hóa phương pháp H2O2 Bảng 4.6: kết khả kháng oxy hóa phương pháp H2O2 STT Enzyme thời gian thuỷ phân TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 TN10 TN11 TN12 TN13 TN14 TN15 TN16 TN17 TN18 TN19 TN20 TN21 TN22 TN23 TN24 TN25 TN26 TN27 Alcalase (4 giờ) Flavourzyme (4 giờ) Neutrase (4 giờ) Pepsin (4 giờ) Protamex (4 giờ) α-Amylase (4 giờ) Cellulase (4 giờ) Không enzyme (-) (4 giờ) Protamex (4giờ) + Flavourzyme (2 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) α-Amylase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) Pepsin (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Neutrase (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) Cellulase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Alcalase (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Flavourzyme (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Protamex (4 giờ) Neutrase (3 giờ) + Pepsin (4 giờ) IC50 (μg/mL) 577,00 419,48 384,42 1534,72 501,43 553,73 687,40 1011,75 275,88 2215,43 1558,44 1875,06 1658,23 1729,96 2250,83 1308,61 2022,54 1084,29 1105,75 1851,56 1787,66 1273,36 908,63 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 Chen, D., et al., Effects of Gekko sulfated polysaccharide–protein complex on human hepatoma SMMC-7721 cells: inhibition of proliferation and migration Journal of ethnopharmacology, 2010 127(3): p 702-708 Ge, G.-f., et al., Antitumor effects and chemical compositions of Eupolyphaga sinensis Walker ethanol extract Journal of ethnopharmacology, 2012 141(1): p 178-182 Gilbey, A and J.D Perezgonzalez, Health benefits of deer and elk velvet antler supplements: a systematic review of randomised controlled studies NZ Med J, 2012 125(1367): p 80-86 Kawtikwar, P.S., D.A Bhagwat, and D.M Sakarkar, Deer antlers-traditional use and future perspectives 2010 Campbell, A Implementation of the velvet harvesting code of conduct in Proceedings of a Deer Course for Veterinarians 1993 Deer Branch of the New Zealand Veterinary Association Wellington Neužil, J., S.R Thomas, and R Stocker, Requirement for, promotion, or inhibition by α-tocopherol of radical-induced initiation of plasma lipoprotein lipid peroxidation Free Radical Biology and Medicine, 1997 22(1-2): p 57-71 Sui, Z., et al., Bioactive components of velvet antlers and their pharmacological properties Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014 87: p 229240 Held, P., An introduction to reactive oxygen species: measurement of ros in cells BioTek Instruments 2010, Inc Young, I and J Woodside, Antioxidants in health and disease Journal of clinical pathology, 2001 54(3): p 176-186 Lobo, V., et al., Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health Pharmacognosy reviews, 2010 4(8): p 118 Liu, T., et al., The isoprostanes: novel prostaglandin-like products of the free radicalcatalyzed peroxidation of arachidonic acid Journal of biomedical science, 1999 6(4): p 226-235 Pala, F.S and K Tabakỗolu, Free radicals: Our enemies or friends? Advances in Molecular Biology, 2007 1(2) Halliwell, B., Free radicals and antioxidants: a personal view Nutrition reviews, 1994 52(8): p 253-265 Esterbauer, H., et al., Effect of antioxidants on oxidative modification of LDL Annals of medicine, 1991 23(5): p 573-581 Ames, B.N., et al., Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant-and radical-caused aging and cancer: a hypothesis Proceedings of the National Academy of Sciences, 1981 78(11): p 6858-6862 41 16 17 18 19 20 Lambert, J.D and R.J Elias, The antioxidant and pro-oxidant activities of green tea polyphenols: a role in cancer prevention Archives of biochemistry and biophysics, 2010 501(1): p 65-72 Sajdel-Sulkowska, E., et al., Oxidative stress in autism: elevated cerebellar 3nitrotyrosine levels Am J Biochem Biotechnol, 2008 4(2): p 73-84 Halliwell, B How to characterize an antioxidant: an update in Biochem soc symp 1995 Huang, D., B Ou, and R.L Prior, The chemistry behind antioxidant capacity assays Journal of agricultural and food chemistry, 2005 53(6): p 1841-1856 Tripathi, Y.B., et al., Bacopa monniera Linn as an antioxidant: mechanism of action Indian Journal of Experimental Biology, 1996 34(6): p 523-526 ... THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN/ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC PROTEIN THỦY PHÂN BẰNG ENZYME TỪ NHUNG HƯƠU Người hướng dẫn: Ths NGUYỄN THỊ HỒNG NƠ Người thực... enzyme, thuỷ phân protein từ nhung hươu enzyme Thủy phân nhung hươu hệ enzyme đơn kết hợp hai enzyme Xác định khả thủy phân Xác định khả kháng oxy hoá đoạn peptide thuỷ phân phương pháp khác Xác... “Hoạt tính chống oxy hóa dịch thủy phân protein nhung hươu (Cervus elaphus) khác trọng lượng phân tử enzyme thuỷ phân. ” Kết cho thấy dịch thủy phân 13 nhung hươu enzyme mô thuỷ phân đường tiêu