khảo sát hoạt tính kháng các loài nấm gây hại trong nuôi trông nấm rơm, kháng khuẩn của dịch chiết cây cỏ lào (chromolaena odorata)

Nhưng trong quá trình nuôi trồngthì xuất hiện một số loài nấm gây hại làm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượngcủa nấm đặt ra một vấn đề lớn là làm sao có thể tiêu diệt các loài nấm gây

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việc sử dụng thực vật và các sản phẩm thực vật cho mục đích y học là mộtthói quen lâu đời và đang trở nên nổi bật trên toàn cầu Mặc dù hiện tại một số chếphẩm và công thức dược phẩm có sẵn để chăm sóc và chữa trị vết thương, nhưngvẫn cần tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả, vì một số công thức hiện tạigây ra tác dụng phụ hoặc thiếu hiệu quả Các hợp chất từ nhiều loại thực vật chothấy chúng có tác dụng tích cực đối với các giai đoạn khác nhau của quá trình chữalành vết thương thông qua các cơ chế khác nhau Một số loại thuốc thảo dược đãcho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc chữa trị vết thương và các hợp chất tự nhiên khácnhau đã xác minh tiềm năng chữa lành các vết thương do đó có thể được coi là

thuốc tiềm năng có nguồn gốc tự nhiên Chromolaena odorata (L.) R.M King và H.

Robinson được coi là một loại cỏ dại nhiệt đới Tuy nhiên, nó được dùng để điều trịvết thương, bỏng và nhiễm trùng da Hơn nữa, nó cũng đã được chứng minh là cótính chất chống ung thư, chống đái tháo đường, chống độc gan, chống viêm, kháng

khuẩn và chống oxy Ở một số nơi trên thế giới Chromolaena odorata như một loại

thuốc truyền thống được sử dụng để điều trị các bệnh khác nhau

Bên cạnh đó nước ta là một nước nông nghiệp trong đó ngành trồng nấm chiếm mộtphần không nhỏ đặc biệt là nuôi trồng nấm rơm Nhưng trong quá trình nuôi trồngthì xuất hiện một số loài nấm gây hại làm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượngcủa nấm đặt ra một vấn đề lớn là làm sao có thể tiêu diệt các loài nấm gây hại màkhông ảnh hưởng và gây hại đến nấm rơm Trong cây cỏ lào có những chất có hoạttính kháng nấm nên chúng ta có thể ứng dụng thử vào việc kháng các loài nấm gâyhại trong nuôi trồng nấm rơm

Để hiểu rõ hơn một phần nào đó về tính kháng khuẩn và kháng nấm của loài câynày em xin thực hiện đề tài khảo sát hoạt tính kháng các loài nấm gây hại trong nuôi

trông nấm rơm, kháng khuẩn của dịch chiết cây cỏ lào (Chromolaena odorata).

1.2 Mục tiêu đề tài

Mục tiêu của đề tài là phân lập một số loài nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm

và dùng dịch chiết của cây cỏ lào(Chromolaena odorata) khảo sát tính kháng khuẩn, kháng nấm gây hại Ngoài ra còn khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá

trình tách chiết dịch và một số thành phần có trong cây cỏ lào

1.3 Yêu cầu

- Phân lập một số loài nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách dịch chiết từ cây cỏ lào

- Khảo sát sự đối kháng của nấm rơm với một số loài nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm

- Khảo sát khả năng kháng một số loại nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm của dịch chiết cây cỏ lào

- Khảo sát khả năng kháng một số loài vi khuẩn của dịch chiết cây cỏ lào

Tên khoa học: Chromolaena odorata(L.) RM King & H Rob

Tên thường gọi: Cỏ Nhật, Cỏ Việt Minh, Cây Cộng sản, cây phân xanh, cây bớpbớp

Hình 2.1 Cây cỏ lào (Chromolaena odorata)

(Nguồn: www.vietnammoi.vn)

Lá mềm mỏng hình tam giác đến hình trứng, đầu lá nhọn, mọc đối xứng mép lá córăng cưa, lá non thường chưa hình thành dạng răng cưa, trên bề mặt lá có lôngnhung Trên lá có ba gân chính Phiến lá dài từ 5 – 12 cm, rộng 3 -6 cm

Hoa hình ống mọc thành từng cụm từ 20 – 60 hoa một chùm, hoa có màu hồng nhạthoặc trắng, tràng hoa có màu xanh nhạt, nhị hoa mọc dài vươn ra khỏi tràng hoa.Hạt màu nâu xám đến đen nhỏ năm cạnh và có lông

2.1.4 Công dụng của cây cỏ lào [14], [15]

Trong cây cỏ lào chứa 2,65% đạm; 0,5% photpho và 2,48% kali, coumarine,alkaloit, anthraquinone, glucoxide, saponin nhưng chủ yếu là tinh dầu và flavonoidToàn bộ cây từ rễ, thân, lá, hoa đều được sử dụng nhưng chủ yếu là lá

Cây cỏ lào có chứa các chất kháng sinh, với tác dụng chống viêm và kháng khuẩn,làm ức chế vi khuẩn gây mủ trên vết thương hở và đặc biệt có khả năng cầm máunhanh

Chữa lỵ trực trùng và ỉa chảy: dùng 12 g cỏ lào sắc lấy nước, pha thêm đường, chia

3 lần uống trong ngày

Chữa vết thương mắt do xước hoặc loét giác mạc: ngọn cỏ lào và lá non 50 g rửathật sạch, giã nát trong cối chày sạch Dùng 2 miếng gạc sạch chia thuốc gói thành 2gói Đặt vào bát sạch, cho vào nồi áp suất hấp (15 phút kể từ lúc thấy xì hơi) Nếu

không có nồi áp suất có thể hấp cách thuỷ 30 phút (kể từ lúc nước sôi đến lúc ngừngđun) Mắt nạn nhân rửa sạch bằng nước muối 2% đun sôi để nguội, đắp gói thuốcrồi băng lại để nạn nhân nằm ngửa 12 giờ thay thuốc một lần Nếu bệnh nhẹ thì 24giờ là khỏi.

Phòng đỉa cắn: hái các bộ phận của cây cỏ lào giã vắt lấy nước bôi lên chân trước mỗi lần xuống nước Chữa máu chảy không ngừng do bị đỉa, vắt cắn: lấy lá cỏ lào vò nát đắp vào vết bị cắn

Chữa viêm dạ dày: kết hợp các loại lá với tỷ lệ như sau: lá khôi 30 g, cỏ lào 20 g, dạcẩm 20 g, tam thất nam 5 g sắc nước uống hàng ngày Cách dùng trên là kinhnghiệm quý báu của đồng bào các dân tộc vùng cao Tây Bắc

Chữa viêm đại tràng: cỏ lào khô 20 g, khổ sâm 10 g, bạch truật 25 g sắc nước uốngdùng hàng ngày

Hỗ trợ điều trị các vết thương phần mềm, bầm tím do tai nạn: lấy lá cỏ lào vò nátđắp vào vết thương mỗi ngày một lần trong 3 – 4 ngày giúp giảm đau, chống sưng,giúp vết thương nhanh lành rất tốt và hạn chế viêm nhiễm

Hỗ trợ điều trị bong gân : lá cỏ lào rửa sạch rồi giã nát, bó vào chỗ bị bong gân.Chữa đau nhức xương: dùng cỏ lào 8 g tươi, dây đau xương 12 g, sao vàng, sắcnước uống trong ngày

Ngoài công dụng chữa bệnh cỏ lào còn được sử dụng dùng làm phân xanh có tácdụng diệt cỏ và làm giảm tuyến trùng ở trong đất hoặc bỏ lá đã vò nát xuống ruộng1-2 ngày để trừ ấu trùng ký sinh trùng (thể xoắn ốc có móc câu ở đầu) phòng khixuống ruộng khỏi bị lây

2.1.5 Các nghiên cứu liên quan đến cây cỏ lào

2.1.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Năm 2001, Nguyễn Kim Phi Phụng và Nguyễn Ngọc Sương (Đại học Quốc GiaThành Phố Hồ Chí Minh) đã nghiên cứu về cách tách chiết và cô lập các hợp chấthữu cơ từ cây cỏ lào đã xác định được các hợp chất: ceryl alcohol, β-amyrine, β-sitosterol, odoratin,

Năm 2004, Lê Văn Hạc, Nguyễn Thị Thanh Hoài, Nguyễn Xuân Dũng đã nghiêncứu về thành phần hóa học của tinh dầu của cây cỏ lào ở Nghệ An và Hà Tĩnh đãphát hiện được 60 chất trong đó đã định danh được khoảng 37 chất như: gecmacren,β-caryophyllene, geijerence,

Năm 2005, Nguyễn Đức Cường, Nguyễn Minh Chính đã đánh giá độ ổn định vàxây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc mỡ Eupolin từ cao lá cỏ lào kết quả đã điềuchế được thuốc mỡ

Năm 2006, Ngô Quốc Luân , Lâm Thanh Phong và Nguyễn Ngọc Hạnh đã thựchiện nghiên cứu một số kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu và

flavonoid trong cây cỏ lào cho kết quả cao chiết có khả năng kháng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Fusarium oxyporum, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.

Năm 2010, Đào Thị Vân Trang, Đào Hùng Cường đã khảo sát điều kiện thích hợp

để chiết flavonoid từ cây cỏ lào với tỉ lệ nước với ethanol là 1:1, tỉ lệ nguyên liệuvới dung môi là 1:25, ở 850C trong 3 giờ

2.1.5.2 Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 2000, Taiwo Oludare B và các cộng sự đã công bố hoạt tính kháng viêm, hạsốt và chống co thắt cơ trơn của cao chiết MeOH của lá cỏ lào trên loài chuột vớiliều lượng 50 – 200 mg/kg thì có hiệu quả

Năm 2001, Bouda H và các cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng tinh dầu từ lá cỏ lào,

cỏ cứt lợn, cây trâm trên tỷ lệ chết của mọt thóc Kết quả tinh dầu của cây cỏ làolàm chết mọt thóc với tỷ lệ 6,78%

Năm 2002, Zhang Maoxin đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính khángnấm và côn trùng của tinh dầu cỏ lào Kết quả tinh dầu cỏ lào kháng một số loài:

Pyricularia grisea, Phytophthora nicotianae, Fusarium axysporum.

Năm 2004, Apichart Suksamrarn và các cộng sự đã công bố công trình nghiên cứuhoạt tính kháng khuẩn gây bệnh lao phổi và độc tính tế bào của các hợp chấtflavonoid từ hoa cỏ lào

Năm 2005, Owoyele V.B., Adediji J.O và Soladoyele A.O đã khảo sát hoạt tínhkháng viêm của cao chiết cỏ lào trên chuột Cho thấy với liều lượng 200mg/kg thì

Loài: Coprinus ephemeroides

Mũ nấm nhỏ, khi non hình gần cầu, khi già mũ nấm bung dù trải phẳng và cuốicùng cuộn vào phía trong mũ nấm Đỉnh mũ nấm màu nâu vàng, xung quanh phủdày đặc hạt màu trắng và các hạt này sẽ chuyển sang màu nâu nhạt khi nấm già.Giai đoạn đầu mũ nấm có màu trắng, sau đó chuyển sang màu nâu nhạt và cuốicùng màu đen Kích thước mũ nấm 0,4 – 0,6cm đường kính Hệ sợi phiến nấm cóthành tương đối dày, trong suốt, không có vách ngăn ngang Đường kính 3,0 –3,3µm

Hình 2.2 Nấm Coprinus ephemeroides

Cuống nấm màu trắng đục, dễ nát, rỗng giữa, có lông màu trắng rất mịn, cao 2,8 –3,0 cm Có vòng nấm tại vị trí giữa cuống nấm Hệ sợi cuống nấm có thành mỏng,

có vách ngăn ngang Đường kính 6,6 – 9,9 µm Phiến nấm tự do, khi non màu trắng,khi già lại có màu đen và tạo thành những đường dọc màu đen dưới mặt mũ nấm

Hệ sợi phiến nấm có thành tương đối dày,không có vách ngăn ngang Đường kính3,0 – 3,3 µm Bào tử đa số hình cầu, ít khi dạng elip, màng dày, màu nâu tối

Loài: Lentinus squarrosulus

Lentinus squarrosulus là một loài nấm ăn được thuộc nhóm nấm hoại sinh thối

trắng thường được tìm thấy ở vùng có khí hậu nhiệt đới Sợi nấm phát triển tốt nhấttrên gelatin sucrose khoai tây với độ pH 6,5 − 7,0 được nuôi cấy trong điều kiệnsáng và tối xen kẽ ở khoảng 31 – 320C Loài này có một số đặc điểm như tăngtrưởng sợi nấm nhanh chóng, và do đó có tiềm năng được sử dụng làm thực phẩm,

thực phẩm chức năng và dược phẩm Theo các Nghiên cứu cho thấy Lentinus squarrosulus chứa các hợp chất chống oxy hóa mạnh Trong nấm chứa hàm lượng

protein cao (57,6%) và tổng chất béo thấp (0,5%) và cũng giàu magiê (0,4%), kali(3,8%) và vitamin B3 (0,2%)

Hình 2.3 Nấm Lentinus squarrosulus

Loài: Paecilomyces formosus

Paecilomyces formosus là một loài nấm kí sinh cơ hội và hiện diện phổ biến trong

tự nhiên cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới Các loài Paecilomyces dễ dàng được tìm

thấy ở đất tơi xốp, xác bã hữu cơ, thức ăn, tàn dư thực vật và trong các sản phẩmthực phẩm Loài này thường kí sinh trên các loài côn trùng Ban đầu tơ nấm màutrắng xong dần chuyển sang màu vàng nâu

2.2.4 Vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans [3], [20]

Streptococcus mutans là một giống của các cầu khuẩn Gram dương Trái ngược với

sự phân chia của tụ cầu theo nhiều hướng khác nhau và tạo ra hình thể như chùmnho của tế bào đường kính khoảng 0,6 - 0,8 μm, xếp liên tiếp với nhau thành từngchuỗi, dài ngắn khác nhau và có thể đứng với nhau thành từng đôi hoặc từng đám.Liên cầu, không có lông, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram (+)

2.2.2.2 Đặc tính sinh hóa

Liên cầu, hiếu khí, kỵ khí tùy tiện và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiềuchất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường Vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điềukiện khí trường có thêm 5 - 10% CO2 Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C, một sốphát triển được ở 10 - 400C như liên cầu đường ruột

Không có enzym catalase, không bị ly giải bởi muối mật, chuyển hóa nhanh đườngthành acid lactic và các acid hữu cơ khác

2.2.2.3 Độc tố

2.2.2.4 Khả năng gây bệnh

Streptococcus mutans được xem là tác nhân chính gây ra sâu răng Vi khuẩn này lên

men carbohydrate tạo ra acid, làm pH giảm xuống < 5, sự giảm pH liên tục có thể

đưa đến sự khử khoáng trên bề mặt răng, làm mất vôi ở các mô cứng của răng, khởi

phát quá trình sâu răng

Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu

khí, chúng có thể sống ở nhiệt độ từ 5 – 460C và pH từ 3,7 – 9,5 nhưng phát triển tốt

nhất ở 370C và pH từ 6,8 – 7,2.Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh

dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch

BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ

Hầu hết các loài Salmonella có thể sinh hydro sulfua nhưng không lên men lactose

(trừ Salmonella arizona) và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol và

Hình 2.6 Vi khuẩn Salmonela typhi

(nguồn: http://khoahoc.tv/s/vi+khuẩn+Salmonella)

glucose Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một số hóa chất: Brilliant green,sodium lauryl sulfate, selenite,

2.2.1.3 Sức đề kháng

Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 500C trong 1 giờ, 700C trong 15 phút, 1000C trong

5 phút Chúng có thể sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -100C trong 115ngày, sống từ 4 – 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6 – 120C

Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng Salmonella tồn tại

khoảng 2 – 3 tháng, trong nước tự nhiên chúng có thể sống 1 – 2 tháng Ánh sángmặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn trong nước trong sau 5 giờ, trong nước đụcsau 9 giờ Salmonella bị diệt bởi clorua thủy ngân 1%, formol 0,5%, acid fenic 3%trong 15 – 20 phút

2.2.1.4 Độc tố

Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố.

Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố

ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật Nội độc tố thường là lipopolysaccharide(LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Trước khi thể hiệnđộc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc cácreceptor bề mặt các tế bào như: Tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách.Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao và chỉ hình thành trong

điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí Ngoại độc tố chủ yếu tác động vào thần kinh và

ruột

2.2.1.5 Khả năng gây bệnh

Khi xâm nhập vào cơ thể bằng đường miệng đến niêm mạc ruột rồi đến hạchlympho và phát triển ở đó thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 - 48 giờ Sau khi tăngsinh, một số tự ly giải, phóng thích nội độc tố, số khác theo hệ lympho vào máu gâynhiễm trùng máu Triệu chứng ban đầu là sốt kèm theo lạnh run, sốt tăng dần kéo

dài trong 2 tuần Tình trạng này làm bệnh nhân suy nhược, biếng ăn, mệt mỏi, ganlách to, xuất huyết ngoài da, lượng bạch cầu giảm Sau 3 tuần bệnh sẽ giảm Trướckhi có kháng sinh biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và lủng ruột, tử vong

10 – 15% Các biến chứng khác là viêm màng não, viêm tủy xương

2.3 Cơ chế đối kháng của các loại nấm

Cơ chế kháng của các loại nấm được chia làm ba loại: tiết kháng sinh làm chết loạinấm cạnh tranh, cạnh tranh chất dinh dưỡng, kí sinh

• Tiết kháng sinh: chúng tiết ra một số chất có hoạt tính tương tự như chấtkháng sinh làm chết loại nấm đối kháng với nó Sau khi giết chết loài nấmđối kháng chúng có thể tiếp tục tiết ra một số chất để chuyển hóa chất dinhdưỡng từ xác loài nấm đối kháng Mỗi loại kháng sinh chỉ tác động vào mộtloài nhất định

• Cạnh tranh chất dinh dưỡng: các loài nấm khi phát triển trong cùng một môitrường sống, sử dụng chung một nguồn dinh sẽ cạnh tranh về mặt dinhdưỡng và không gian sống với nhau Trong các loài cạnh tranh với nhauthường sẽ có một loài phát triển mạnh hơn và lấn át các loài còn lại làm hạnchế hoặc làm cho loài còn lại không thể phát triển và tiêu diệt luôn loài cònlại Trong mối quan hệ cạnh tranh này các loài đều bị ảnh hưởng bất lợi

• Kí sinh: Một số loài có khả năng xâm nhập và kí sinh trên một loài khác đểhút chất dinh dưỡng hoặc nhờ vào loài nấm khác để tổng hợp và hấp thu chấtdinh dưỡng hoặc kí sinh và giết chết loài nấm khác để chúng có thể sinhsinh trưởng tốt hơn Loài nấm kí sinh tiết ra tác nhân kích thích hóa học hấpdẫn nấm đối kháng sau đó nhận dạng đăc hiệu và xâm nhập vào loài nấm đốikháng sau đó tơ nấm sẽ quấn quanh và tiết ra chất làm chết nấm đối kháng

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Thời gian và địa diểm nghiên cứu

Thời gian: 10/2018 – 2/2019

Địa điểm thực hiện nghiên cứu: Phòng thí nghiệm chuyên đề 3 trường Đại học TônĐức Thắng

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Lá của cây cỏ lào (Chromolaena odorata) ở Tỉnh Bình Phước được thu hái vào

Thiết bị: Bể điều nhiệt, nồi hấp, tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, bếp điện từ, microwave

Dụng cụ: micropipet, pipet, becher, erlen, ống nghiệm, đĩa petri, giấy lọc, đầu tip,đũa thủy tinh, bóp cao su, bông không thấm

3.2.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn và nấm

3.2.2.1 Tryptone casein soy agar (TSA)

Thành phần trong 1 L môi trường:

- Tryptone : 15 g

- Papaic digest of soybean meal: 5 g

- Sodium chloride: 5 g

- Bacteriological agar: 15 g

- pH của môi trường hoàn chỉnh ở 25 °C : 7,3 ± 0,2

3.2.2.2 Môi trường Potato Glucose Agar (PGA)

Thành Phần Trong 1 L môi trường:

- Khoai tây: 200 g

- Glucose: 20 g

- Agar: 20 g

Cách pha: khoai tây thái nhỏ 1×2×1 cm bổ sung thêm nước đun sôi 30 phút lấy dịch chiết Bổ sung glucose, agar đun lên hòa tan hết đường và agar sau đó định mức bằng nước cất đến 1000 mL Đem đi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong vòng 30

phút

pH khoảng 5,5 - 6 3.2.2.3 Môi trường Brain heart Infusion (BHI) Thành Phần Trong 1 L môi trường:

- Brain heart infusion solids: 3,5 g

- Pancreatic digest of casein: 10 g

- Dextrose: 2 g

- Special peptone mixture: 12 g

- Yeast extract: 2 g

- Sodium chloride: 5 g

- pH khoảng 7,3

Bổ sung thêm 20 g agar/Lit để làm môi trường rắn

3.3 Phương pháp thí nghiệm

3.3.1 Chuẩn bị mẫu

Lá cây cỏ lào sau khi thu hái được loại bỏ lá hư, vàng và được rửa sạch sau đó đem sấy ở nhiệt độ 500C đến khi độ ẩm của lá còn 11% Lá sau khi sấy được đem đi xay nhỏ (tăng hiệu suất tách chiết)

3.3.2 Sơ đồ quy trình tách dịch chiết

Dịch chiết

3.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol có trong dịch chiết

• Chỉ tiêu theo dõi:

Hiệu quả của quá trình tách dịch chiết được thể hiện qua tổng hàm lượngpolyphenol

Cách xác định tổng hàm lượng polyphenol:

Công thức: PP =

PP: Tổng hàm lượng polyphenol (mgGAE/gdw)

X: Nồng độ acid gallic theo đường chuẩn (mg/mL)

V: Thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu (mL)

K: hệ số pha loãng

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách dịch chiết

m: Khối lượng mẫu dùng để chiết dịch

W: độ ẩm mẫu

V: Thể tích dịch chiết dùng (mL)

Khảo sát các yếu tố: Loại dung môi, tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi, thời giantách chiết, nhiệt độ thích hợp

Chuẩn bị: Cân chính xác 1g mẫu cho mỗi nghiệm thức

• Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi

Mục đích: Xác định dung môi tối ưu để tách dịch chiết

Thực hiện: Khảo sát trên hai loại dung môi nước và Ethanol (90%) Các yếu tố cònlại được cố định Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:10, thời gian 30 phút, ở 500C.Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng hàm lượng polyphenol

• Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu và dung môi.

Mục đích: Xác định tỷ lệ tối ưu để tách dịch chiết

Thực hiện: Sau khi xác định được dung môi thích hợp, ta sử dụng dung môi đó chothí nghiệm này và tiếp tục cố định yếu tố nhiệt độ ở 500C, thời gian chiết là 30 phútchỉ thay đổi tỷ lệ nguyên liệu và dung môi chiết lần lượt là 1:10, 1:15, 1:20 Mỗinghiệm thức được lặp lại ba lần

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng hàm lượng polyphenol

• Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian.

Mục đích: Xác định thời gian tối ưu để tách dịch chiết

Thực hiện: Sau khi xác định được dung môi và tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môithích hợp ta sử dụng các yếu tố đó cho thí nghiệm này và tiếp tục cố định yếu tố

nhiệt độ ở 500C chỉ thay đổi thời gian chiết là 30 phút, 45 phút, 60 phút Mỗinghiệm thức được lặp lại ba lần.

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng hàm lượng polyphenol

• Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.

Mục đích: Xác định nhiệt độ tối ưu để tách chiết

Thực hiện: Sau khi xác định được dung môi, tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi,thời gian thích hợp ta sử dụng các yếu tố đó cho thí nghiệm này và chỉ thay đổinhiệt độ chiết là 500C, 600C, 700C Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng hàm lượng polyphenol

3.3.4 Định tính sơ bộ một số hợp chất trong cây cỏ lào [6]

3.3.4.1 Flavonoid

Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cộng với vài giọt FeCl3 5% Xuất hiện kết tủalục, xanh đen hoặc nâu là có sự hiện diện của flavonoid

3.3.4.2 Steroid vàTerpenoid

Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết cộng thêm 1 mL chloroform sau đó cho thêm

1 mL H2SO4đđ xuất hiện màu đỏ đậm, xanh tím là có sự hiện diện của steroid vàterpenoid

3.3.5 Phân lập nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm

Thu nhận các mẫu nấm từ một cơ sở trồng nấm rơm ở Huyện Bình Chánh

3.3.5.1 Nấm có quả thể

Quả thể sau khi thu nhận được cắt loại bỏ phần thừa và phần bề mặt được làm sạchbằng cách lấy bông gòn thấm cồn 700 lau bề mặt ngoài của nấm

Chuẩn bị môi trường PGA trước đó, lưỡi dao, đèn cồn, cồn khử trùng và cồn 960

Ta thực hiện phân lập nấm trong tủ cấy

Phương pháp thực hiện:

Lau sạch tủ cấy hoặc nơi sẽ thực hiện phân lập, đốt đèn cồn ta tiến hành tách đôiquả thể nấm dùng dao cấy đã được đốt khử trùng bằng cồn 960 để nguội tách lấyphần thịt nấm ở giữa để mẫu tránh bị nhiễm Đặt phần thịt nấm vừa mới được lấy rakhỏi quả thể nấm đặt vào môi trường PGA trong đĩa petri đã được chuẩn bị trước

đã chuẩn bị trước đó và tiến hành cấy trang Để ở nhiệt độ phòng 3-4 ngày

Sau khi nấm mọc lên ta cấy chuyền sang môi trường PGA mới và tiếp tục cấychuyền đến khi tạo được giống thuần

3.3.5.3 Phương pháp định danh

Sau khi phân lập tạo dược các giống nấm thuần Các giống nấm được đem đi địnhdanh tại công ty TNHH Thương mại và Dịch vụ Nam Khoa, 793/58 Trần XuânSoạn, phường Tân Hưng, Quận 7, Tp.HCM Kết quả định danh này dựa trênphương pháp giải trình tự vùng ITS bằng kỹ thuật PCR, sau đó đem đi so sánh với

cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST để phân loại từng chủng nấm

3.3.6 Khảo sát khả năng kháng nấm rơm của các loại nấm gây hại

Phương pháp thực hiện:

Trên cùng một đĩa môi trường PGA một bên ta đục lỗ hút 100 µL dịch nấm rơm cónồng độ 108 CFU/mL cho vào lỗ, một bên là 100 µL dịch của các loài nấm gây hạicũng có nồng độ 108 CFU/mL rồi đem đi ủ ở 300C cho tơ nấm phát triển Xem kếtquả sau 4 – 5 ngày

Mẫu đối chứng ta chỉ cấy tơ nấm rơm và cũng đem ủ ở 300C

3.3.7 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây cỏ lào

Chuẩn bị:

Môi trường: Pha môi trường TSA và PGA hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau

đó đổ đĩa, để nguội ở nhiệt độ phòng, mỗi đĩa khoảng 15 ml

Đĩa giấy lọc: Cắt giấy lọc thành các đường tròn có đường kính 6 mm, đem hấp khửtrùng ở 121oC trong 15 phút

Dịch khuẩn: Dùng que cấy vòng lấy một lượng sinh khối vi khuẩn được nuôi cấytrên môi trường phân lập hòa vào 5 ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng ở

121oC, lắc đều rồi đem so độ đục với ống Mc.Farland (có độ đục tương đương 108

CFU/ml) Nếu chưa đạt độ đục ta tiếp tục pha loãng đến khi ống nghiệm chứa dịchkhuẩn có độ đục cùng với ống Mc.Farland

Phương pháp thực hiện:

Cấy vi khuẩn lên môi trường: Dùng micropippet hút 0,1 ml dịch vi khuẩn bơm vàođĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn Dùng que cấy trang, trang đều vi khuẩn trên mặtthạch, tiếp tục cho đến khi mặt thạch khô

Dùng kẹp vô trùng gấp các đĩa giấy đã thấm dịch chiết, đặt cố định lên trên bề mặtthạch, sau đó úp ngược đĩa đem ủ ở 37oC, ghi nhận kết quả sau 24 giờ

Đối chứng âm là đĩa giấy thấm nước cất

Lưu ý:

- Không đặt các đĩa kháng sinh quá sát nhau và phải cách thành đĩa petri 1 cm

- Đối chứng âm là mẫu nước cất

Quan sát và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn để xác định tính nhạy cảm củachất thử, nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của dịch chiết Mức độ kháng khuẩnđược đánh giá theo T.Johnson và cộng sự (1995) như sau: