Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng (raphanus sativus l) đồ án tốt nghiệp

Một số nghiên cứu khoa học công bố gần đây ở nước ngoài cho thấy dịch chiết từ củ cải trắng trồng ở 1 số nước khác nhau có khả năng khử các gốc tự do, làm giảm các quá trình oxi hóa, vốn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN

B A R IA V U N G T A U

UNIVERSITYCAP S a i n t i a c q u e s

Ngành

: Th.s Phạm Thị Kim Ngọc : Bùi Thị Hồng Loan

: DH13TP : Công Nghệ Thực Phẩm

Vũng Tàu, 06/2017

Trình Độ Đào Tạo : Đại Học

Hệ Đào Tạo: Đại học chính quy

1 Tên đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng

(Raphanus sativus L.)

2 Ngày giao nhiệm vụ: 06/02/2016

3 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 10/06/2017

4 Họ và tên người hướng dẫn: Th.S Phạm Thị Kim Ngọc

VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và Tên: Bùi Thị Hồng Loan

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

MSSV: 13030375Lớp: DH13TP

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

(Ký và ghi rõ họ tên)

Bà Rịa-Vũng Tàu, ngày 26 tháng 6 năm 2017

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Tôi cam đoan rằng tất cả những kết quả nghiên cứu được nêu trong đồ án này là

do tôi thực hiện, các ý tưởng tham khảo và những kết quả trích dẫn từ các công trình khác đều được nêu rõ trong đồ án

Vũng Tàu, năm 2017 Sinh viên thực hiện

Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học cho đến nay,

em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu, gia đình và bạn bè

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu, quý thầy cô trong ngành Công nghệ Thực phẩm - những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những hành trang vô cùng quý giá để em có thể bước vào sự nghiệp trong tương lai Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Phạm Thị Kim Ngọc Cảm ơn cô đã tận tình quan tâm, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án, đã giải đáp những thắc mắc trong quá trình nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện đồ án này vì kiến thức thực tế em còn hạn chế và thời gian thực hiện không nhiều nên sẽ không tránh khỏi sai sót Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến và nhận xét của quý thầy cô, các bạn để em có thể rút kinh nghiệm và hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC I DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

BẢNG PHỤ LỤC vi

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về củ cải trắng 2

1.1.1 Đặc điểm của cây và củ cải trắng 2

1.1.2 Thành phần hóa học của củ cải trắng 3

1.1.2.1 Thành phần hóa học cơ bản 3

1.1.2.2 Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng 5

1.2.2.3 Tác dụng sinh học của củ cải trắng 6

1.2 Giới thiệu chung về khuẩn 8

1.2.1 Bacillus cereus 8

1.2.2 Pseudomonas aeruginosa 10

1.2.3 Salmonella typhi 11

1.2.4 Staphylococcus aureus 13

1.3 Giới thiệu chung về nấm mốc 14

1.3.1 Nấm mốc Aspergillus flavus 14

1.3.1.1 Phân loại [47] 14

1.3 L2 Đặc điểm của nấm Aspergillus flavus [43] 15

1.3.1.3 Hình thức sinh sản [43] 16

1.3.1.4 Một số bệnh lý do nấm mốc Aspergillus flavus gây ra [43] 16

1.3.2 Nấm mốc Fusarium solani [8 ] 17

1.3.2.1 Phân loại 17

1.3.2.2 Đặc điểm của nấm Fusarium solani [41] 17

1.3.2.3 Hình thức sinh sản 18

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 ĐHBRVT

1.3.2.4 Một số bệnh lý do nấm mốc F solani 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Phương tiện nghiên cứu 20

2.1.1 Thời gian và địa điểm 20

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.3 Phạm vi nghiên cứu 20

2.1.4 Hóa chất sử dụng 20

2.1.5 Thiết bị - Dụng cụ 20

2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứ u 21

2.2.1 Nội dung nghiên cứ u 21

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.2.1 Phương pháp định tính các thành phần trong cao chiết 21

2.2.2.2 Chuẩn bị giống 23

2.2.2.3 Chuẩn bị pha cao củ cải ở các nồng độ khác nhau 24

2.2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng 24

2.2.2.5 Xử lý số liệ u 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao củ cải trắng 27

3.2 Kết quả kháng khuẩn và nấm mốc của cao củ cải trắng 30

3.3.1 Kết quả kháng khuẩn 30

3.3.2 Kết quả kháng nấm m ốc 33

3.4 Bàn luận 35

KẾT LUẬN 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 45

MR: Methyl Red - Thử nghiệm Methyl Red

VP: Voges Proskauer - Thử nghiệm Voges Proskauer

MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton

MIC: Minimal Inhibitory Concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu

TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB

SDA: Sabouraud Dextrose Agar Môi trường dinh dương SDA

PDA: Potato Dextrose Agar Môi trường dinh dưỡng PDA

DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức năng và sinh sản của các sinh vật

và nhiều loài virus

RNA: Acid ribonucleic

rpm: tốc độ vòng/ phút

Am: thuốc kháng sinh Amipicillin

Ge: thuốc kháng sinh Gentamycin

Te: thuốc kháng sinh Tetracycline

Ter: thuốc kháng sinh Terbinafine

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong 100g củ cải trắng tư ơ i 4

Bảng 3.1 Kết quả định tính các hợp chất có trong mẫu cao củ cải trắng 27

Bảng 3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn của cao củ cải trắng (mm) 30

Bảng 3.3 Đường kính vòng kháng nấm của cao củ cải trắng (mm) 34

Hình 1.1 Cây và củ cải trắng 2

Hình 1.2 Hoa, lá và quả của cây cải c ủ 3

Hình 1.3 Vi khuẩn B cereus sau khi nhuộm Gram và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB 9

Hình 1.4 Vi khuẩn P aeruginosa khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB 11

Hình 1.5 Vi khuẩn S typhi khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch T SB 12

Hình 1.6 Vi khuẩn S aureus khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch T SB 14

Hình 1.7 Aspergillus fla vu s 15

Hình 1.8 Fusarium solani 17

Hình 1.9 Loài F solani: A-B: đại bào tử; C-D: tiểu bào tử; E-G: bào tử đính trên môi trường (Dương Minh,2010) 18

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 21

Hình 2.2 Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009) 25

Hình 3.1 Khả năng kháng B cereus của cao củ cải trắng 32

Hình 3.2 Khả năng kháng P aeruginosa của cao củ cải trắng 33

Hình 3.3 Khả năng kháng S aureus của cao củ cải trắng 33

Hình 3.4 Khả năng kháng S typhi của cao củ cải trắng 33

Hình 3.5 Khả năng kháng A flavus của cao củ cải trắng 34

Hình 3.6 Khả năng kháng F solani của cao củ cải trắng 34

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng từ 4 chủng vi khuẩn và nấm mốc khác nhau 35

BẢNG PHỤ LỤC

Phụ lục A Môi trường và kháng sinh 45

Phụ lục B Kết quả nhuộm Gram của 4 chủng vi khuẩn khảo sát 46

Phụ lục C Đếm bào tử nấm mốc trên kính hiển v i 46

Phụ lục D Cao thành phẩm 47

Phụ lục E Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Bacillus cereus 47

Phụ lục F Phụ lục F Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Pseudomonas aeruginosa 49

Phụ lục G Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Staphylcoccus aureus 51

Phụ lục H Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Salmonella Typhi 53

Phụ lục I Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng nấm mốc trên A flavus 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Củ cải trắng có tên khoa học là Raphanus sativus L., thuộc họ cải Brassicaceae,

là cây trồng hàng năm, dùng như một loại rau ăn củ ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới

Theo các tài liệu y học cổ truyền, củ cải trắng có vị ngọt hơi cay, đắng, tính bình, không độc, có tác dụng long đờm, trừ viêm được dùng trong chữa trị khá nhiều bệnh đường hô hấp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa Ở nước ta, củ cải trắng là một loại rau củ phổ biến, rẻ tiền, được trồng và sử dụng nhiều

Một số nghiên cứu khoa học công bố gần đây ở nước ngoài cho thấy dịch chiết từ

củ cải trắng trồng ở 1 số nước khác nhau có khả năng khử các gốc tự do, làm giảm các quá trình oxi hóa, vốn là nguyên nhân sâu xa gây ra nhiều loại bệnh tật ở người Hoạt tính kháng khuẩn của củ cải trắng cũng được đánh giá cao Nước ép và dịch trích ly từ

củ cải trắng bằng các dung môi khác nhau (nước, methanol, etahnol, ethyl acetate, este dầu hỏa) đã được xác định là có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn

và nấm mốc khác nhau Tuy nhiên, hoạt tính của dịch chiết phụ thuộc vào giống và đặc điểm nguồn gốc, điều kiện địa lý của vùng trồng

Đó là lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng (Raphanus sativus L.) Trong nghiên cứu này

của chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết thô của củ cải

trắng (Raphanus sativus L.) thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về củ cải trắng

1.1.1 Đặc điểm của cây và củ cải trắng

Củ cải trắng (white radish) là củ của cây cải củ, có tên khoa học là Raphanus

sativus L thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ

Brassicales, họ Brassicaceae, chi Raphanus, loài sativus [22]

Củ cải trắng là tên gọi phổ biến ở Việt Nam Ngoài ra , Raphanus sativus L.còn

có các tên gọi khác như Rettich (Đức), Daikon (Nhật), Hua piahs (Thái Lan), Lai fu (Trung Quốc), Lobak beurem (Indonesia), Mu (Hàn Quốc), Muli (Ấn Độ) [22]

Củ cải được thuần hóa ở Châu Âu trong thời kì tiền La Mã Những cư dân cổ đại của Hy Lạp cho rằng các loại củ cải có giá trị nhất trong tất cả các loại cây trồng lấy

củ Loại củ này được xem là một thực phẩm thông dụng ở Ai Cập trước khi các kim tự tháp được xây dựng và củ cải cũng rất phổ biến ở thời Ý cổ đại Chính Columbus và những người đầu tiên khai hoang Châu Âu đã đem củ cải vào trồng trọt [16]

Củ cải được sử dụng như một loại thực phẩm trong bữa ăn của người Ai Cập cổ vào khoảng 2700 - 2200 trước công nguyên, sau đó được trồng ở châu Âu vào thế kỉ

16 - 17 và châu Mỹ vào thế kỉ 20 Ở khu vực Đông Á, nhiều loại củ cải khác nhau đã được phát hiện trồng ở Trung Quốc khoảng 2450 năm trước và ở Nhật Bản khoảng

1300 năm trước [20]

Cây củ cải là một loại cây cho củ hàng năm hoặc hai năm một lần Loại cây này được trồng chủ yếu để lấy củ do rễ củ chứa nhiều chất dinh dưỡng Cây củ cải cao khoảng 30 - 120 cm, có loại bề mặt láng nhẵn nhưng cũng có loại bề mặt sần sùi hoặc

có loại có lông cứng, mọc thẳng đứng vàcuống lá phân thành nhánh Củ cải có nhiều thịt, phình ra, có nhiều màu sắc như trắng, hồng, đỏ hoặc đen Ngoài ra, hình dạng củ cải có thể thuôn dài hoặc có dạng hình cầu [21]

Hình 1.1 Cây và củ cải trắng

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Lá to có dạng hình đàn lia xẻ lá, có cuống, có lớp lông tơ mỏng láng bề mặt, rìa

lá có răng cưa Lá non thường không phân nhánh và có răng cưa [21]

Hoa của cây củ cải có màu hơi đỏ tía hay màu hồng tới gần trắng với gân hoa màu tím dài từ 1,5- 2 cm, đường gân nhỏ dần về phía cuống lá Bên trong hoa còn có chỉ nhị mảnh, bao phấn hình mũi tên nằm trong vòi nhụy và đầu nhụy Quả cải thuộc loại quả không nẻ, có dạng hình thoi phình to ở giữa và nhọn dần về hai đầu, khi bóp nhẹ quả cải sẽ thấy một đường nứt xuất hiện và bên trong đó là các hạt cải Một quả cải cho được từ 2 đến 4 hạt cải Hạt cải có dạng hình cầu hoặc hình trứng, kích thước hạt khoảng 2,5 - 4 mm [21]

Củ cải có thể trồng quanh năm nhưng để thu được củ cải chất lượng tốt thì thường trồng vào mùa xuân và đầu mùa thu Thời gian nuôi trồng của củ cải từ khoảng

50 đến 90 ngày, phụ thuộc vào từng loại khác nhau và chất lượng sản phẩm khi thu hoạch Để thu hoạch một loại củ cải nặng 500 g thì thời gian thu hoạch khoảng 50 đến

60 ngày vào mùa hè và khoảng 70 đến 80 ngày vào mùa đông Củ cải phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ khoảng 20 - 250C, pH đất trồng tối ưu từ 6,0 - 6,5 cũng như cần ánh sáng và nước với liều lượng thích hợp để tăng trưởng [22]

Hình 1.2 Hoa, lá và quả của cây cải củ

1.1.2 Thành phần hóa học của củ cải trắng

1.1.2.1 Thành phần hóa học cơ bản

Các thành phần hóa học cơ bản của 100 g củ cải trắng được nêu ở bảng 1.1 Trong củ cải trắng, ngoài thành phần nước chiếm tỉ lệ cao thì protein chiếm tới 1,5% khối lượng Củ cải có chứa nhiều acid amin thiết yếu như lysine, methionine, tryptophan, phenylalanine, threonine, valine,leucine, isoleucine, histidine, cũng như các acid béo như acid palmitic, acid oleic, acid linoleic, acid linolenic [40]

Củ cải trắng có hàm lượng lipid thấp Lipid trong củ cải giúp tạo vị ngon cho củ Trong củ cải, glucid chiếm hàm lượng cao Sucrose là một loại carbohydrate dự trữ

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 ĐHBRVT

quan trọng trong thực vật, đặc biệt trong các cơ quan lưu trữ như củ, rễ và hạt Kích thước củ cải càng lớn thì hàm lượng sucrose và glucose càng cao Glucid trong củ cải trắng bao gồm đường, tinh bột, pectin và xơ Đường trong củ cải trắng chủ yếu là glucose, một lượng nhỏ fructose, sucrose và pentosan Tinh bột thay đổi tùy theo giống, chiếm từ 0,2 - 0,5% Xơ chiếm một lượng khoảng 1,5 % gồm chủ yếu là cellulose và hemicellulose có trong phần vỏ, mô nâng đỡ và thành tế bào của củ cải trắng, đóng vai trò tạo cấu trúc, chống lại các va chạm cơ học Pectin chiếm khoảng 0,3%, chủ yếu tham gia vào cấu tạo của thành tế bào, tồn tại chủ yếu dưới dạng calcium pectate Ngoài ra, củ cải trắng còn nổi bật với hàm lượng lipid thấp, hàm lượng vitamin và khoáng cao Một số khoáng vi lượng cũng được tìm thấy trong củ cải trắng như nhôm, bari, liti, mangan, silic, titan, flo và iod với hàm lượng tổng lên đến

Ngoài ra còn có các acid hữu cơ có lợi cho sức khỏe như acid malic, acid oxalic, acid erythorbic có trong củ cải và acid erucic, acid linoleic, acid oleic có trong hạt củ cải Bên cạnh đó, trong củ cải còn có acid palmitic, acid stearic trong dịch trích ly ether dầu hỏa từ hạt củ cải, acid glutamic trong củ cải muối chua [12].

Ở củ cải có nhiều acid phenolic như acid caffeic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid hydroxycinnamic, acid p-hydroxybenzoic, acid vanillic, acid salicylic, acid gentisic, anthocyanin, pelargonidin, cyanidin Trong củ cải trắng có các hợp chất flavonoid như quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin và luteolin Ngoài ra, trong

củ cải còn có polysaccharides, proteoglycans, sắc tố, hợp chất có chứa lưu huỳnh,các chất kháng khuẩn (saphanin và sulphoraphene), ß-carotene Hàm lượng raphanusol A

và B trong củ cải trắng tăng khi có ánh sáng và giảm khi thiếu ánh sáng Raphanusol A

và raphanusol B là chất ức chế sự tăng tưởng của cây trồng để cây củ cải không bị úa vàng và hạt củ cải bị hư [12]

Ngành Công nghệ Thực phẩm

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Mùi hăng của củ cải được tìm thấy bởi hợp chất glucosinolate Ở củ cải tồn tại 4 loại glucosinolate là glucoraphenin, dehydroerucin, glucobrassicin và glucoerucin Glucosinolate trong củ cải giúp tăng lượng enzyme tham gia vào việc giải độc các chất gây ung thư Chất này có tiềm năng được sử dụng như một chất ngăn chặn sự lão hóa [21]

I.2.2.3 Tác dụng sinh học của củ cải trắng

Rosa M.P Gutierrez và Rosalinda L.Perez (2004) đã nghiên cứu về thành phần các hợp chất có mặt trong củ cải trắng gồm: alkaloid và các hợp chất có nitơ, coumarin, enzyme, glucosinolate, các acid hữu cơ, các hợp chất phenol Nghiên cứu cũng đã khẳng định nước ép từ củ cải trắng có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi

khuẩn G+, G" và nhiều loại nấm (E Coli, Pseudomonas pyocyaneus, Salmonella typhi,

Bacillus subtilis, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae và Fusarium

culmorum ) do sự tồn tại của các peptide giàu cystein Rs-AFP1 và Rs-AFP2, các

protein RAP-1 (6,1 kDa) và RAP-2 (6,2 kDa), acid cafeic, acid ferulic, p- hydroxybenzoic acid Ngoài ra, cũng theo công bố này, củ cải còn có hoạt tính miễn dịch, chống oxi hóa, chống ung thư, kháng virus, [12]

Hirotaka Katsuzaki và cộng sự (2004) đã có nghiên cứu so sánh hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng bằng nước nóng và nước ở nhiệt độ bình thường Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng bằng nước nóng cao hơn dịch chiết bằng nước ở nhiệt độ bình thường Hợp chất chống oxi hóa được phân lập và xác định là L-tryptophan Khi tiến hành nghiên cứu trên gan chuột thì L-tryptophan chuyển hóa thành 5-hydroxyl tryptophan [14]

Narisa Kamkaen và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme tyrosinase của 16 loại rau khác nhau ở Thái Lan, bao gồm củ cải trắng Mẫu rau được rửa sạch, cắt nhỏ, xay nhuyễn Quá trình trích ly được thực hiện với các dung môi hexan, ethyl acetate, methanol và propylen glycol 50% với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi

là 1: 4, trích ly bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ Dịch sau trích ly được lọc loại bỏ bã Pha loãng 5 lần dịch sau lọc để có dung dịch mẫu phân tích Khả năng ức chế Tyrosinase từ nấm được xác định bằng cách cho vào ống nghiệm 20 pl tyrosinase 1000 U/ml, 20 pl dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH 6,8),

100 pl dịch mẫu và 20 pl dung dịch L-DOPA 0,85 mM Ủ ở 250C trong 10 phút rồi đo

độ hấp thu ở 475 nm Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết hexan, ethyl acetate,

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 ĐHBRVT

methanol và propylen glycol 50% của củ cải trắng ức chế tyrosinase từ nấm ở các mức lần lượt là 38,43; 68,73; 53,51 và 88,50 % [23]

R Jakmatakul và cộng sự (2009) đã so sánh khả năng ức chế tyrosinase và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết methanol và nước ép từ củ cải trắng Thái Lan lạnh đông chậm nhằm xác định tiềm năng làm trắng da và chống lão hóa trong các ứng dụng mỹ phẩm Kết quả nghiên cứu công bố cho thấy nước ép từ củ cải lạnh đông chậm có hàm lượng các hợp chất phenolic, flavonoid và acis ascorbic cao hơn trong dịch chiết methanol, khả năng khử các gốc tự do (DPPH, superoxide, oxi đơn) và ức chế tyrosinase của nước ép cũng cao hơn so với dịch chiết methanol Nghiên cứu cũng

đã xác định được giá trị IC50 cho khả năng ức chế tyrosinase của dịch chiết methanol

là 9,62 mg/ml và và của nước ép là 3,09 mg/ml Do đó, tác giả cũng đề nghị về việc

xem xét hướng nghiên cứu sử dụng R.sativus vào công nghệ mỹ phẩm dưỡng da [25].

Syed Sultan Beevi và cộng sự (2010) khảo sát thành phần các hợp chất

polyphenol, khả năng chống oxi hóa và khử gốc tự do của lá và củ cải trắng Raphanus

sativus L Lá và củ được tách riêng, rửa sạch, sấy khô và xay thành bột mịn, bảo quản

ở -200C đến khi phân tích Bột sau đó được trích ly với các dung môi tinh khiết (methanol, chloroform, acetone, ethyl acetate và hexan) 3 lần, mỗi lần 24 giờ ở nhiệt

độ phòng, tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1: 40 (g/ml) Dịch trích ly sau đó được gom lại, cô giảm áp ở 400C thu cắn, cắn hòa tan lại vào methanol để dùng làm mẫu phân tích xác định thành phần polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa Kết quả cho thấy trong lá và củ cải có các chất chống oxy hóa và có khả năng khử gốc tự do Dịch chiết methanol và acetone của lá củ cải trắng có tổng hàm lượng polyphenol lần lượt là 86,16 và 78,77 mg/g chất khô, có thể so sánh với trà xanh và trà đen Phân tích HPLC- DAD cho thấy sự hiện diện của catechin, acid syringic, acid vanillic, axit ferulic, acid sinapic, o-coumaric acid, myricetin, và quercetin trong dịch chiết tất cả các dung môi trên cả lá và củ, hàm lượng các chất trong lá cao hơn trong củ Dịch chiết methanol từ

lá và củ cho thấy khả năng ức chế đáng kể acid linoleic peroxy và biểu thị hoạt động khử ion kim loại Cụ thể, IC50 khi khử gốc tự do DPPH lần lượt là 31 và 42 mg/ml, khi khử superoxide là 23 và 52 mg/ml cho, khi khử hydrogen peroxide là 67 và 197 mg/ml, khi khử gốc NO' 56 và 62 pg/ml, tương ứng [34]

S Shukla và cộng sự (2011) đã khảo sát khả năng kháng khuẩn của nước ép từ củ cải trắng Ân Độ Củ cải tươi, rửa sạch, ép lấy nước, lọc loại bã và cô giảm áp ở 35 ±

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 ĐHBRVT

50C để thu cao Cao này sau đó hòa tan lại vào nước ở các nồng độ xác định dùng khảo

sát hoạt tính kháng khuẩn Các chủng vi sinh được khảo sát gồm S aureus, E coli, P

aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis Mẫu đối chứng là kháng

sinh ampicillin Kết quả cho thấy nước ép từ củ cải trắng Ân Độ có khả năng ức chế sự phát triển của cả 5 chủng vi sinh khảo sát, giá trị MIC xác định được dao động trong

khoảng 0,078 - 0,625 mg/ml, trong đó hiệu quả tác động lên 2 chủng E coli và

Enterococcus faecalis là tương đương với ampicillin, và cao hơn ampicillin khi tác

động lên Klebsiella pneumoniae (MIC là 0,078 mg/ml so với 0,312 mg/ml của ampicillin) [31]

K Agarwal, R Varma (2014) đã nghiên cứu về thành phần sinh hóa và khả năng khử gốc tự do DPPH của củ cải trắng Kết quả công bố cho thấy dịch chiết trong nước nóng của củ cải trắng có khả năng khử gốc tự do DPPH ở mức 58,38% với nồng độ

200 ^g/ml, giá trị IC50 là 166,79 ^g/ml Kết quả phân tích cho thấy trong dịch chiết có

sự tồn tại của alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, triterpenoid và steroid [19]

H Caglar Kaymak và cộng sự (2015) đã so sánh hoạt tính kháng khuẩn in vitro của củ cải trắng và củ cải đen ở Thổ Nhĩ Kì Hai loại củ cải trắng và đen được trồng và chăm sóc như nhau, thu hoạch sau 80 ngày gieo hạt được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô, xay thành bột Bột củ cải sau đó trích ly bằng phương pháp Soxhlet bằng dung môi methanol trong 72 giờ, nhiệt độ không vượt quá nhiệt độ sôi của dung môi Dịch chiết sau đó đem lọc qua giấy Whatman No.1 rồi cô giảm áp thu cao Cao này dùng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Hơn 100 giống vi sinh vật thuộc 52 loài khác nhau đã được dùng nghiên cứu Kết quả cho thấy dịch chiết methanol của củ cải trắng và củ cải đen

có khả năng hạn chế sự phát triển của Arthrobacter atrocyaneus, Corynebacterium

ammoniagenes, Enterobacter hormaechei, Kocuria rosea, Neisseria subflava, Pantoea agglomerans, Proteus vulgaris, Psychrobacter immobilis và Shigella dysenteriae Ngoài ra, dịch chiết methanol của củ cải trắng còn tác động lên Bacillus sphaericus và

Corynebacterium flavescen Nhìn chung, củ cải trắng có phạm vi kháng khuẩn rộng và

mạnh hơn củ cải đen [13]

1.2 Giới thiệu chung về khuẩn

1.2.1 Bacillus cereus

Bacillus cereus (B cereus) thuộc:

- Giới: Bacteria,

- Tên khoa học là Bacillus cereus.

B. cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 500C, tối ưu ở 35 - 400C, pH dao động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô, ,)[44]

Nồng độ muối tối đa cho sự sinh trưởng của B cereus là 7,5% (Rajkowski và

Bennett, 2003) Khi có oxy, B cereus phát triển tối ưu nhưng chúng cũng có thể sống

ở điều kiện kỵ khí Các tế bào B cereus được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ít chịu

được nhiệt và acid hơn các tế bào B cereus nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí hoặc nửa

kỵ khí (Mols và cộng sự, 2009) Bào tử của B cereus có khả năng chịu nhiệt khô hơn nhiệt ẩm và thường chịu nhiệt lâu hơn trong các thực phẩm có chứa hoạt độ nước thấp (Jenson và Moir, 2003)

B cereus cho phản ứng dương tính với oxidase, catalase, lecithinase Chúng lên men glucose sinh acid trong điều kiện kỵ khí, khử nitrate tạo thành nitrite, dương tính với thử nghiệm VP (Voges Proskauer), thủy phân được L-tyrosine, tăng trưởng được

trong 0,001% lysozyme B cereus không lên men được mannitol cũng như arabinose

[44]

Hình 1.3 Vi khuẩn B cereus sau khi nhuộm Gram và khuẩn lạc trên môi trường thạch

TSB

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và

emetic toxin gây nôn mửa Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ trên 106 CFU/g đủ gây ngộ độc Triệu chứng

ngộ độc phổ biến gây ra bởi B cereus là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 - 16

giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12 - 24 giờ Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1 - 5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không

bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ [44]

- Tên khoa học là Pseudomonas aeruginosa.

P aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc

tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực P aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu có NO3- làm chất nhận điện tử, phát triển tối ưu ở 370C [44]

P aeruginosa cho phản ứng dương tính với catalase, citrate, oxidase, urease nhưng lại cho kết quả âm tính với các thử nghiệm MR (Methyl Red), VP (Voges

Proskauer) và indole Ngoài ra, P aeruginosa có khả năng khử nitrate thành nitrite, hóa lỏng dung dịch có chứa gelatin Chúng có khả năng thủy phân casein và tạo

enzyme lipase nhưng lại không thủy phân được tinh bột P aeruginosa cũng không có

khả năng lên men glucose và lactose để tạo acid [24]

Hình 1.4 Vi khuẩn P aeruginosa khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên

môi trường thạch TSBLoài này hiện diện phổ biến trong đất, nước, bề mặt cơ thể động thực vật, là loài

vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người Sự nhiễm bệnh bắt đầu từ khi có những biến đổi

làm suy yếu hệ bảo vệ của tế bào chủ P aeruginosa có thể gây nhiều bệnh khác nhau

ở người: gây viêm màng trong tim ở những người có van tim giả; gây viêm đường hô hấp ở những người có đường hô hấp hoặc hệ thống tự bảo vệ bị suy yếu; gây viêm phổi ở những bệnh nhân có bệnh mãn tính về phổi và bị chứng sung huyết tim; gây nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu ở những bệnh nhân suy giảm hệ thống miễn dịch như AIDS, giảm bạch cầu trung tính, tiểu đường, bỏng nặng; gây viêm màng não

mủ và áp xe não; gây viêm tai; gây bệnh hóa sừng ở mắt ở những người có hệ thống

bảo vệ suy yếu; gây viêm tủy xương; gây nhiễm trùng da, mô mềm; P aeruginosa

là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến, do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ có một số

ít các kháng sinh có tác dụng đối với giống Pseudomonas là fluoroquinolone, gentamycin và imipenem [44]

- Loài: enterica,

-Tên khoa học là Salmonella enterica serovar typhi.

S typhi là loài vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động nhờ tiên mao, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử Vi khuẩn này sinh trưởng tốt nhất tại nhiệt độ

370C, là nhiệt độ cơ thể người, là nguyên nhân gây bệnh sốt thương hàn S typhi phát

triển tối ưu trong môi trường có pH trung tính nhưng khoảng pH phát triển của chúng lại rất rộng (pH = 4 - 9) Khi pH thấp, oxy có tác dụng rất tốt đến sự phát triển của

chúng S typhi không có khả năng phát triển ở nồng độ muối cao [39, 41, 44].

S typhi có khả năng lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophan, hầu hết các chủng đều sinh H2S [44]

Hình 1.5 Vi khuẩn S typhi khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi

trường thạch TSB

S typhi gây ra sốt thương hàn Vi khuẩn này theo thực phẩm vào đường tiêu hóa, vào niêm mạc ruột đến hạch lympho và sinh sản, phát triển tại đây Thời gian này là thời gian ủ bệnh [41]

Sau khi phát triển với số lượng lớn, một số tự phân giải Kết quả là các độc tố được giải phóng và gây độc Một số khác sẽ theo hệ lympho vào máu và gây nhiễm

khuẩn máu Từ máu Salmonella đi đến khắp cơ thể gây ra những áp xe khu trú, thường

thấy nhất ở bọng đái, ống tiêu hóa [41]

Sau 10 - 14 ngày ủ bệnh, nhiệt độ cơ thể tăng và người cảm thấy lạnh Nhiệt độ tăng dần và giữ khoảng 39 - 400C trong hai tuần đầu Cơ thể bệnh nhân suy nhược nhanh chóng, ăn không ngon, mệt mỏi, gan và lá lách to dần, xuất huyết ngoài da,

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 ĐHBRVT

lượng bạch cầu giảm Sau ba tuần, bệnh giảm dần Sau hai tuần giảm bệnh, có 5 - 10% trường hợp có thể tái phát [41]

- Tên khoa học là Staphylococcus aureus.

S aureus là loài vi khuẩn Gram dương, dạng hình cầu, là loại yếm khí tùy tiện

Khi quan sát dưới kính hiển vi S aureus trông giống như chùm nho S.aureus có khả

năng phân hủy máu trên môi trường thạch S aureus không hình thành chuỗi dài, không di động, không sinh bào tử [39]

Trên môi trường thông thường, S aureus có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ 10

- 420C, pH 7,4 - 7,6 Vi khuẩn này hoạt động tốt nhất trong môi trường giàu oxy S

aureus có thể sinh trưởng trên nhiều môi trường thông thường, giàu dinh dưỡng, sữa,

gelatin hay thạch Khi S aureus sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy có thạch tạo thành các khuẩn lạc có đường kính 2 - 4 mm sau 24 giờ Khuẩn lạc thường có hình

tròn, lồi, nhẵn trơn, mờ đục, bề mặt sáng S aureus khi sinh trưởng trên môi trường thạch đặc trưng tạo thành các khuẩn lạc màu vàng nên được gọi là tụ cầu vàng [39]

S aureus có phản ứng dương tính với enzyme catalase, có khả năng chuyển H2O2 thành nước và oxy Đặc điểm này làm cho catalase trở thành phép thử hữu hiệu giúp

phân biệt các chủng Staphylococcus với Enterococcus Một số lượng nhỏ các chủng S

aureus có thể phân biệt với phần lớn Staphylococcus khác bằng cách thử phản ứng

phát hiện coagulase S.aureus thường phản ứng dương tính (do tạo ra coagulase), gây

đông tụ, trong khi một số chủng lại có phản ứng âm tính [44]

Hình 1.6 Vi khuẩn S aureus khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi

trường thạch TSB

S aureus có phản ứng với ADNase (tạo vùng sáng trong trên môi trường dinh dưỡng thạch), lipid (màu vàng và mùi ôi), phosphatease dương tính (có màu hồng), có

khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S

aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl [39, 44]

Trong tự nhiên S aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng S aureus sản sinh một số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 - 6 giờ người bị ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 - 8 giờ Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 400C) và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loài vi sinh vật này Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến Khoảng 20% dân số thường xuyên

mang theo S aureus [39, 44].

.3 Giới thiệu chung vê nam mốc

1.3.1 Nấm mốc Aspergillus flavus

1.3.1.1 Phân loại [47]

Aspergillus flavus là một loại nấm thường có mặt trong môi trường và có thể gây bệnh trên các loại ngũ cốc tích trữ trong thời gian dài Chúng cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho người, liên quan đến bệnh aspergillosis của phổi và đôi khi gây bệnh trên kết mạc, nấm tai, nhiễm trùng mũi hầu Nhiều dòng nấm sinh ra một lượng lớn độc

tố aflatoxin, một trong những chất gây ung thư và gây độc cấp tính

Hình 1.7 Aspergillus flavus Giới: Fungi

1.3.1.2 Đặc điểm của nấm Aspergillus flavus [43]

Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài, có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5 pm, có khi đến 10 pm, thậm chí đến 1

mm Chiều dài sợi nấm có thể tới vài chục cm Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm xù xì như bông Trên môi trường đặc biệt và trên một số hợp chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm

Giống như các loài Aspergillus, A flavus có một trên toàn thế giới Điều này có

lẽ kết quả từ việc sản xuất của nhiều bào tử trong không khí, dễ dàng phân tán bởi các chuyển động không khí và có thể do côn trùng Thành phần không khí có ảnh hưởng

đến sự phát triển của nấm mốc A flavus phát triển tốt với hoạt độ nước từ 0,86 và 0,96

Nhiệt độ thích hợp là 30-380C, tối đa là 44-470C, độ ẩm tương ứng để bảo từ nảy mầm là 80%, độ ẩm thích hợp sinh sản vô tính là 86%

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 ĐHBRVT 1.3.1.3 Hình thức sinh sản [43]

Nấm mốc sinh sản dưới hình thức: vô tính

Trong sinh sản vô tính: nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái Nấm sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng là sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử Bào tử đính (conidium) là các bào

tử không có túi bao bọc ở giống nấm Aspergillus, Pénicillium, Hình dạng, kích

thước, màu sắc và cách sắp xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác

và được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm; cuống bào tử đính dạng bình có thể

không phân nhánh như ở Aspergillus hay dạng thẻ phân nhánh như ở Pénicillium Bào

tử đính hình thành từ những cụm trên những cuống bào tử đính ở Trichoderma;

1.3.1.4 Một số bệnh lý do nấm mốc Aspergillus flavus gây ra [43]

Aspergillus flavus cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho thực vật và động vật, trong đó có con người và vật nuôi Nấm có thể nhiễm trên bắp, đậu phụng, cotton và cây đậu Nấm thường thấy dưới dạng các mảng nấm và có thể nhìn thấy được Các

bệnh nhân nhiễm nấm A flavus thường là suy giảm miễn dịch.

A flavus là tác nhân đứng hàng thứ hai hay gặp nhiều nhất của nhóm nấm gây

bệnh aspergillosis, tác nhân đầu tiên là nấm Aspergillus Fumigatus A flavus có thể xâm nhập vào các động mạch phổ hoặc não và gây tình trạng nhồi máu Ngoài ra nó còn sinh ra độc tố (aflatoxin) là một trong những tác nhân gây ung thư

(HCC_hepatocellular carcinoma) Sự phá hủy của nấm A flavus đặc biệt thường hay sinh aflatoxin, có thể gây viêm gan cấp, ung thư gan và gây suy giảm miễn dịch Đồng thời qua một số nghiên cứu tại các quốc gia cho thấy tỷ lệ ung thư gan có viêm gan

siêu vi đi kèm thì thường tỷ lệ nhiễm nấm cùng lúc cũng rất cao Trong tự nhiên, A

flavus có khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau Đặc biệt chúng sống trên các thực vật hoại sinh như mô thực vật và động vật bị chết trong đất Vì lý

do này nên nó có thể tái sinh dinh dưỡng liên tục

Trong một loạt ca bệnh được báo cáo về nấm A flavus ở người, nhiều ca đưa đến nhièu biến chứng nặng, thậm chí tử vong: viêm màng ngoài tim dẫn đến tử vong do A

flavus trên bệnh nhân bị bạch cầu cấp, hoặc dị ứng viêm mũi xoang ở bệnh nhân ở

Qatar do A.flavus, hoặc bệnh nhân ghép gan bị viêm cơ do nấm A flavus (Clinical transplantation, 22: 2008, 508-510)

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

1.3.2 Nấm mốc Fusarium solani [8]

Bệnh héo vàng do nấm F solani gây hại là một trong những bệnh nguy hiểm gây

thiệt hại lớn cho rau, củ, quả ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Mỹ, Anh, Ý, Nam Phi, Ân Độ, Australia Bệnh này có phạm vi kí chủ rộng, xuất hiện và gây hại nhiều nơi nhất là vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

1.3.2.1 Phân loại

Hình 1.8 Fusarium solani Giới : Fungi

1.3.2.2 Đặc điểm của nấm Fusarium solani [41]

Giai đoạn hữu tính F.solani là Haematonectria heamatococca Tuy nhiên, tên gọi này

thường ít thông dụng Giai đoạn hữu tính hầu như không gây bệnh cho cây, dù từ môi trường nuôi cấy

Hình 1.9 Loài F solani: A-B: đại bào tử; C-D: tiểu bào tử; E-G: bào tử đính trên môi

trường (Dương Minh,2010)

Giai đoạn vô tính là F solani thường ký sinh gây hại cây Tiểu bào tử của F

solani trong suốt, hình trụ, hay nêm (9-16 x 2-4pm), có thể có 1 vách ngăn Đại bào tử

có thể có hoặc không có một vài chủng, hình trụ hoặc liềm (40-100 x 5-7,5pm), thường có 3-5 hay 7 vách ngăn

Nhiệt độ tối thiểu để sợi nấm phát triển và hình thành bào tử trong nuôi cấy là 280C Bào tử áo là những bào tử có vách dày (10-11 x 8-9pm) Li et al, (1998) cho biết

ở loài F.solani f.sp glycines nhiệt độ 300C giúp kích thích hình thành bào tử áo Thường bào tử áo có dạng đơn, đôi khi có dạng đôi chúng được hình thành từ phần

cuối, bên hông hay ở giữa của đại bào thì Fusarium có thể tồn tại trong đất dưới dạng bào tử áo qua thời gian dài, bào tử áo có thể lưu tồn trong đất từ 15 đến 20 ngày Bệnh lây lan qua than rễ, đất bị nhiệm bệnh và truyền qua giống, ngoài sựu lây lan thứ cấp

của bệnh có thể được thực hiện qua nguồn nước và cơ giới Fusarium thường tấn công

cây trồng dễ dàng khi bị thiếu ánh sáng Phơi nắng ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm hiệu

quả của việc tiêm chủng F.solani.

Trên cây trồng, loài F solani f.so.pisi (gây chết cây) phát triển tốt khi đất được cung cấp thêm P, K, Mg hòa tan, C và N tổng số Das (1991), cho biết khuẩn lạc của

F.solani sẽ phát triển kém khi hàm lượng K+ giảm dưới 3mM Nếu thiếu Bo và Fe,

F.solani f.sp.phaseoli sẽ gia tăng mức gây hại lên trục hạ diệp của cây

Ngược lại, Keawruang et al, (1989), bón thạch cao (CaSO4) và hàm lượng nước

tốt có thể làm giảm bệnh thối rễ do F.solani gây ra.

I.3.2.3 Hình thức sinh sản

Nấm F solani sản sinh ra 3 loại bào tử vô tính đó là tiểu bào tử, đại bào tử và bào

tử hậu

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

Các bào tử hậu thường có dạng hình tròn, có thành bào tử dày do các sợi nấm tạo thành loại bào tử này thường có 3 đến 5 ngăn, chúng được sinh ra trong các đại bào tử hoặc xen giữa các sợi nấm già [8, 47]

Tiểu bào tử là các bào tử có 3 hay 5 ngăn, có hình trứng, hình bầu dục, đây là dạng bào tử có nhiều nhất và được sản sinh trong tất cả các điều kiện, thường được sinh ra trong tất cả các điều kiện, thường được sinh ra trong các mạch dẫn của cây bị bệnh

Đại bào tử là các bào tử có từ 3 đến 5 ngăn Đại bào tử có hình bán nguyệt, hình lưỡi liềm Đại bào tử có thể tồn lưu trong đất lâu đến 30 năm và nó chính là nguồn lan truyền bệnh cho các năm sau và các cây khác

I.3.2.4 Một số bệnh lý do nấm mốc F solani

Nấm F solani là loài nấm tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây bệnh vào bên

trong bó mạch, chủ yếu thông qua bộ rễ do rễ làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng nên nấm cũng theo con đường đó mà xâm nhập vào cây, sau khi xâm nhập gây bệnh nấm làm cho bó mạch bị chuyển sang màu nâu xấm hoặc nâu đen, lá cây bị héo

do độc tố nấm tiết ra làm tắc bó mạch, dẫn đến mất chức năng quang hợp và cây bị chết [8]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: 06/02/2017 đến 06/06/2017

Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Một phần nghiên cứu được thực hiện ở phòng F45 Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp TP.HCM

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Củ cải trắng được thu hái vào tháng 2 năm 2016 tại trang trại thuộc huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam Củ cải tươi sau khi thu hoạch được rửa sạch, cắt lát dày 1-1,2 cm, sấy ở 500C đến khi còn 6 - 7% ẩm Củ cải khô sau đó được xay nhỏ, lọt qua sàng 40 mesh và trích ly bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, methanol, ethyl acetate, este dầu hỏa) thu được cao củ cải

• Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)

• Salmonella typhi (ATCC 6538)

• Staphylococcus aureus (ATCC 14028)

Vortex; cân phân tích,

Nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, kính hiển vi;

Và các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.I Phương pháp định tính các thành phần trong cao chiết

> Định tính alkaloids

Cân 2 g mẫu cao cho vào 20 ml dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 50% Thêm 2 giọt dung dịch ammoniac đậm đặc và thêm một ít dung môi chloroform vào rồi lắc nhẹ để trộn đều và hỗn hợp được đưa vào phễu chiết Chờ một lúc để hỗn hợp tách lớp rồi đem đi chiết thu được 2 lớp dịch riêng biệt rồi đem kiểm tra với thuốc thử Dragendorf Lần lượt cho 1 ml thuốc thử Dragendorf vào trong 2 lớp dịch được

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 ĐHBRVT

tách riêng biệt Hỗn hợp nào hình thành kết tủa màu nâu đỏ chứng tỏ có sự hiện diện của alkaloids [36]

- Thử nghiệm gelatin: Hòa tan một lượng nhỏ gelatin dạng hạt vào trong phần thứ hai rồi lắc đều cho gelatin hòa tan hoàn toàn Sau đó để yên hỗn hợp, nếu xuất hiện kết tủa trắng lơ lửng bên trong chứng tỏ mẫu cao có sự hiện diện của tannin [36]

- Thử nghiệm chì acetate: Nhỏ 3 giọt dung dịch chì acetate vào phần thứ ba, lắc đều cho đến khi thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt thì chứng tỏ có sự tồn tại của tannin trong mẫu cao [36]

> Định tính anthraquinones

Cân 0,5 g mẫu cao hòa vào 5 ml dung môi chloroform và lắc đều trong vòng 5 phút Tiến hành lọc hỗn hợp trên để thu được dịch trong rồi bổ sung thêm dung dịch amoniac 10% với thể tích bằng với thể tích của dịch trong vừa lọc Nếu ta thấy có xuất hiện lớp nước màu đỏ hay hồng hoặc tím sau khi lắc đều chứng tỏ có sự hiện diện của anthraquinones tự do có trong mẫu cao [36]

> Định tính saponin

- Thử nghiệm 1: Lấy 1g mẫu cao cho vào 2 ml dung dịch NaCl rồi lắc đều sau

đó hút 2 ml hỗn hợp cho vào ống nghiệm rồi thêm 3 giọt máu động vật bằng ống tiêm rồi nhẹ nhàng đảo ngược ống (không tạo rung) và để yên trong 15 phút Sự lắng xuống của các tế bào hồng cầu chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong mẫu cao [36]

- Thử nghiệm 2: Cân 1 g mẫu cao rồi hòa tan trong 10 ml nước cất sau đó lắc mạnh trong 30 giây và để yên hỗn hợp trong vòng 30 phút Nếu có sự hình thành của bọt khí không tan chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong mẫu cao [36]

> Định tính flavonoids

Cân 2 g mẫu cao hòa tan trong 10 ml nước cất rồi hút 3 ml hỗn hợp vào trong 2 ống nghiệm Phương pháp này gồm thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% và thử nghiệm với dung dịch FeCl3 [36]

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017

- Thử nghiệm NaOH 10%: Thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% vào 3 ml hỗn hợp rồi lắc đều Nếu thấy xuất hiện dung dịch màu vàng rồi chuyển sang không màu nếu cho acid hydrochloric vào chứng tỏ có sự hiện diện của ílavonoids trong mẫu cao [36]

- Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào 3 ml hỗn hợp rồi lắc đều

Sự chuyển màu của dung dịch sang màu xanh đen chứng tỏ có tồn tại ílavonoids trong mẫu cao [36]

2.2.2.2 Chuẩn bị giống

> Nấm mốc

Tiến hành giữ các giống nấm mốc trên môi trường thạch SDA trên đĩa Petri bằng phương pháp cấy chấm góc Đầu tiên pha môi trường thạch SDA (65 gam/lít), hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội xuống 40-500C rồi đem đi đổ đĩa Petri Các đĩa này được để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ để kiểm tra môi trường không bị nhiễm Đĩa Petri sau 24 giờ sẽ được dùng để cấy chuyền các giống nấm mốc nhằm mục đích giữ giống Sau khi cấy các đĩa Petri được đem ủ trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ thường và bảo quản trong 2 - 3 tuần ở nhiệt độ mát

Để chuẩn bị thử nghiệm cấy nấm mốc qua môi trường thạch nghiêng, nuôi nấm mốc trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng Thực hiện lấy bào tử nấm mốc: bơm 10 ml nước muối sinh lý vào ống thạch nghiêng đã cấy nấm mốc, lắc ống nghiệm trên vortex với tốc độ quay 3200 rpm thời gian 5 phút Đổ lấy dịch huyền phù vào ống ly tâm và ly tâm với tốc độ vòng 5000 rpm thời gian 10-15 phút Đổ phần dịch bên trên thu lấy phần cặn phía dưới cặn này sẽ hòa tan vào dung dịch nước muối sinh lý để được mật

độ 5 x106 bào tử/ ml Đây chính là dịch nấm mốc để nghiên cứu

> Vi khuẩn

Bảo quản giống: vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng TSB, đem ủ ở 370C trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem tăng sinh chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 370C, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 -

12 giờ Môi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật Chuẩn bị sẵn glycerol và effendorf đã được hấp tiệt trùng Tiến hành bơm 400 pl dịch vi khuẩn nuôi cấy vào effendorf rồi cho tiếp 600 pl glycerol rồi đem cho vào tủ lạnh đông sâu ở - 490C để giữ giống cho quá trình làm thí nghiệm