Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân eurycoma longifolia jack và khảo sát khả năng kháng khuẩn từ dịch chiết của chúng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG *** NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CHÚNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÀ NẴNG - Năm 2014 ĐẠI HỌC1ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG *** NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CHÚNG N n : CỬ NHÂN SINH - MÔI TRƢỜNG N ƣời ƣớng dẫn: ThS VÕ CHÂU TUẤN ĐÀ NẴNG - Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khác Đà Nẵng, ngày 23 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hiền LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khoá luận tốt nghiệp này, xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS Võ Châu Tuấn - thầy giáo tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Bùi Thị Thơ ThS Nguyễn Thị Duy Nhất, người giúp đỡ nhiều việc trau dồi kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm suốt trình tơi thực đề tài khố luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 23 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hiền MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài C ƣơn TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật 1.1.1 Nuôi cấy callus 1.1.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 1.1.4 Nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học 1.1.4.1 Các nghiên cứu giới 1.1.4.2 Các nghiên cứu nước 1.2 Giới thiệu mật nhân 11 1.2.1 Đặc điểm hình thái .11 1.2.2 Phân bố .11 1.2.3 Thành phần hóa học 12 1.2.4 Tác dụng dược lý 12 1.2.5 Các nghiên cứu đối tượng 13 1.3 Những nghiên cứu khả kháng khuẩn hợp chất từ thực vật .14 C ƣơn ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu .16 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy callus .17 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân .17 2.2.2.1 Ảnh hưởng sucrose lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 17 2.2.2.2 Ảnh hưởng chất ĐHST lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 18 2.2.2.3 Phương pháp xác định khối lượng tươi khô tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro 18 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân 18 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 19 C ƣơn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Ảnh hưởng nồng độ sucrose lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 20 3.2 Ảnh hưởng chất ĐHST lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân nuôi cấy huyền phù 21 3.2.1 Ảnh hưởng NAA BA 21 3.2.2 Ảnh hưởng NAA KIN 22 3.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân 25 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28 Kết luận 28 Đề nghị .28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ABA : abscisic acid BA : 6-benzyl adenine BAP : 6-benzyl amino purine cs : cộng DW : dry weight (sinh khối khô) ĐHST : điều hòa sinh trưởng GA : gibberellin acid GAE : gallic acid equivalents HPLC : high performance liquid chromatography (sắc kí cao áp) IAA : indolacetic acid IBA : indole 3-butyric acid KIN : kinetin (6-furfuryl aminopurine) L : lít LB : Lauria Betan MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-nathyl acetic acid NXB : Nhà xuất QE : quercetin equivalents DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Cây mật nhân in vitro 16 2.2 Tế bào callus tạo từ rễ mật nhân in vitro 16 3.1 3.2 Đường cong sinh trưởng tế bào mật nhân môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L NAA 2,0 mg/L KIN Nuôi cấy huyền phù tế bào máy lắc 23 25 Sinh khối tươi (a) sinh khối khô (b) tế bào huyền phù 3.3 nuôi cấy môi trường MS bổ sung mg/L NAA 25 mg/L KIN 3.4 3.5 Khả kháng Bacillus subtilis dịch chiết tế bào mật nhân Khả kháng Escherichia coli dịch chiết tế bào mật nhân 26 26 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 Tên bảng Ảnh hưởng nồng độ sucrose lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Ảnh hưởng NAA BA lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Ảnh hưởng NAA KIN lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Khả kháng khuẩn dịch chiết tế bào mật nhân Trang 20 22 23 25 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hàng ngàn năm qua, loài dược liệu nguồn cung cấp dược phẩm quan trọng toàn giới Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 80% dân số giới tin cậy vào phương thức chữa bệnh truyền thống dược liệu ¼ loại thuốc có chứa hoạt chất sinh học chiết xuất từ dược liệu [67] Tuy nhiên, nguồn dược liệu sử dụng chủ yếu khai thác từ tự nhiên Hiện nay, việc khai thác dược liệu tự nhiên để đáp ứng nhu cầu ngày tăng người với bất lợi điều kiện môi trường làm cho tài nguyên thuốc bị giảm sút nghiêm trọng Do đó, khó đáp ứng ổn định nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm tương lai Vì vậy, vấn đề đặt phải tìm giải pháp nhằm đảm bảo cung cấp ổn định nguồn dược liệu cho người [20] Công nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật nói chung nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật nói riêng xem đường hữu hiệu để sản xuất hợp chất thứ cấp phục vụ cho công nghiệp dược phẩm Ưu điểm nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật sản xuất lượng sinh khối thời gian ngắn, tạo nguồn nguyên liệu ổn định phục vụ chiết tách hoạt chất sinh học quy mơ cơng nghiệp, góp phần giải khó khăn nguồn dược liệu tự nhiên [7] Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) dược liệu biết đến nhiều nước châu Á Các phận sử dụng theo truyền thống để chống sốt rét, cải thiện sinh lý nam giới, chống bệnh tiểu đường, chống viêm loét, kháng khuẩn, hạ đường huyết sử dụng loại thuốc bổ tổng hợp [42], [43] Mật nhân loài thân gỗ, sinh trưởng chậm ngồi tự nhiên Vì để phục vụ cho mục đích thương mại, hầu hết người ta thu hoạch rễ mật nhân sau năm trồng [24] Hiện nước ta, nhu cầu sử dụng thực vật làm thuốc để chăm sóc sức khỏe chữa bệnh ngày tăng, tình trạng khai thác mức mật nhân diễn nhiều nơi, dẫn đến nguy tuyệt chủng tương lai gần Do việc nghiên cứu tìm phương thức sản xuất sinh khối tế 23 Bảng 3.3 Ảnh hưởng NAA KIN lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Chất ĐHST (m /L) Khả năn sin trƣởng tế bào Khối lƣợn tƣơi ( ) Khối lƣợng khô (g) NAA KIN 0,5 0,5 26,40b 0,67d 1,0 1,0 27,56b 0,71c 1,5 1,5 27,58b 0,74b 2,0 2,0 31,14a 0,89a Chú thích: Các chữcái khác cột chỉsựsai khác thố ng kê với p