Nghiên cứu sự tăng trưởng của cây IN VITRO định tính và khảo sát khả năng kháng khuẩn của hợp chất QUINON trong lá cây RIVINA HUMILIS l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU SỰ TĂNG TRƢỞNG CÂY IN VITRO, ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT QUINON TRONG LÁ CÂYRIVINA HUMILIS L KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP GVHD: TS Đỗ Thƣờng Kiệt Ths Nguyễn Trần Đông Phƣơng SVTH: Trần Đình Thiện MSSV: 1153010785 Khóa: 2011-2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trƣờng, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em đƣợc học tập rèn luyện môi trƣờng tốt Em xin chân thành cảm ơn tất quý thầy, cô giáo môn khoa Công nghệ sinh học tận tình giảng dạy trang bị cho em kiến thức cần thiết suốt thời gian học đại học Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Đỗ Thƣờng Kiệt cô Nguyễn Trần Đông Phƣơng trực tiếp hƣớng dẫn truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài Chân thành cảm ơn anh chị bạn phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình Cảm ơn tình cảm mà ông bà, ba mẹ anh chị dành cho con, ủng hộ động viên gia đình giúp vững bƣớc đƣờng học tập đƣờng đời Tp Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng năm 2015 Trần Đình Thiện i CÁC CHỮ VIẾT TẮT MS : Murashige & Skoog BA : 6-Benzinaminopurine NB : Nutrigent Broth ND : Nƣớc dừa Cs : Cộng ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng II.1: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ javel thời gian khử trùng đến khả khử trùng nảy mầm mẫu hạt Rivina humilis L 33 Bảng II.2: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng BA đến tăng trƣởng Rivina humilis L 34 Bảng II.3: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng kinetin đến tăng trƣởng Rivina humilis L 35 Bảng II.4: Cách bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng ND đến tăng trƣởng Rivina humilis L 36 Bảng III.1: Tỉ lệ mẫu vô trùng thời gian nảy mầm hạt đƣợc khử trùng javel nồng độ thời gian khử trùng khác 42 Bảng III.2: Chiều cao cây, số lá/cây đặc điểm Rivina humilis L môi trƣờng có chứa BA với nồng độ khác 44 Bảng III.3: Chiều cao cây, số lá/cây đặc điểm Rivina humilis L môi trƣờng có chứa kinetin với nồng độ khác 46 Bảng III.4: Chiều cao cây, số lá/cây đặc điểm Rivina humilis L môi trƣờng có chứa ND với nồng độ khác 48 Bảng III.5: Kết phản ứng Borntraeger 51 Bảng III.6: Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Rivina humilis L 53 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình I.1: Cây Rivina humilis L Hình I.2: Các đƣờng tổng hợp nên hợp chất thứ cấp 14 Hình I.3: Benzoquinon 19 Hình I.4: Naphthoquinon 20 Hình I.5: Bình sắc ký lớp mỏng 24 Hình II.1: Sơ đồ nhuộm hai màu 37 Hình II.2: Bản sắc ký 38 Hình III.1 Hạt Rivina humilis L nảy mầm môi trƣờng MS (sau 30 ngày nuôi cấy) 43 Hình III.2: Cây in vitro (đã loại bỏ rễ) thời điểm tuần nuôi cấy môi trƣờng có bổ sung BA nồng độ khác 45 Hình III.3: Cây in vitro (đã loại bỏ rễ) thời điểm tuần nuôi cấy môi trƣờng có bổ sung kinetin nồng độ khác 47 Hình III.4:Cây in vitro (đã loại bỏ rễ) thời điểm tuần nuôi cấy môi trƣờng có bổ sung ND nồng độ khác 49 Hình III.5: Cấu tạo giải phẫu thân Rivina humilis L 50 Hình III.6: Cấu tạo giải phẫu Rivina humilis L 50 Hình III.7: Sắc ký mỏng dịch trích quinon Rivina humilis L 52 Hình III.10: Vòng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa 54 Hình III.9: Vòng kháng khuẩn Escherichia coli 54 Hình III.8: Vòng kháng khuẩn Staphylococus aureus 54 Hình III.11: Vòng kháng khuẩn Bacillus aureus 55 iv MỤC LỤC I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu đặc tính sinh học Rivina humilis L I.1.1 Họ Thƣơng lục (Phytolaccaceae) I.1.2 Mô tả Rivina humilis L I.1.3 Phân bố sinh thái I.1.4 Thành phần hóa học I.1.5 Tác dụng dƣợc lý I.1.6 Các nghiên cứu thực I.2 Nuôi cấy mô I.2.1 Vai trò chất điều hòa sinh trƣởng thực vật I.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình nuôi cấy mô I.2.3 Sự phát sinh hình thái chồi bất định I.3 Sự thu nhận hợp chất thứ cấp 10 I.3.1 Giới thiệu 10 I.3.2 Phân loại 11 I.3.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 14 I.3.4 Quinon phƣơng pháp chiết tách 18 I.3.5 Phƣơng pháp chiết tách 23 I.3.6 Định tính quinon 23 I.3.7 Sắc ký lớp mỏng 24 I.4 Vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp 25 I.4.1 Staphylococus 25 I.4.2 Escherichia coli 28 v I.4.3 Pseudomonas aeruginosa 28 I.4.4 Bacillus cereus 29 II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 32 II.1 Vật liệu 32 II.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 II.2.1 Nuôi cấy in vitro từ hạt Rivina humilis L 32 II.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng BA đến tăng trƣởng Rivina humilis L in vitro 34 II.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng kinetin đến tăng trƣởng Rivina humilis L in vitro 35 II.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng ND đến tăng trƣởng Rivina humilis L in vitro 36 II.2.5 Quan sát hình thái giải phẫu 37 II.2.6 Định tính quinon 37 II.2.7.Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Rivina humilis L 39 II.2.8 Xử lý thống kê 40 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 III.1 Sự tạo từ hạt Rivina humilis L 42 III.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA đến tăng trƣởng in vitro 44 III.3 Ảnh hƣởng nồng độ kinetin đến tăng trƣởng in vitro 46 III.4 Ảnh hƣởng nồng độ ND đến tăng trƣởng in vitro 48 III.5 Nhuộm quinon lát mỏng tế bào 50 III.6 Phản ứng Borntraeger 51 vi III.7 Sắc ký lớp mỏng 52 III.8 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Rivina humilis L 53 IV Kết luận đề nghị 58 IV.1 Kết luận 58 IV.2 Đề nghị 58 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Rivina humilis L loài thực vật có hoa thuộc họ Phytolaccaceae, thân thảo lâu năm, chiều cao lên đến khoảng m Sự phân bố tự nhiên ban đầu bị hạn chế châu Mỹ, kéo dài từ Argentina lên tới miền nam nƣớc Mỹ Rivina humilis L chủ yếu sống vùng nhiệt đới ẩm, nhƣng đòi hỏi lƣợng ánh sáng chịu đƣợc tất ánh sáng màu Rivina humilis L sống loại đất có hàm lƣợng muối cao, chịu đựng đƣợc nhiệt độ thấp [37] Tất phận độc, đặc biệt rễ có chứa lƣợng chất độc lớn so với phần lại [25] Tuy nhiên, loài chim ăn mà không bị ngộ độc Khan et al (2011) thử nghiệm chất chiết xuất từ không độc hại chuột nhƣng phần lại độc hại ngƣời [28] Quả đƣợc sử dụng để nhuộm màu vải Cape Verde [16] Khan et al (2012) xác định mƣời sắc tố betalain quả, bao gồm betaxanthins betacyanins; xác nhận hoạt động chống oxy hóa quan trọng hai nhƣ khả gây độc từ betaxanthins.Rivina humilis L đƣợc sử dụng nhƣ loại thuốc dân gian để điều trị cảm lạnh, tiêu chảy, tiểu khó, đầy hơi, bệnh lậu, bệnh vàng da đau buồng trứng [25] Trong dịch chiết Rivina humilis L có nhiều hợp chất thứ cấp nhƣ: flavonoids, alkaloids, terpenoids, coumarins, steroids, phytosteroids đặc biệt quinon chiếm phần lớn [23] Quinon có tác dụng sinh học dƣợc, chống khối u, ức chế sinh tổng hợp PGE2, phòng chống bệnh tim mạch, đƣợc sử dụng nhƣ thuốc thử hóa học đặc biệt khả kháng khuẩn [22] Vì thực đề tài “Nghiên cứu tăng trƣởng in vitro, định tính khảo sát khả kháng khuẩn hợp chất quinon Rivina humilis L.”nhằm bƣớc đầu xây dựng quy trình nhân giống, xác định hoạt tính hợp chất tạo tiền đề phát huy lợi ích quinon đặc biệt khả kháng khuẩn c/ Multiple Range Tests for Thoi gian mam by Nghiem thuc Kết xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát tăng trƣởng in vitrodƣới tác động chất điều hòa tăng trƣởng thực vật 2.1 Kết xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát tăng trưởng in vitro tác động BA 2.1.1 Thống kê chiều cao chồi môi trường MS bổ sung BA a/ ANOVA Table for Chieu cao by Nghiem thuc b/ Table of Means for Chieu cao by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals iv c/ Multiple Range Tests for Chieu cao by Nghiem thuc 2.1.2 Thống kê số chồi môi trường MS bổ sung BA a/ ANOVA Table for So la by Ngiem thuc b/ Table of Means for So la by Ngiem thuc with 95.0 percent LSD intervals v c/ Multiple Range Tests for So la by Nghiem thuc 2.2 Kết xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát tăng trưởng in vitro tác động Kinetin 2.2.1 Thống kê chiều cao chồi môi trường MS bổ sung Kinetin a/ ANOVA Table for Chieu cao by Nghiem thuc b/ Table of Means for Chieu cao by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals vi c/ Multiple Range Tests for Chieu cao by Nghiem thuc 2.2.2 Thống kê số chồi môi trường MS bổ sung Kinetin a/ ANOVA Table for So la by Nghiem thuc b/ Table of Means for So la by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals vii c/ Multiple Range Tests for So la by Nghiem thuc 2.3 Kết xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát tăng trưởng in vitro tác động ND 2.3.1 Thống kê chiều cao chồi môi trường MS bổ sung ND a/ ANOVA Table for Chieu cao by Nghiem thuc b/ Table of Means for Chieu cao by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals viii c/ Multiple Range Tests for Chieu cao by Nghiem thuc 2.3.2 Thống kê số chồi môi trường MS bổ sung ND a/ ANOVA Table for So la by Nghiem thuc b/ Table of Means for So la by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals ix c/ Multiple Range Tests for So la by Nghiem thuc Kết xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Rivina humilis L 3.1 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn dịch chiết chloroform với chủng vi khuẩn khác 3.1.1 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn E.coli a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc x b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc 3.1.2 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn P aeruginosa a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals xi c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc 3.1.3 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn B cereus a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc xii 3.2 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn dịch chiết ethanol với chủng vi khuẩn khác 3.2.1 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn S aureus a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc 3.2.2 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn E.coli a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc xiii b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc 3.2.3 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn B cereus a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc xiv b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc 3.3 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn dịch chiết methanol với chủng vi khuẩn khác 3.3.1 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn S.aureus a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc xv b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc 3.3.2 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn E coli a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals xvi c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc 3.3.3 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn P aeruginosa a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc xvii 3.3.4 Thống kê đƣờng kính vòng kháng khuẩn B cereus a/ ANOVA Table for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc b/ Table of Means for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals c/ Multiple Range Tests for Duong kinh vong khang khuan by Nghiem thuc xviii ... Rivina humilis L in vitro 34 II.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng kinetin đến tăng trƣởng Rivina humilis L in vitro 35 II.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng ND đến tăng trƣởng Rivina humilis L in. .. biệt khả kháng khuẩn [22] Vì thực đề tài Nghiên cứu tăng trƣởng in vitro, định tính khảo sát khả kháng khuẩn hợp chất quinon Rivina humilis L. ”nhằm bƣớc đầu xây dựng quy trình nhân giống, xác định. .. Eudicots Bộ: Caryophyllales Họ: Phytolaccaceae Phân họ: Rivinioideae Chi: Rivina Loài: Rivina humilis L Hình I.1: Cây Rivina humilis L Rivina humilis L thân thảo l u năm chiều cao l n đến khoảng m