Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu từ cây ngải cứu (artemisia vulgaris l ) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN Q TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU TỪ CÂY NGẢI CỨU (ARTEMISIA VULGARIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực : Phan Phú Thắng MSSV: 1411100415 Lớp: 14DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2018 CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn TS Trịnh Thị Lan Anh Các số liệu, kết trình bày Đồ án trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác TP.HCM, ngày 31 tháng năm 2018 Sinh viên thực Phan Phú Thắng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể Quý Thầy, Cô Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công Nghệ TP.HCM giảng dạy trang bị cho em kiến thức bản, tạo điều kiện thuận lợi để em có hội tiếp cận với môi trường làm việc thực tế qua thời gian học tập đầy ý nghĩa Đồng thời nhà trường tạo cho em có hội làm việc, cho em bước đời sống thực tế để áp dụng kiến thức mà thầy cô giảng dạy Qua đề tài tốt nghiệp em nhận nhiều điều mẻ bổ ích để giúp ích cho công việc sau thân Đặc biệt, em xin gởi đến cô TS.Trịnh Thị Lan Anh, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hồn thành đề tài đồ án tốt nghiệp lời cảm ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy, Cơ, Ban Lãnh Đạo, phịng ban tạo điều kiện thuận lợi cho em tìm hiểu thực tiễn suốt q trình làm đề tài phịng thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn thầy, cô, anh, chị làm việc Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn, hướng dẫn cho em cách làm việc, ghi công việc rõ ràng cụ thể để thuận lợi cho việc làm việc nhóm báo cáo cơng việc Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình làm việc hồn thiện đề tài em khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ q thầy, cơ, anh, chị Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, tạo điều kiện giúp em có hội học tập nâng cao kĩ thân Chúc Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM phát triển ngày trở thành nơi tin cậy nhiều sinh viên TP.HCM, ngày 31 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực Phan Phú Thắng ii MỤC LỤC CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC BẢNG x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Ngải cứu 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Giới thiệu họ Cúc (Asteraceae) chi ngải (Artemisia) 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.4 Công dụng dược lý Ngải cứu 10 1.2 Giới thiệu tinh dầu 11 1.2.1 Khái niệm tinh dầu 11 1.2.2 Phân bố tinh dầu thiên nhiên 12 1.2.3 Q trình tích luỹ tinh dầu 12 1.2.4 Tính chất vật lý tinh dầu 13 1.2.5 Tính chất hố học tinh dầu Ngải cứu 14 1.2.6 Ảnh hưởng nhân tố khác đến thành phần tính chất tinh dầu Ngải cứu 16 1.2.7 Ứng dụng tinh dầu Ngải cứu ngành công nghiệp 18 1.2.8 Nguyên tắc sản xuất tinh dầu 18 1.2.9 Nguyên tắc trích ly tinh dầu 18 1.2.10.Các phương pháp trích ly tinh dầu 19 1.3 Giới thiệu phương pháp chưng cất lôi nước 24 1.3.1 Nguyên lý hoạt động phương pháp chưng cất lôi nước 25 1.3.2 Giới thiệu ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu 26 iii 1.4 Khả kháng khuẩn chế kháng khuẩn hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 27 1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 27 1.4.2 Các chế kháng khuẩn 27 1.4.3 Một số nhóm hợp chất alkaloid thực vật 29 1.4.4 Một số nhóm hợp chất glycoside thực vật 31 1.4.5 Nhóm tinh dầu 33 1.5 Giới thiệu chủng vi khuẩn gây bệnh 34 1.5.1 Staphyllococcus aureus 34 1.5.2 Escherichia coli (E.coli) 36 1.5.3 Shigella 38 1.5.4 Salmonella 39 1.6 Giới thiệu tình hình nghiên cứu khả kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu loại tinh dầu khác từ thực vật 41 1.6.1 Khả kháng vi sinh vật tinh dầu Ngải cứu 41 1.6.2 Khảo sát khả kháng vi sinh vật tinh dầu tần dày 41 1.7 Sắc ký khí ghép khối phổ số ứng dụng (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) 42 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đề tài 48 2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài 48 2.1.2 Thời gian thực 48 2.2 Vật liệu 48 2.2.1 Nguyên liệu 48 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 49 2.2.3 Hóa chất 50 2.3 Phương pháp nghiên cứu 51 2.3.1 Tiến hành trích ly tinh dầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng 52 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 53 iv 2.3.3 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu 58 2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn 62 2.4 Thống kê xử lý số liệu 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 65 3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 65 3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng tuổi nguyên liệu (lá non, già) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 67 3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 68 3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng thời gian ngâm dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 70 3.1.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 71 3.1.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 74 3.1.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 75 3.2 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu 77 3.2.1 Đánh giá cảm quan 77 3.2.2 Định lượng tinh dầu Ngải cứu 77 3.2.3 Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu 78 3.2.4 Chỉ số hóa học tinh dầu Ngải cứu 79 3.2.5 Độ hòa tan ethanol 79 3.3 Kết xác định thành phần hóa học tinh dầu 80 v 3.4 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 83 3.4.1 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 83 3.4.2 Hoạt tính kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 85 3.4.3 Kết hoạt tính kháng Salmonella typhimurium tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 87 3.4.4 Hoạt tính kháng Shigella boydii tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 89 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 4.1 Kết luận 92 4.2 Kiến nghị 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxyde DNA : Deoxyribonucleic Acid E.Coli : Escherichia coli GC : Gas chromatography MS : Mass spectrometry NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth PABA : 4-Aminobenzoic acid RNA : Ribonucleic Acid SAS : Statistical Analysis Systems TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TCVS : Tiêu chuẩn vi sinh TSA : Trypticase Soy Agar TSB : Trypticase Soy Broth vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) Hình 1.2 Một số thuộc chi Ngải Hình 1.3 Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) Hình 1.4 Cấu trúc 3D phân tử camphor 14 Hình 1.5 Cấu trúc 3D phân tử eucalyptol 15 Hình 1.7 Cấu trúc 3D phân tử α-pinene 15 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử β-eudesmol 16 Hình 1.8 Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol 16 Hình 1.9 Máy ép tinh dầu 19 Hình 1.10 Hệ thống chưng cất lôi nước 20 Hình 1.11 Hệ thống chưng cất nước hỗ trợ vi sóng 23 Hình 1.12 Hệ thống chưng cất lơi nước nguyên lý hoạt động 25 Hình 1.13 Những vị trí vi khuẩn bị tác động hợp chất thực vật 28 Hình 1.14 Cấu trúc Morphine 29 Hình 1.15 Cấu trúc Quinine 30 Hình 1.16 Sơ đồ phân loại saponin 32 Hình 1.17 Staphyllococcus aureus 35 Hình 1.18 Vi khuẩn E.coli 36 Hình 1.19 Vi khuẩn Shigella 38 Hình 1.20 Vi khuẩn Salmonella 39 Hình 1.21 Sắc đồ sắc ký khí 44 Hình 1.22 Mơ hình khối phổ 45 Hình 1.23 Mass-spectrum 46 Hình 2.1 Vườn Ngải cứu nhánh Ngải cứu khơ 48 Hình 2.2 Bộ chưng cất lôi nước Clevenger 50 Hình 2.3 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước 51 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chưng cất thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương viii pháp chưng cất lôi nước 52 Hình 3.1 Đồ thị thể ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 66 Hình 3.2 Đồ thị thể ảnh hưởng tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 67 Hình 3.3 Đồ thị thể ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 68 Hình 3.4 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 69 Hình 3.5 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 71 Hình 3.6 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian để héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 72 Hình 3.7 Đồ thị thể ảnh hưởng hàm lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 73 Hình 3.8 Tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 73 Hình 3.9 Kết kháng E.coli 78 Hình 3.10 Kết kháng Staphylococcus aureus 79 Hình 3.11 Kết kháng Salmonella 80 Hình 3.12 Kết kháng Shigella boydii 81 ix [13] Tôn Nữ Minh Nguyệt cộng sự, 2010 Chất kháng khuẩn thực vật, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh [14] Lê Thị Thanh Thảo cộng sự, 2018 Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật chống oxy hóa thuộc họ Asteraceae Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, phụ tập 22, số 1, 2018 2.Tài liệu tiếng Anh [15] Juvatkar PV, Kale MK., Jalalpure SS, Waghulde Sandeep, Naik Pravin, Jain Vishal, Antimicrobial activity of Leaves of Artemisia vulgaris L, USC.ES [16] Sujatha Govindaraj and Bollipo D RanjithaKumari, Composition and Larvicidal Activity of Artemisia vulgaris L Stem Essential Oil Against Aedes aegypti, Jordan Journal of Biological Sciences, Volume 6, Number 1, March 2013, Pages 11 – 16 [17] Garza I, Swanson J W Prophylaxis of migraine Neuropsychiatr Dis Treat 2006 September; 2(3): 281–291 [18] Asakura K, Kanemasa T, Minagawa K, et al 2000 Alpha-eudesmol, a P/Q-type Ca2+ channel blocker, inhibits neurogenic vasodilation and extravasation following electrical stimulation of trigeminal ganglion Brain Res, 873:94–101 [19] Tsuneki H, Ma EL, Kobayashi S, Sekizaki N, Maekawa K, Sasaoka T, Wang MW, Kimura I Antiangiogenic activity of beta-eudesmol in vitro and in vivo Eur J Pharmacol 2005 Apr 11;512(2-3):105-15 [20] Ma EL, Li YC, Tsuneki H, Xiao JF, Xia MY, Wang MW, Kimura I Beta-eudesmol suppresses tumour growth through inhibition of tumour neovascularisation and tumour cell proliferation J Asian Nat Prod Res 2008 Jan-Feb;10(1-2):159-67 [21] Chiou L C., Chang C C Antagonism by β-eudesmol of neostigmineinduced neuromuscular failure in mouse diaphragms European journal of pharmacology ISSN 0014-2999 1992, vol 216, no2, pp 199-206 94 [22] Chiou LC, Ling JY, Chang CC beta-Eudesmol as an antidote for intoxication from organophosphorus anticholinesterase agents Eur J Pharmacol 1995 Jan 13;292(2):151-6 [23] Mugwort (Artemisia vulgaris) Oils Chapter | 65 579 Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, First Edition, 2016, 573-579 [24] Alizade M., Aghaei M., Saadatian M., Sharifian I Chemical composition of essential oil of Artemisia vulgaris from West Azerbaijan, Iran Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 2012 [25] Asta, J., Juste, B., 2006 Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L (Mugwort) from North Lithuania Chemistry 1, 12– 15 [26] Bamoniri, A., Mirjalili, B.B.F., Mazoochi, A., Batooli, H., 2010 Chemical composition of Artemisia vulgaris L from Kashan area isolated by nano scale injection Iran J Org Chem (4), 533–536 [27] Barney, J.N., Hay, A.G., Weston, L.A., 2005 Isolation and characterization of allelopathic volatiles from Mugwort (Artemisia vulgaris) J Chem Ecol 31 (2), 247–265 [28] Bhatt, L.R., Lee, J.S., Baek, S.H., 2007 Evalution of antioxidant activity of essential oil from Artemisia vulgaris Korean J Orient Physiol Pathol 21 (2), 528–531 [29] Blagojevic, P., Radulovic, N., Palic, R., Stojanovic, G.J., 2006 Chemical composition of the essential oil of Serbian wild-growing Artemisia absinthium and Artemisia vulgaris J Agric Food Chem 54, 470–478 [30] Erel, S.B., Reznicek, G., Senol, S.G., Yavasogulu, N.U.K., Konyalioglu, S., Zeybek, A.U., 2012 Antimicrobial and antioxidant properties of Artemisia L species from western Anatolia Turk J Biol 36, 75–84 95 [31] Gilani, A.H., Yaeesh, S., Jamal, Q., Ghayur, M.N., 2005 Hepatoprotective activity of aqueous-methanol extract of Artemisia vulgaris Phytother Res 19, 170–172 [32] Govindaraj, S.P., Kumari, B.D.R., 2013 Composition and larvicidal activity of Artemisia vulgaris L stem essential oil against Aedesaegypti Jordan J Biol Sci (1), 11–16 [33] Gruenwald, J., Brendler, T., Jaenicke, C., 2008 PDR of Herbal Medicine, fourth ed Medical Economics Company [34] Haider, F., Dwivedi, P.D., Naqvi, A.A., Bagchi, G.D., 2003 Essential oil composition of Artemisia vulgaris harvested at different growth periods under Indo-Gangetic plain conditions J Essent Oil Res 15, 376–378 [35] Harimath, S.K., Kolume, D.G., Muddapur, U.M., 2011 Antimicrobial activity of Artemisia vulgaris Linn (Damanaka) Int J Res Ayurveda Pharm (6), 1674–1675 [36] Hussain, A.I., Anwar, F., Sherazi, S.T.H., Przybylski, R., 2008 Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depend on seasonal variations Food Chem 108, 986–995 [37] Jerkovic, I., Mastelic, J., Milos, M., Juteau, F., Masotti, V., Viano, J., 2003 Chemical variability of Artemisia vulgaris L essential oils originated from the Mediterranean area of France and Croatia Flavour Fragr J 18, 436–440 [38] Judzentiene, A., Buzelyte, J., 2006 Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L (Mugwort) from plants grown in North Lithuania Chemistry 17 (1), 12–15 [39] Mucciarelli, M., Caramiello, R., Maffei, M., 1995 Essential oils from some Artemisia species growing spontaneously in North-West Italy Flavour Frag J 10, 25–32 96 [40] Pino, J.A., Rohlado, A., Fuentcs, V., 1999 Composition of the essential oil of Artemisia vulgaris L herb from Cuba J Essent Res 11, 477–478 [41] Sharifian, I., Hashemi, S.M., Darvishzadeh, A., 2013 Fumigant toxicity of essential oil of Mugwort (Artemisia vulgaris L.) against three major stored product beetles Arch Phytopathol PFL 46 (4), 445–450 [42] Silva, T.D.J.A., 2004 Mining the essential oils of the Anthemideae Afr J Biotechnol (12), 706–720 [43] Sun, W.C., Han, J.X., Yang, W.Y., Deng, D.A., Yue, X.F., 1992 Antitumor activities of derivatives of artemisic acid and artemisinin B in vitro Acta Pharm Sin 13, 541–543 [44] Surburg, H., Panten, J., 2006 Common Fragrance and Flavor Materials Preparation, Properties and Uses, fifth ed Wiley-VCH, Weinheim ISBN: 978-3-527-31315-0 [45] Tang, W., Eisenbrand, G., 2011 Handbook of Chinese Medicinal Plants: Chemistry, Pharmacology, Toxicology, vol Wiley VCH, Weinheim ISBN: 978-3-527-32226-8 [46] Thao, N.T.P., Thuy, N.T., Hoi, T.M., Muselli, T.H.T.A., Bighelli, A., Castola, V., Casanova, J., 2004 Artemisia vulgaris L from Vietnam: chemical variability and composition of the oil along the vegetative life of the plant J Essent Oil Res 16, 358–361 [47] Tigno, X.T., Guzman, F.D., Flora, A.M.T.V., 2000 Phytochemical analysis and hemodynamic actions of Artemisia vulgaris L Clin Hemorheol Micro-circ 23, 167–175 [48] Tobyn, G., Denham, A., Whitelegg, M., 2011 The Western Herbal Tradition: 2000 Years of Medicinal Plant Knowledge Elsevier Churchil Livingstone ISBN: 978-0-443-10344-5 pp 123 [49] Walter, H.L., Memory, P.F.E.L., 2003 Medical Botany: Plants Affecting Human Health, second ed John Wiley and Sons, New York ISBN: 978-0-471-62882-8 pp 345 97 [50] Wang, J., Zhu, F., Zhou, X.M., Niu, C.Y., Lei, C.L., 2005 Repellent and fumigant activity of essential oil from Artemisia vulgaris to Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) J Stored Prod Res 42, 339–347 [51] Willcox, M., 2009 Artemisia species: from traditional medicines to modern antimalarial and back again J Altern Complem Med 15, 101– 109 [52] Wright, C.W., 2002 Artemisia: Medicinal and Aromatic Plantsindustrial Profiles Taylor and Francis, New York ISBN: 978-0-41527212-4 [53] Yoshikawa, M., Shimada, H., Matsuda, H., Yamahara, J., Murakami, N., 1996 Bioactive constituents of Chinese natural medicines Chem Pharm Bull 44 (9), 1656–1662 [54] Govindaraj S, Kumari BD, Cioni PL, Flamini G Mass propagation and essential oil analysis of Artemisia vulgaris J Biosci Bioeng, 2008 Mar; 105 (3): 176-83 Tài liệu Internet [55] Chi cục thú y TP Hồ Chí Minh, Ngộ độc thực phẩm vi khuẩn E coli, 6/2012, http://chicucthuyhcm.org.vn/new/2005/09/23/Ngo-doc-thuc-pham-do-vikhuan-Ecoli.aspx [56] Đại Học Y Thái Bình, Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp, 5/2012, http://thuvien.yhvn.vn/node/1030 http://thuvien.yhvn.vn/node/1029 http://thuvien.yhvn.vn/node/1012 [57] https://vi.wikipedia.org/wiki/Ngải_cứu 98 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần chất môi trường cách pha số dung dịch thử Dung dịch chuẩn độ KOH 0,1 N Cân khoảng 0,56 g KOH rắn, hòa tan 100 ml ethanol 96o, ta dung dịch KOH cồn nồng độ khoảng 0,1 N Mơi trường tăng sinh NB Cân xác g mơi trường Peptone, g mơi trường Beef extract (có thể thay g môi trường Meat extract), 15 g muối NaCl Hịa 23 g mơi trường Nutrient Broth 1000 ml nước cất vô trùng Đun sôi, khuấy khử trùng nồi hấp 121°C 15 phút PH cuối 7,0 ± 0,2 Môi trường cấy kháng khuẩn NA Cân xác g mơi trường Peptone, g mơi trường Beef extract (có thể thay g môi trường Meat extract), 15 g muối NaCl 15 g Agar Hòa 38 g môi trường Nutrient Agar 1000 ml nước cất vô trùng Đun sôi, khuấy khử trùng nồi hấp 121°C 15 phút PH cuối 7,0 ± 0,2 Phụ lục 2: Xử lý thống kê yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu q trình chưng cất phương pháp lơi nước Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng kích cỡ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu nhận sau 3h chưng cất Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Model 0.18920267 0.09460133 124.49 Error 0.00455933 0.00075989 Corrected Total 0.19376200 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.976469 9.672310 0.027566 0.285000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.18920267 0.09460133 124.49 F F Model 0.04420417 0.04420417 30.24 0.0053 Error 0.00584667 0.00146167 Corrected Total 0.05005083 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.883185 10.62485 0.038232 0.359833 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.04420417 0.04420417 30.24 0.0053 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.001462 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.0867 t Grouping Mean N NT A 0.44567 B1 B 0.27400 B2 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu nhận sau 3h chưng cất Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Model 0.13765667 0.04588556 94.51 Error 0.00388400 0.00048550 Corrected Total 11 0.14154067 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.972559 7.935437 0.022034 0.277667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.13765667 0.04588556 94.51 F F NT 0.15263756 0.07631878 112.29 F F F NT 0.30299363 0.04328480 15.75 F NT 0.21357667 0.07119222 131.23 F F 0.0002 Corrected Total 0.07865089 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.937920 8.945683 0.028527 0.318889 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.07376822 0.03688411 45.32 0.0002 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.000814 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.057 t Grouping Mean N NT A 0.44567 G2 B 0.27100 G3 B B 0.24000 G1 Phụ lục 3: Xử lý thống kê kết mức độ kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu nhóm vi sinh vật thị Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 308.4000000 77.1000000 105.14 F NT 308.4000000 77.1000000 105.14 F Model 283.3333333 70.8333333 177.08 F NT 283.3333333 70.8333333 177.08 F Model 95.33333333 23.83333333 119.17 F NT 95.33333333 23.83333333 119.17 F Model 348.4000000 87.1000000 118.77 F NT 348.4000000 87.1000000 118.77