Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu từ cây ngải cứu (artemisia vulgaris l ) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN Q TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU TỪ CÂY NGẢI CỨU (ARTEMISIA VULGARIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực : Phan Phú Thắng MSSV: 1411100415 Lớp: 14DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2018 CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn TS Trịnh Thị Lan Anh Các số liệu, kết trình bày Đồ án trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác TP.HCM, ngày 31 tháng năm 2018 Sinh viên thực Phan Phú Thắng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể Quý Thầy, Cô Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công Nghệ TP.HCM giảng dạy trang bị cho em kiến thức bản, tạo điều kiện thuận lợi để em có hội tiếp cận với môi trường làm việc thực tế qua thời gian học tập đầy ý nghĩa Đồng thời nhà trường tạo cho em có hội làm việc, cho em bước đời sống thực tế để áp dụng kiến thức mà thầy cô giảng dạy Qua đề tài tốt nghiệp em nhận nhiều điều mẻ bổ ích để giúp ích cho công việc sau thân Đặc biệt, em xin gởi đến cô TS.Trịnh Thị Lan Anh, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hồn thành đề tài đồ án tốt nghiệp lời cảm ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy, Cơ, Ban Lãnh Đạo, phòng ban tạo điều kiện thuận lợi cho em tìm hiểu thực tiễn suốt q trình làm đề tài phòng thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn thầy, cô, anh, chị làm việc Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn, hướng dẫn cho em cách làm việc, ghi công việc rõ ràng cụ thể để thuận lợi cho việc làm việc nhóm báo cáo cơng việc Vì kiến thức thân hạn chế, q trình làm việc hồn thiện đề tài em khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ q thầy, cơ, anh, chị Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, tạo điều kiện giúp em có hội học tập nâng cao kĩ thân Chúc Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM phát triển ngày trở thành nơi tin cậy nhiều sinh viên TP.HCM, ngày 31 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực Phan Phú Thắng ii MỤC LỤC CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC BẢNG x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Ngải cứu 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Giới thiệu họ Cúc (Asteraceae) chi ngải (Artemisia) 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.4 Công dụng dược lý Ngải cứu 10 1.2 Giới thiệu tinh dầu 11 1.2.1 Khái niệm tinh dầu 11 1.2.2 Phân bố tinh dầu thiên nhiên 12 1.2.3 Q trình tích luỹ tinh dầu 12 1.2.4 Tính chất vật lý tinh dầu 13 1.2.5 Tính chất hố học tinh dầu Ngải cứu 14 1.2.6 Ảnh hưởng nhân tố khác đến thành phần tính chất tinh dầu Ngải cứu 16 1.2.7 Ứng dụng tinh dầu Ngải cứu ngành công nghiệp 18 1.2.8 Nguyên tắc sản xuất tinh dầu 18 1.2.9 Nguyên tắc trích ly tinh dầu 18 1.2.10.Các phương pháp trích ly tinh dầu 19 1.3 Giới thiệu phương pháp chưng cất lôi nước 24 1.3.1 Nguyên lý hoạt động phương pháp chưng cất lôi nước 25 1.3.2 Giới thiệu ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu 26 iii 1.4 Khả kháng khuẩn chế kháng khuẩn hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 27 1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 27 1.4.2 Các chế kháng khuẩn 27 1.4.3 Một số nhóm hợp chất alkaloid thực vật 29 1.4.4 Một số nhóm hợp chất glycoside thực vật 31 1.4.5 Nhóm tinh dầu 33 1.5 Giới thiệu chủng vi khuẩn gây bệnh 34 1.5.1 Staphyllococcus aureus 34 1.5.2 Escherichia coli (E.coli) 36 1.5.3 Shigella 38 1.5.4 Salmonella 39 1.6 Giới thiệu tình hình nghiên cứu khả kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu loại tinh dầu khác từ thực vật 41 1.6.1 Khả kháng vi sinh vật tinh dầu Ngải cứu 41 1.6.2 Khảo sát khả kháng vi sinh vật tinh dầu tần dày 41 1.7 Sắc ký khí ghép khối phổ số ứng dụng (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) 42 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đề tài 48 2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài 48 2.1.2 Thời gian thực 48 2.2 Vật liệu 48 2.2.1 Nguyên liệu 48 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 49 2.2.3 Hóa chất 50 2.3 Phương pháp nghiên cứu 51 2.3.1 Tiến hành trích ly tinh dầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng 52 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 53 iv 2.3.3 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu 58 2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn 62 2.4 Thống kê xử lý số liệu 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 65 3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 65 3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng tuổi nguyên liệu (lá non, già) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 67 3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 68 3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng thời gian ngâm dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 70 3.1.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 71 3.1.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 74 3.1.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 75 3.2 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu 77 3.2.1 Đánh giá cảm quan 77 3.2.2 Định lượng tinh dầu Ngải cứu 77 3.2.3 Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu 78 3.2.4 Chỉ số hóa học tinh dầu Ngải cứu 79 3.2.5 Độ hòa tan ethanol 79 3.3 Kết xác định thành phần hóa học tinh dầu 80 v 3.4 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 83 3.4.1 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 83 3.4.2 Hoạt tính kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 85 3.4.3 Kết hoạt tính kháng Salmonella typhimurium tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 87 3.4.4 Hoạt tính kháng Shigella boydii tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 89 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 4.1 Kết luận 92 4.2 Kiến nghị 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxyde DNA : Deoxyribonucleic Acid E.Coli : Escherichia coli GC : Gas chromatography MS : Mass spectrometry NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth PABA : 4-Aminobenzoic acid RNA : Ribonucleic Acid SAS : Statistical Analysis Systems TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TCVS : Tiêu chuẩn vi sinh TSA : Trypticase Soy Agar TSB : Trypticase Soy Broth vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) Hình 1.2 Một số thuộc chi Ngải Hình 1.3 Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) Hình 1.4 Cấu trúc 3D phân tử camphor 14 Hình 1.5 Cấu trúc 3D phân tử eucalyptol 15 Hình 1.7 Cấu trúc 3D phân tử α-pinene 15 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử β-eudesmol 16 Hình 1.8 Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol 16 Hình 1.9 Máy ép tinh dầu 19 Hình 1.10 Hệ thống chưng cất lôi nước 20 Hình 1.11 Hệ thống chưng cất nước hỗ trợ vi sóng 23 Hình 1.12 Hệ thống chưng cất lơi nước nguyên lý hoạt động 25 Hình 1.13 Những vị trí vi khuẩn bị tác động hợp chất thực vật 28 Hình 1.14 Cấu trúc Morphine 29 Hình 1.15 Cấu trúc Quinine 30 Hình 1.16 Sơ đồ phân loại saponin 32 Hình 1.17 Staphyllococcus aureus 35 Hình 1.18 Vi khuẩn E.coli 36 Hình 1.19 Vi khuẩn Shigella 38 Hình 1.20 Vi khuẩn Salmonella 39 Hình 1.21 Sắc đồ sắc ký khí 44 Hình 1.22 Mơ hình khối phổ 45 Hình 1.23 Mass-spectrum 46 Hình 2.1 Vườn Ngải cứu nhánh Ngải cứu khơ 48 Hình 2.2 Bộ chưng cất lôi nước Clevenger 50 Hình 2.3 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước 51 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chưng cất thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương viii pháp chưng cất lôi nước 52 Hình 3.1 Đồ thị thể ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 66 Hình 3.2 Đồ thị thể ảnh hưởng tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 67 Hình 3.3 Đồ thị thể ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 68 Hình 3.4 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 69 Hình 3.5 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 71 Hình 3.6 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian để héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 72 Hình 3.7 Đồ thị thể ảnh hưởng hàm lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 73 Hình 3.8 Tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 73 Hình 3.9 Kết kháng E.coli 78 Hình 3.10 Kết kháng Staphylococcus aureus 79 Hình 3.11 Kết kháng Salmonella 80 Hình 3.12 Kết kháng Shigella boydii 81 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 65 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 66 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 67 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm nguyên liệu dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 68 Bảng 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 70 Bảng 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 71 Bảng 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng lượng nước chưng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu 72 Bảng 3.8 Kết định lượng tinh dầu Ngải cứu 74 Bảng 3.9 Kết xác định tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu 74 Bảng 3.10 Kết xác định số hóa học tinh dầu Ngải cứu 75 Bảng 3.11 Kết xác định độ hòa tan tinh dầu Ngải cứu ethanol 75 Bảng 3.12 Kết xác định thành phần hóa học hàm lượng tương đối hợp chất mẫu tinh dầu Ngải cứu phương pháp GC – MS 76 Bảng 3.13 Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu 77 Bảng 3.14 Kết kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu 78 Bảng 3.15 Kết kháng Salmonella typhimurium tinh dầu Ngải cứu 79 Bảng 3.16 Kết kháng Shigella boydii tinh dầu Ngải cứu 80 x MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài 1.1 Đặt vấn đề Cùng với phát triển ngành cơng nghiệp tổng hợp hữu cơ, thuốc tổng hợp có nhiều đóng góp hữu ích việc cung cấp thuốc trị bệnh, giá thành rẻ người ưa chuộng Tuy nhiên, có mặt xấu song song với nó, có q nhiều tác dụng phụ q trình sử dụng thuốc tổng hợp, thấy rõ tượng kháng kháng sinh vấn đề nóng y học đại Vì lẽ giới có xu hướng quay sử dụng thuốc có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Nền y học dân gian dùng cỏ để trị bệnh hình thức chữa bệnh cổ xưa nhân loại, có từ hàng ngàn năm trước Việt Nam nước có y học cổ truyền sử dụng nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên để chữa bệnh từ lâu nhiều bạn bè nước biết đến Do điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Việt Nam nằm vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên hệ thực vật phong phú đa dạng, nguyên nhân tạo nên nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo với nhiều thuốc quý đầy đủ chủng loại số lượng Nhưng nhiều năm trở lại đây, có số nhận định từ số nhà khoa học, bác sĩ: “Người Việt ngõ gặp thuốc, lại chết đống thuốc”, phải nhận định ám cho chúng ta: “Tại khơng chịu tìm hiểu học cách sử dụng thảo dược để chữa bệnh?” Trong trình nghiên cứu kháng sinh thực vật, người ta đặc biệt quan tâm đến tinh dầu Tinh dầu có nhiều đặc tính sinh học dược học cao, có khả kháng khuẩn, kháng nấm sử dụng việc tạo số loại chế phẩm để làm thuốc Trong nhiều lồi thực vật chiết xuất tinh dầu chanh, sả, quế, bạc hà,… Ngải cứu nguyên liệu quan tâm cần phải đề cập đến 1.2 Tầm quan trọng đề tài Ngải cứu có tên thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải, sú, cỏ linh li, tên khoa học Artemisia vulgaris, loài thực vật thuộc họ Cúc có sẵn, dễ tìm, thu hoạch quanh năm có tiềm to lớn để sản xuất tinh dầu kháng sinh tự nhiên Từ lâu, Ngải cứu biết đến qua nhiều thuốc dân gian với công dụng đặc trưng bổ huyết, điều kinh hay sống thường ngày Ngải cứu dùng để nấu canh, làm rau sống ăn kèm để tăng thêm vị Đặc biệt việc nghiên cứu tách chiết hợp chất có dược tính từ tinh dầu Ngải cứu thử hoạt tính sinh học vấn đề mẻ, chưa quan tâm nghiên cứu nhiều Tinh dầu sản xuất từ thân, nhiều phương pháp: phương pháp học, phương pháp trích ly dung mơi dễ bay khơng bay hơi, phương pháp trích ly CO2, phương pháp vi sóng, phương pháp sinh học, Ngồi ra, phương pháp trích ly tinh dầu phổ biến phương pháp chưng cất lôi nước Ưu điểm phương pháp chưng cất lôi nước quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản, thiết bị gọn, dễ chế tạo, khơng đòi hỏi vật liệu phụ phương pháp tẩm trích, hấp thụ, thời gian tương đối nhanh, thu tinh dầu bị lẫn tạp chất, giữ nguyên mùi vị thiên nhiên ban đầu thành phần tinh dầu bị biến đổi Do đó, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly tinh dầu từ Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) phương pháp chưng cất lôi nước, xác định thành phần hóa học khảo sát hoạt tính kháng khuẩn” nhằm bước đầu tìm hiểu, khảo sát thành phần hóa học ứng dụng Ngải cứu từ nâng cao hiệu sử dụng loại 1.3 Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa mặt kinh tế đề tài Tạo nhiều sản phẩm từ tinh dầu Ngải cứu thiên nhiên Có giá thành rẻ, mà lại có ứng dụng nhiều đời sống an toàn Nâng cao giá trị kinh tế Ngải cứu, tạo nhiều sản phẩm có giá trị cao từ tinh dầu Ngải cứu, đáp ứng nhiều lĩnh vực đời sống, an toàn, giúp cải thiện nguồn kinh tế cho người dân Ý nghĩa mặt xã hội Tạo nhiều sản phẩm có chứa tinh dầu thị trường chưa có Tinh dầu Ngải cứu thay phần loại hóa chất độc hại loại kháng sinh thương mại thị trường Ý nghĩa mặt sức khỏe Đối với Tây Y Ngải cứu dược liệu sử dụng rộng rãi với thành phần hóa học đa dạng tập trung phận khác cụm hoa, chứa tinh dầu, flavonoid, phenolic,… Bên cạnh đó, Ngải cứu có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, gây độc tế bào ung thư, dùng bệnh lý huyết áp, hen suyễn có tác dụng bảo vệ gan Trong y học đại, Ngải cứu sử dụng hỗ trợ cân hệ probiotic đường ruột, giúp làm giảm táo bón, loại bỏ giun ký sinh trùng đường ruột Ngồi số hoạt chất Ngải cứu giúp kháng viêm đặc biệt qua nhiều nghiên cứu Ngải cứu có chứa hoạt chất artemisinin có tác dụng chữa sốt rét Đối với Đơng Y Trong Đơng y Ngải cứu có tính hàn, vị cay, dùng làm thuốc ơn khí huyết, trục hàn thấp, điều kinh, an thai, dùng chữa đau bụng hàn, kinh nguyệt không đều, thai động không yên, thổ huyết, máu cam Ý nghĩa thực phẩm - mỹ phẩm Xay nhuyễn thành bột để làm bột gia vị ngũ vị hương, hồi, quế… Làm se da, sáng da, tẩy tế bào chết kháng khuẩn, kháng nấm, giảm thâm nám Được sử dụng nguyên liệu số ăn phổ biến miền Bắc Việt Nam như: Trứng rán Ngải cứu, bánh ngải,… Tình hình nghiên cứu Hiện nay, nghiên cứu tinh dầu Ngải cứu ít, chủ yếu tập trung vào phân tích thành phần hóa học, dược tính, hoạt tính dịch chiết Ngải cứu phối chế với loại dược liệu, thực vật khác Theo Đỗ Tất Lợi (2004), ngải cứu có tinh dầu, tannin, thành phần chủ yếu tinh dầu ngải cứu cineole α-thujone Tinh dầu Ngải cứu có tính chất làm kích thích cho say α-thujone có tác dụng hưng phấn, lại có tác động mạnh đến hệ thần kinh, dùng liều gây điên cuồng Năm 1979, nghiên cứu Trung Quốc cho thấy tác dụng chữa bệnh sốt rét loài Thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L.), từ nghiên cứu Đinh Huỳnh Kiệt, Nguyễn Xuân Dũng cộng (1989; 1990) Thanh cao hoa vàng dại cho kết sau:  Có khoảng 0,6 % tinh dầu  Tỷ trọng d25 0,9011  Tinh dầu màu vàng nhạt, gồm 35 thành phần nhận dạng khoảng 20 chất với 12 cấu tử chiếm 73% tổng hàm lượng tinh dầu Tinh dầu Ngải cứu có hoạt tính kháng khuẩn, cụ thể vi khuẩn Staplylococcus aureus Staphylococcus epidermidis đường kính vòng kháng 23 mm 13 mm Ở chủng Salmonella typhimurium đường kính vòng kháng mm chủng E.coli vòng kháng có đường kính 11 mm (Erel et al., 2012) Mới tác giả Lê Thị Thanh Thảo cộng (2018) tinh dầu Ngải cứu có tính kháng mạnh với chủng Staphylococcus aureus với đường kính vòng kháng 23 mm, ngồi tinh dầu có hoạt tính kháng chủng nấm men Candida Điều chứng tỏ tiềm tinh dầu Ngải cứu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng nấm Nghiên cứu khả đánh bắt gốc tự DPPH tinh dầu có, nhiên lại yếu nhiều so với cao chiết Mục đích nghiên cứu  So sánh hàm lượng tinh dầu loại Ngải cứu: già, non  Xác định điều kiện tối ưu việc trích ly tinh dầu, xác định yếu tố ảnh hưởng đến việc trích ly tinh dầu  Xác định thành phần hóa học tinh dầu Ngải cứu TP HCM  Xác định hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu chủng vi sinh vật (Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureaus, E.coli, Shigella boydii) Nhiệm vụ nghiên cứu  Nghiên cứu sở lý luận thực tiễn đề tài  Tiến hành thực nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng đến khả thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước  Định danh định lượng thành phần hóa học tinh dầu Ngải cứu phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)  Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Ngải cứu phương pháp khuyết tán đĩa thạch Phương pháp nghiên cứu  Nghiên cứu lý thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu  Phương pháp tách chiết tinh dầu: phương pháp chưng cất lôi nước trực tiếp sử dụng chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger  Phương pháp sinh hóa: thử hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu chủng vi khuẩn : Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella boydii  Xử lý số liệu phần mềm SAS 9.1 Excel 2016 ® Các kết đạt đề tài  Tối ưu hóa quy trình trích ly tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước  Định danh định lượng thành phần hóa học có tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS  Thử hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu chủng vi khuẩn: Salmonella typhimuirium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella boydii Kết cấu Đồ án tốt nghiệp Đồ án gồm chương:  Chương 1: Tổng quan tài liệu Tổng quan Ngải cứu, khái niệm tinh dầu, nguyên tắc sản xuất ly trích tinh dầu Giới thiệu chủng vi khuẩn khả kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu  Chương 2: Vật liệu phương pháp Giới thiệu nguyên liệu, dụng cụ thiết bị sử dụng Thiết kế thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trích ly tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước Các phương pháp xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu đánh giá hoạt lực kháng khuẩn tinh dầu  Chương 3: Kết thảo luận  Chương 4: Kết luận kiến nghị CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Ngải cứu 1.1.1 Vị trí phân loại Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) thuộc: Giới (regnum) : Plantae Ngành (division) : Angiospermae Lớp (class) : Eudicot Phân lớp (subclass) : Asterids Bộ (ordo) : Asterales Họ (familia) : Asteraceae Chi (genus) : Artemisia Loài (species) : A vulgaris Ngải cứu có tên khoa học là: Artemisia vulgaris L., Mugwort Tên thông thường là: thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải, sú, cỏ linh li Hình 1.1: Hình ảnh Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) 1.1.2 Giới thiệu họ Cúc (Asteraceae) chi ngải (Artemisia) Họ Cúc (Asteraceae) gồm 115 chi với khoảng 325 loài, phần lớn dạng thân cỏ, đơn, mọc cách mọc đối Hoa lưỡng tính hay đơn tính, mọc đều, đối xứng bên Họ Cúc có nhiều giá trị kinh tế Nhiều loại trồng rộng rãi làm cảnh thược dược (Dahlia pinnata), loại cúc vàng, cúc trắng thuộc chi Chrysanthenum làm thuốc trừ sâu Một số dùng làm rau rau diếp (Lactuca indica), rau khúc tẻ (Gnaphalium affine), rau khúc nếp (G polycaulon), có dầu hướng dương (Helianthus annuus), làm thuốc Ngải cứu (Artemisia vulgaris), chữa bệnh sốt rét hao hoa vàng (A annua) Chi ngải (Artemisia) chi lớn họ Cúc với khoảng 185 loài, thường thân thảo hay bụi , có mùi tinh dầu đặc trưng Mơi trường sinh sống khô hay bán khô thường khu vực nhiệt đới ôn đới bắc bán cầu Lá ngải tương tự dương xỉ, thường có nhiều lơng trắng nhỏ bao phủ Ở Việt Nam, có bốn lồi thuộc chi ngải ngải cao (A carvifolia), ngải hoa vàng (A annua), ngải đắng (A absinthium) Ngải cứu (A vulgaris) Hình 1.2 Một số thuộc chi Ngải a Ngải Thanh Cao (A carvifolia) b Ngải Hoa Vàng (A annua) c Ngải Đắng (A absinthium) d Ngải cứu (A vulgaris) 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố Ngải cứu gọi thuốc cứu, thuốc cao, ngải điệp Tên khoa học: Artemisia vulgaris L., thuộc họ Cúc (Asteraceae) Hình 1.3 Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) Thân: thân cỏ, sống lâu năm, cao khoảng m Thân thẳng có rãnh dọc màu tía nhạt, cành non có lơng Lá: xẻ nhiều kiểu từ xẻ lông chim đến xẻ thùy theo đường gân lá, mặt nhẵn màu nâu đậm, mặt trắng xanh có nhiều lơng màu trắng, mọc so le, khơng có cuống (nhưng phía thường có cuống), vò nát có mùi hắc, vị đắng Hoa: thường có vào tháng – 9, hoa có màu vàng lục nhạt màu đỏ nhạt, mọc thành chùy kép, dài từ – 10 cm, đứng nách lá, hoa hình đầu rộng từ – mm bao gồm loại hoa hình ống: hoa hoa lưỡng tính Quả bế khơng có mào lơng Ngải cứu miền Âu, Á ôn đới Cây phát triển vùng có nhiều cỏ dại, vùng đất giàu nitơ vùng bỏ hoang nơi có nhiều ánh nắng, vùng đất khơng canh tác, ven đường bờ dậu Mọc hoang nhiều nơi nước ta mọc nhiều nước khác Cây trồng nhiều nơi qui mô nhỏ vườn thuốc vườn gia đình từ vùng thấp đến vùng cao 1.1.4 Công dụng dược lý Ngải cứu Ở vài nước phương đông, người ta sử dụng lượng lớn Ngải cứu thực phẩm sử dụng trà, tạo mùi vị dễ chịu cho số loại bánh Ở phương tây, người ta sử dụng để nấu từ gia cầm, thịt heo, sử dụng để ủ bia Phổ biến hơn, Ngải cứu dùng châm cứu bấm huyệt giúp lưu thông huyết mạch, thư giãn xóa tan căng thẳng mệt mỏi Trước đây, người ta sử dụng Ngải cứu phương thuốc chống mệt mỏi cho đơi chân khớp gối, ngồi giúp khử mùi cho đơi giày giống quế Người dân nước phương tây dùng Ngải cứu loại trà tăng lực, khoảng – tách trà ngày gồm 150 ml nước nóng từ đến g Ngải cứu khô ngâm ngập nước khoảng phút dùng trước bữa ăn để tăng vị chống đầy Rễ Ngải cứu sử dụng để bổ huyết, an thần, trị chứng ngủ ứng dụng làm thuốc ngừa thai Người Ấn Độ sử dụng Ngải cứu làm trà tăng lực Bên cạnh Ngải cứu dùng để làm thuốc trị co thắt, long đờm, ho gà chứng bệnh đường ruột tiết niệu Đông y coi Ngải cứu vị thuốc có tính hàn thấp, điều kinh, an thai, dùng chữa đau bụng hàn, kinh nguyệt khơng đều, khí hư, động thai, ngăn chặn sảy thai, băng huyết, chảy máu cam, lỵ máu, nôn mửa, đau dây thần kinh, thấp khớp, ghẻ lở, thổ huyết Ngồi giúp tiêu hóa, trị giun, kháng sinh, sốt rét, chữa rối loạn kinh nguyệt, dùng trị lạnh bụng, đau dày, đau khớp, eczema, ngứa Một số thuốc từ Ngải cứu Mùa hè, từ sau ngày hạ chí, thời tiết bắt đầu có thay đổi thất thường, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe Đây thời điểm bùng phát nhiều loại bệnh, cơng thể gây phiền phức cho nhiều nhóm người Đơng y có câu nói tiếng "Mùa hè chữa bệnh mùa Đơng", với ý rằng, mùa nóng khơng cần chăm sóc sức khỏe tốt để vượt qua thời tiết, mà phải chăm dưỡng sinh để chuẩn bị sức khỏe cho mùa đông lạnh giá, khắc nghiệt 10 Một giải pháp phòng chữa bệnh tiếng Đơng y ngâm chân Có lẽ khơng cần nhấn mạnh biết tác dụng việc ngâm chân sức khỏe Quan trọng hơn, việc ngâm chân với Ngải cứu – thứ quen thuộc, phổ biến dễ dàng mua mang lại nhiều tác dụng xưa nghĩ Lá Ngải cứu Đơng y gọi Ngải khao, vốn loài rau dại sau nghiên cứu sử dụng loại dược liệu quý, gọi "rau bậc Danh y" Ngải cứu người dân Châu Á sử dụng phổ biến đời sống hàng ngày Theo Đông y, Ngải cứu có vị đắng, cay, ấm, ăn tác động vào kinh mạch tỳ, gan thận Nghiên cứu cho thấy Ngải cứu làm giảm hàn trừ ẩm, ấm kinh cầm máu Rất phù hợp dùng cho người hay bị máu, đau bụng, đau bụng kinh, tử cung chảy máu, bệnh phụ khoa khác 1.2 Giới thiệu tinh dầu 1.2.1 Khái niệm tinh dầu Tinh dầu hỗn hợp chất hữu tan lẫn vào nhau, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu Cần phân biệt rõ tinh dầu với dầu béo (hỗn hợp triglicerid) dầu mỏ (hỗn hợp hydrocarbon) Rất khó khăn có định nghĩa tuyệt đối xác cho tinh dầu Về mặt thực hành, tinh dầu “một hỗn hợp thiên nhiên có mùi, phần lớn có nguồn gốc từ thực vật” Tinh dầu thường thể lỏng nhiệt độ phòng, bay hồn tồn mà không bị phân hủy Trong thiên nhiên, nhiều tinh dầu trạng thái tự do, có số trạng thái tiềm tàng Ở trạng thái tiềm tàng, tinh dầu khơng có sẵn ngun liệu mà xuất điều kiện gia công định trước tiến hành ly trích Còn trạng thái tự do, tinh dầu sẵn nguyên liệu thu trực tiếp điều kiện ly trích bình thường (Abegaz et al., 1983) 11 1.2.2 Phân bố tinh dầu thiên nhiên Các loại có tinh dầu phân bố rộng thiên nhiên Kết thống kê cho thấy có khoảng 2.500 lồi có chứa tinh dầu Trữ lượng tinh dầu phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Cây mọc vùng nhiệt đới có trữ lượng tinh dầu cao vùng ôn đới Ngay cây, thành phần lượng tinh dầu phận khác khác Ngoài lượng tinh dầu thu phụ thuộc vào điều kiện, phương pháp thu hoạch, bảo quản, tách chiết, Hàm lượng tinh dầu khác khác nhau: Hoa hồng hàm lượng tinh dầu vào khoảng 0,25%; bạc hà hàm lượng khoảng 1%; hồi nụ Đinh hương hàm lượng tinh dầu tương ứng đạt giá trị 5% 15% (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014) 1.2.3 Q trình tích luỹ tinh dầu Trong thực vật, tinh dầu tạo tích trữ mơ Hình thành mơ thay đổi tùy theo vị trí chúng Những mơ tất nơi rễ, thân, lá, hoa quả, tên gọi khác như: Tế bào tiết: tế bào tiết tinh dầu giữ tế bào (mô tiết) cánh Hoa hồng, củ Gừng, Lông tiết: tế bào tiết nằm nhơ ngồi bề mặt thực vật, thường bắt gặp họ Hoa môi, Cúc, Cà, Túi tiết: tế bào tiết tinh dầu không chứa lại bên mà dồn chung chứa vào xoang trống, tạo chế ly bào hay tiêu bào Túi tiết thường năm bên biểu bì Thường có vỏ giống Citrus, Eucalyptus, Ống tiết: cách tạo tinh dầu túi tiết nằm sâu bên phần gỗ chạy dài theo sớ gỗ, bắt gặp giống Dipterocarpi, Artemisia, Về phần phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều họ Long não, họ Hoa mơi, Họ Cam, Họ Sim, họ Hoa tán 12 Tinh dầu có phận khác cây: hoa (hoa hồng, hoa nhài, cam, chanh, ); (Bạch đàn, Bạc hà, Hương nhu, Tần dầy lá, ); vỏ (Quế); thân (Hương đàn, Peru, Sả, ); rễ (Hương bài, Gừng, Nghệ, Xuyên khung, ) (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014) 1.2.4 Tính chất vật lý tinh dầu Ở nhiệt độ thường, tinh dầu thể lỏng, trừ số trường hợp menthol, camphor, thể rắn Tinh dầu gần không tan nước dễ bay hơi, tách thu tinh dầu phương pháp chưng cất lơi nước Tinh dầu tan nước, tan tốt cồn dung môi hữu cơ, loại dầu mỡ, tan phần dung dịch kiềm, Đa số tinh dầu khơng có màu màu vàng nhạt, số tinh dầu có màu như: tinh dầu Quế có màu nâu sẫm, tinh dầu Xạ hương màu đỏ, tinh dầu Ngải cứu màu vàng lục Tinh dầu thường có vị cay hắc Tỷ trọng tinh dầu thường vào khoảng 0,85 – 0,95; có số tinh dầu nặng nước tinh dầu Đinh hương, tinh dầu Quế Tỷ trọng thay đổi theo thành phần hóa học Nếu tinh dầu có thành phần chủ yếu hydrocarbon terpenic tỷ trọng thấp, tinh dầu có hợp chất chứa oxy nhân thơm tỷ trọng cao Tinh dầu thường có số khúc xạ vào khoảng 1,45 – 1,56 Chỉ số khúc xạ cao hay thấp tùy theo thành phần chất chứa tinh dầu no, khơng no có nhân thơm Nếu tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều dây nối đơi có số khúc xạ cao Vì tinh dầu hỗn hợp nên khơng có nhiệt độ sơi định Điểm sôi tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần hợp chất Ví dụ, hợp chất terpen có điểm sơi 150 – 160oC, hợp chất sesquiterpen có điểm sơi cao hơn, khoảng 250 – 280oC, hợp chất polyterpene có điểm sơi 300oC Từ đó, ta tách riêng thành phần khác tinh dầu phương pháp chưng cất phân đoạn 13 Khi hạ nhiệt độ số tinh dầu kết tinh tinh dầu Hồi, tinh dầu Bạc hà, tinh dầu Xá xị, (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 1.2.5 Tính chất hố học tinh dầu Ngải cứu Năm 2008, Govindaraj cộng khảo sát tinh dầu Ngải cứu, kết cho thấy tinh dầu chứa chất camphene, camphor, 1,8-cineole, p-cymene, βeudesmol, α-pinene, terpene-4-ol Camphor: Camphor (Long não hay băng phiến) chất rắn kết tinh, có màu trắng suốt giống với sáp, mùi hăng mạnh đặc trưng Camphor monoterpenoid với cơng thức hóa học C10H16O Camphor có tác dụng xua đuổi côn trùng, đồng thời hoạt chất sử dụng số loại thuốc chống côn trùng, chống ngứa Tuy nhiên sử dụng lượng lớn camphor dẫn đến ngộ độc, gây tai biến, rối loạn tương tự chất kích thích Năm 1980, FDA Hoa Kỳ đặt giới hạn 11% camphor phép sử dụng sản phẩm tiêu dùng cấm toàn sản phẩm chứa chiết xuất camphor Hình 1.4 Cấu trúc 3D phân tử camphor 1,8-cineole 1,8-cineole hay biết đến tên gọi eucalyptol hợp chất hữu tự nhiên, điều kiện nhiệt độ phòng chất lỏng khơng màu Đây thành phần chủ đạo tinh dầu bạch đàn Eucalyptus globulus, chiếm tới 90% dầu bạch đàn Ngồi Eucalyptol tìm thấy Long não, Ngải cứu, Húng quế, Hương thảo số loài thực vật có hương thơm khác Eucalyptol ứng dụng nhiều loại nước súc miệng thuốc ho, ngồi sử dụng thuốc trừ sâu thuốc xua đuổi côn trùng Ở liều lượng 14 cao eucalyptol gây nguy hiểm tiếp xúc qua da, đường miệng hay đường hô hấp hệ thần kinh Hình 1.5 Cấu trúc 3D phân tử eucalytol β-eudesmol Hợp chất thuộc nhóm sesquiterpene tìm thấy nhiều tinh dầu tràm, gỗ Siam thương truật (một loài thảo mộc Trung Quốc) Theo số nghiên cứu cho thấy chất có tác dụng điều trị số bệnh liên quan đến thần kinh cụ thể chống viêm thần kinh chống động kinh Ngồi chất có khả ức chế tăng trưởng khối u ung thư thuốc giải độc chống ngộ độc organophosphate Hình 1.6 Cấu trúc phân tử β-eudesmol α-pinene Ở mức độ sử dụng thấp, α-pinene coi thuốc điều trị bệnh liên quan đến phế quản đặc biệt hen suyễn, ngồi chất chống viêm kháng khuẩn Một số nghiên cứu khả hỗ trợ trí nhớ 15 khả hoạt động chất ức chế acetylcholinesterase chất Hình 1.7 Cấu trúc 3D phân tử α-pinene Terpene-4-ol Đây thành phần tinh dầu nhục đậu khấu Hiện chưa có nhiều nghiên cứu chất khả kháng nấm kháng khuẩn hợp chất tương đối trội Hình 1.8 Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol 1.2.6 Ảnh hưởng nhân tố khác đến thành phần tính chất tinh dầu Ngải cứu Tinh dầu chứa thực vật có thành phần khơng cố định mà thay đổi theo hướng phát triển ảnh hưởng yếu tố khác Nguyên liệu chế biến phận dùng để chế biến Mỗi loại tinh dầu, phận chứa tinh dầu, có thành phần định điều kiện định, giống khác thành phần tinh 16 dầu khác Trong lượng tinh dầu phận khác nhau, hàm lượng thành phần khác (Lê Ngọc Thạch, 2003) Phương pháp chế biến Tùy thuộc vào phương pháp chế biến mà hàm lượng thành phần khác Tinh dầu nhận phương pháp chưng cất lơi nước bị tạp so với tinh dầu trích ly dung mơi bay thành phần tạp khác hòa tan vào nước (Lê Ngọc Thạch, 2003) Hướng phát triển Trong thời gian sinh trưởng thành phần tinh dầu chịu hàng loạt biến đổi chuyển hóa xác định thời kỳ mà tích tụ nhiều tinh dầu có chất lượng cao để thu hoạch chế biến Tinh dầu tạo thành khơng phải có lượng cố định mà biến đổi liên tục theo hướng phát triển Sự biến đổi có xu hướng ngày tích tụ nhiều hợp chất có chứa oxy Trong phận khác cây, tinh dầu tạo thành tích lũy khơng giống mà ln ln chuyển hóa lẫn (Lê Ngọc Thạch, 2003) Độ tươi Nguyên liệu bị khô, dập, úng ảnh hưởng đến hàm lượng chất lượng tinh dầu Nên tránh để dồn đống nguyên liệu đưa đến phát nhiệt bên làm thối rữa nguyên liệu Cần phơi héo nguyên liệu thích hợp, tốt phơi héo bóng mát nhiệt độ lên q 40oC số cấu phần tinh dầu bay Nhưng độ héo ảnh hưởng đến hàm lượng chất lượng tinh dầu Do đó, để nguyên liệu héo thời gian dài đưa đến giảm khối lượng tinh dầu chứa nguyên liệu Mặt khác, việc dẫn đến số cấu phần không bền tinh dầu bị phân hủy làm cho tinh dầu thu khơng chất lượng tự nhiên Do đó, trước ly trích tinh dầu, ngun liệu cần phơi héo, cần phải khảo sát hiệu suất thành phần hóa học tinh dầu theo thời gian để héo để biết cần để héo thời gian lâu thích hợp (Phùng Thị Ái Hữu, 2012) 17 Độ Nguyên liệu chất lượng tinh dầu thu cao Do ly trích cần phải làm sạch, loại bỏ bẩn, đối tượng nguyên liệu cần ly trích khỏi ngun liệu, khơng để lẫn vào (Phùng Thị Ái Hữu, 2012) 1.2.7 Ứng dụng tinh dầu Ngải cứu ngành công nghiệp Tinh dầu Ngải cứu nhận nhiều quan tâm không từ giới khoa học mà sản xuất công nghiệp đại mà xu hướng dần quay trở sử dụng hợp chất thiên nhiên Trong bảo quản thực phẩm, tinh dầu Ngải cứu sử dụng chất ức chế phát triển xua đuổi côn trùng, loại vi khuẩn từ giữ thực phẩm khơng bị xâm hại loại côn trùng, vi khuẩn khác (Judzentinene Buzelyte, 2006) Ở thời điểm mà ung thư nỗi ám ảnh với người nghiên cứu khả chống ung thư tinh dầu Ngải cứu xuất phát từ hoạt chất Artemisin (Sun et al., 1992) Đây tín hiệu cho thấy khả ứng dụng cao tinh dầu Ngải cứu ngành công nghiệp Dược phẩm Với thành phần gồm có camphor, tinh dầu Ngải cứu chứng minh sử dụng bảo quản dược phẩm mỹ phẩm 1.2.8 Nguyên tắc sản xuất tinh dầu Theo Mai Thị Anh Tú (2009), nguyên tắc để sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên sau:  Tinh dầu thu phải có mùi thơm tự nhiên nguyên liệu  Quy trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu  Tinh dầu phải lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp  Đơn giản, thuận tiện nhanh chóng 1.2.9 Nguyên tắc trích ly tinh dầu Theo Phùng Thị Ái Hữu (2012), nguyên tắc ly trích tất phương pháp nói dựa vào đặc tính tinh dầu như: 18  Dễ bay  Lôi theo nước nhiệt độ 100oC  Hòa tan dễ dàng dung môi hữu  Dễ bị hấp thu thể khí 1.2.10.Các phương pháp trích ly tinh dầu Do yêu cầu nguyên tắc trích ly nên khai thác hợp chất thơm từ thực vật, động vật, người ta thường dùng phương pháp sau đây: Phương pháp học Hình 1.9 Máy ép tinh dầu Đây phương pháp tương đối đơn giản dùng để tách tinh dầu dạng tự cách tác dụng lực học lên nguyên liệu (thường ép) Phương pháp dùng phổ biến loại vỏ họ Citrus cam, chanh, quýt, bưởi, Vì loại nguyên liệu tinh dầu thường phân bố chủ yếu lớp tế bào mỏng biểu bì Khi có lực tác dụng lên vỏ quả, tế bào có chứa tinh dầu bị vỡ giải phóng tinh dầu Phương pháp ép có nhiều ưu điểm như: tinh dầu giữ nguyên mùi vị thiên nhiên ban đầu, thành phần tinh dầu bị biến đổi 19 Nhược điểm phương pháp ép tinh dầu bị lẫn nhiều tạp chất, chủ yếu hợp chất hữu hòa tan vật liệu đem ép (Lê Ngọc Thạch, 2003) Phương pháp chưng cất lôi nước Hình 1.10 Hệ thống chưng cất lơi nước Bình cấp nước Bình chứa nguyên liệu chưng cất Lớp tinh dầu Lớp nước Hơi nước tạo từ nồi hơi, thường có áp suất cao khơng khí, đưa thẳng vào bình chưng cất Ngày thường dùng phương pháp để chung cất tinh đầu từ nguyên liệu thực vật Điểm ưu việt phương pháp người ta điều chỉnh áp suất, nhiệt độ mong muốn để tận thu sản phẩm phải giữ nhiệt độ mức giới hạn để tinh dầu không bị phân hủy Việc sử dụng phương pháp lệ thuộc vào điều kiện hạn chế, yêu cầu nước không nóng ẩm Nếu nóng phân hủy cấu phần có độ sơi thấp, làm chất nạp khô quăn khiến tượng thẩm thấu khơng xảy Nếu dòng chảy tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưng cất tiếp nước bão hòa thời gian khuếch tán nước tái lập lại, tiếp tục dùng lại nước nhiệt Nếu nước ẩm dẫn đến tượng nước ngưng tụ, phần chất nạp phía bị ướt, trường hợp người ta phải tháo nước 20 van xả đáy nồi Trong công nghiệp, nước trước vào bình chưng cất phải ngang phận tách nước Với nước có áp suất cao thường gây phân hủy quan trọng, nên tốt bắt đầu chưng cất với nước áp suất thấp cao dần kết thúc Không có quy tắc chung cho nguyên liệu chất nạp đòi hỏi kinh nghiệm yêu cầu khác Hiệu suất chất lượng tinh dầu phụ vào đặc tính tinh dầu cách chọn phương pháp chưng cất Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất nước tinh dầu người ta thường dùng dụng cụ thủy tinh Clevenger Theo Lã Đình Mỡi (2001), phương pháp chưng cất lôi cứu nước chưng cất Clevenger có ưu, nhược điểm sau: Ưu điểm  Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản  Thiết bị gọn, dễ chế tạo  Khơng đòi hỏi vật liệu phụ phương pháp tẩm trích, hấp thụ  Thời gian tương đối nhanh Nhược điểm  Khơng có lợi ngun liệu có hàm lượng tinh dầu thấp  Chất lượng tinh dầu bị ảnh hưởng tinh dầu có cấu phần dễ bị phân hủy  Trong nước chưng ln ln có lượng tinh dầu tương đối lớn  Những tinh dầu có độ sơi cao thường cho hiệu suất Phương pháp trích dung môi dễ bay Phương pháp dựa ngun tắc sử dụng dung mơi thích hợp để hòa tan cấu tử mang hương nguyên liệu xử lý thành dạng thích hợp nhiệt độ phòng Dung mơi chiết ngấm qua thành tế bào nguyên liệu, hợp chất tế bào hòa tan vào dung mơi, sau xuất trình thẩm thấu dịch chiết bên với dung mơi bên ngồi chênh lệch nồng độ Sau trích ly phải thực q trình tách dung môi áp suất thấp để thu tinh dầu (Mai Thị Anh Tú, 2009) 21 Trích ly dung mơi khơng bay Dựa vào tính chất hòa tan chất béo động vật thực vật tinh dầu, người ta ngâm nguyên liệu vào dầu động vật thực vật, tinh dầu khuếch tán qua màng tế bào, hòa tan vào dầu, sau tách riêng dầu để thu tinh dầu Phương pháp ngâm dung mơi khơng bay có nhiều ưu điểm phương pháp trích ly dung mơi dễ bay chỗ thu dầu dầu tạp chất Tuy nhiên, phương pháp thủ cơng, khó giới hóa có nhược điểm lớn chất béo dùng làm dung mơi khó bảo quản chế biến, giá thành cao Chính phương pháp sử dụng (Mai Thị Anh Tú, 2009) Phương pháp trích ly CO2 Lợi dụng tính chất khí CO2 hóa lỏng áp suất cao, dùng CO2 lỏng chiết tinh dầu khỏi nguyên liệu Phương pháp trích ly dùng CO2 lỏng sử dụng nhiều công nghiệp thời gian gần có nhiều ưu điểm như: Dung mơi CO2 có tính chọn lựa tốt CO2 khơng có tác dụng độc hại người loại dung môi khác Dễ loại không để lại vết dung môi Khi loại dung môi không cần sử dụng nhiệt, giữ mùi thơm tinh dầu mà khơng sợ tinh dầu bị phân hủy Q trình kín bị hao tốn Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi thiết bị phức tạp chịu áp lực cao, chi phí cho CO2 đắt, nên chưa phổ biến (Mai Thị Anh Tú, 2009) 22 Phương pháp vi sóng Hình 1.11 Hệ thống chưng cất nước hỗ trợ vi sóng Phương pháp vi sóng có đặc điểm: vi sóng (micro – onde, microwave) sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng Sóng điện từ đặc trưng bởi:  Tần số f, tính Hertz (Hz = cycles/s ), chu kỳ trường điện từ giây, nằm 300 Hz 30 GHz  Vận tốc c 300.000 km/giây  Độ dài sóng 𝜆 (cm) đoạn đường vi sóng chu kỳ, liên hệ với tần số theo công thức 𝜆 = c/f  Hầu hết lò vi sóng gia dụng sử dụng tần số 2450 MHz, tần số 𝜆 = 12,24 cm Một số phân tử, thí dụ nước, phân chia điện tích phân tử cách bất đối xứng Như phân tử lưỡng cực có tính định hướng nhiều điện trường Dưới tác dụng điện trường chiều, phân tử lưỡng cực có khuynh xếp theo chiều điện trường Nếu điện trường điện trường xoay chiều, định hướng lưỡng cực thay đổi theo chiều xoay Cơ sơ tượng phát vi sóng tương tác điện trường phân tử phân cực bên vật chất Trong điện trường xoay chiều 23 có tần số cao 2,45 x 109 Hz, điện trường gây xáo động ma sát lớn phân tử, nguồn gốc nóng lên vật chất Với cấu có bất đối xưng cao, phân tử nước có độ phân cực lớn, nước chất lý tưởng để đun nóng vi sóng Ngồi ra, nhóm định chức phân cực như: - OH, - COOH, - NH2, hợp chất hữa nhóm chịu tác động mạnh trường điện từ Do đó, hợp chất phân cực mau nóng chiếu xạ vi sóng Việc liên quan đến số điện mơi hợp chất Tóm lại, đun nóng vi sóng chọn lọc, trực tiếp nhanh chóng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Phương pháp sinh học Phương pháp ứng dụng cho nguồn nguyên liệu có tinh dầu trạng thái kết hợp (glucosid) Để phân lập tinh dầu, người ta phải xử lý cách lên men dùng enzyme, sau kết hợp với chưng cất hay trích ly để thu tinh dầu giống loại vật liệu chứa hợp chất thơm khác (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 1.3 Giới thiệu phương pháp chưng cất lôi nước Phương pháp dựa khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan lơi theo nước hợp chất hữu tinh dầu chứa mô tiếp xúc với nước nhiệt độ cao Sự khuếch tán dễ dàng tế bào chứa tinh dầu trương phồng nguyên liệu tiếp xúc với nước bão hòa thời gian định Trường hợp mơ thực vật có chứa sáp, nhựa, acid béo phải dùng nhiều nước chưng cất phải thực thời gian dài hợp chất làm giảm áp suất chung hệ thống làm cho khuếch tán trở nên khó khăn (Phùng Thị Ái Hữu, 2013) 24 1.3.1 Nguyên lý hoạt động phương pháp chưng cất lôi nước Phương pháp chưng cất lôi tinh dầu nước dựa nguyên lý trình chưng cất hỗn hợp không tan lẫn vào nước tinh dầu Khi hỗn hợp gia nhiệt, hai chất bay Nếu áp suất nước cộng với áp suất tinh dầu với áp suất mơi trường hỗn hợp sơi tinh dầu lấy với nước (Phùng Thị Ái Hữu, 2012) Chưng cất lôi nước trực tiếp Nguyên liệu nước cho vào thiết bị, đun sôi, nước bay lơi theo tinh dầu, sau làm lạnh ngưng tụ hơi, ta thu tinh dầu sau phân ly tách nước Thiết bị sử dụng tương đối đơn giản, rẻ tiền, phù hợp với sản xuất nhỏ địa phương, nơi bắt đầu khai thác tinh dầu, bước đầu chưa có điều kiện đầu tư vào sản xuất Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm:  Chất lương tinh dầu sản phẩm không cao  Nguyên liệu dễ bị cháy khét, bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết bị  Khó điều chỉnh thơng số kỹ thuật (nhiệt độ, áp suất), thời gian chưng cất kéo dài  Tiêu tốn nhiều lượng Hình 1.12 Hệ thống chưng cất lôi nước nguyên lý hoạt động 25 Chưng cất lôi nước gián tiếp Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc nước riêng sử dụng chung hệ thống nước từ lò chung cho thiết bị khác Do phận chưng cất không bị gia nhiệt trực tiếp nên phương pháp khắc phục tình trạng nguyên liệu bị khê khét, màu sắc phẩm chất tinh dầu thu tốt Do nước cấp từ bên nên dễ dàng khống chế điều chỉnh yếu tố lưu lượng, áp suất cho phù hợp với loại nguyên liệu, giúp nâng cao hiệu suất chất lượng tinh dầu thu (Phùng Thị Ái Hữu, 2012) 1.3.2 Giới thiệu ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu Ảnh hưởng thời gian chiết đến lượng tinh dầu thu Đối với yếu tố khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến lượng tinh dầu thu được, tác giả Nguyễn Thị Hồng thực chưng cất lôi nước với 100 g Ngải cứu già vòng giờ, sau khoảng thời gian giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, đọc thể tích tinh dầu thu bên nhánh hứng Kết khảo sát cho thấy thời gian chưng cất tối ưu giờ, sau khoảng thời gian lượng tinh dầu tăng khơng đáng kể Thể tích tinh dầu thu 1,4 ml Từ đó, tác giả nhận xét để lượng tinh dầu thu tối ưu ta tiến hành chưng cất khoảng thời gian với nguyên liệu Ngải cứu già (Nguyễn Thị Hồng, 2011) Ảnh hưởng lượng dung mơi trích ly Ở thực nghiệm khảo sát yếu tố lượng dung mơi trích ly, tác giả Nguyễn Thị Hồng tiến hành khảo sát 100 g mẫu Ngải cứu già với thể tích nước 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml đun phương pháp chưng cất lôi nước Kết khảo sát cho thấy tăng thể tích dung mơi dùng để ly trích lượng tinh dầu tăng Do đó, thể tích dung mơi dùng để ly trích tỷ lệ thuận với hàm lượng tinh dầu ly trích Hàm lượng tinh dầu thu cao 1,2% thể tích nước cất 300 ml Khi tăng lượng dung mơi, lượng tinh dầu có xu hướng khơng tăng thêm Vì tác giả nhận xét bổ sung 300 ml nước tương 26 đương tỷ lệ nguyên liệu / thể tích nước 1:3 tỷ lệ dung mơi tối ưu ly trích tinh dầu với lượng mẫu (Nguyễn Thị Hồng, 2011) Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu làm mẫu Tác giả Nguyễn Thị Hồng khảo sát yếu tố mẫu nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu Kết cho thấy điều kiện ly trích tối ưu, khối lượng tinh dầu Ngải cứu già thu nhiều so với Ngải cứu non 1,23 lần Điều chứng tỏ hàm lượng tinh dầu Ngải cứu già nhiều so với Ngải cứu non (Nguyễn Thị Hồng, 2011) 1.4 Khả kháng khuẩn chế kháng khuẩn hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật Hợp chất kháng khuẩn thực vật tên gọi chung hợp chất hữu có thực vật có khả ức chế tiêu diệt phát triển vi sinh vật Các hợp chất kháng khuẩn thường có khả tác dụng đặc hiệu lên vi sinh vật với nồng độ nhỏ (Silva Fernandes, 2010) Các hợp chất thường thuộc nhiều nhóm hợp chất khác alkaloid, glucoside, phenolic tinh dầu 1.4.2 Các chế kháng khuẩn Hình 1.13 Những vị trí vi khuẩn bị tác động hợp chất thực vật 27 Ức chế trình tổng hợp vách vi khuẩn: Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Tác động lên trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị đại thực bào phá vỡ thay đổi áp suất thẩm thấu Ức chế chức màng tế bào: Gồm colistin, polymycin, gentamicin amphoterricin Cơ chế làm chức màng, làm cho phân tử có khối lượng lớn ion bị ngồi Ức chế q trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycoside gắn với receptor tiểu phân 30S ribosome làm cho trình dịch mã khơng xác Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc acid amin vào chuỗi polypeptide Nhóm macrolide lincoxinamide gắn với tiểu phân 50S ribosome làm ngăn cản trình dịch mã acid amin chuỗi polypeptide Ức chế trình tổng hợp acid nucleic: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản trình mã tạo thành mRNA Nhóm quinolone ức chế tác dụng enzyme DNA gyrase làm cho mạch đơn DNA duỗi xoắn làm ngăn cản trình nhân đơi DNA Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA có tác dụng cạnh tranh PABA ngăn cản q trình tổng hợp acid nucleotide Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho trình tạo nhân purin làm ức chế q trình tạo acid nucleic (Tơn Nữ Minh Nguyệt cộng sự, 2010) 28 1.4.3 Một số nhóm hợp chất alkaloid thực vật Morphine Morphine alkaloid chủ yếu nhựa anh túc xanh (Papaver somniferum) Morphine tinh thu lần đầu vào năm 1806 xác định cấu trúc hóa học vào năm 1927 Morphine có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, gây nghiện Morphine có khả giảm đau, tạo cảm giác lâng lâng dễ chịu Hiện nhiều hợp chất tổng hợp giống morphine độc sử dụng y tế linol, lerit hay phenazone,… Hình 1.14 Cấu trúc Morphine Quinine Từ lâu, quinine sử dụng làm thuốc trị sốt rét Quinine có Cinchona officinalis có nguồn gốc từ Peru, Bolivia Cấu trúc hóa học quinine xác định vào năm 1907 tổng hợp hóa học từ năm 1945 Quinine ức chế trình chép DNA phiên mã tạo RNA tác nhân gây sốt rét 29 Hình 1.15 Cấu trúc Quinine Glucoalkoloid Đại diện latisolin hoạt chất trích ly từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) thuộc họ Amaryllidaceae Vào năm 1986, Ghosal công bố tách số dẫn xuất alkaloid từ Trinh nữ hoàng cung có khả chống ung thư Nhiều nghiên cứu sinh học phân tử từ Trinh nữ hoàng cung họ Amaryllidaceae chứng minh alkaloid họ có khả chống ung bứu, chống vi khuẩn kích thích miễn dịch Nhóm glucoside Glycoside phân tử đường liên kết với nhóm chức liên kết glycosidic Trong thể sống glycoside đóng nhiều vai trò quan trọng dự trữ lượng, cấu trúc tạo hình (cellulose, ), bảo vệ (Mucopolysaccharide), chống tạo thể cetone gây độc cho thể, đồng thời nhiều glycose từ thực vật sử dụng làm thuốc (Marco, 2007) Glycoside thường dạng rắn, kết tinh số dạng lỏng vơ định hình Các hợp chất glycoside thường khơng màu, tan nước cồn, khơng tan dung môi hữu ether chloroform 30 Phân loại Nhóm glycoside thường phân loại theo tính chất hóa học aglycone bao gồm nhóm:  Nhóm alcoholic glycoside: salicin  Nhóm anthraquinone glycoside  Nhóm coumarin glycoside: apterin  Nhóm chromone glycoside: benzo- gamma-pyrone  Nhóm cyanogenic glycoside: amygdalin, dhurrin, linamarin, lotaustralin prunasin  Nhóm flavonoid glycoside: hesperidin, naringin, rutin, quercitrin  Nhóm phenolic glycoside  Nhóm saponin  Nhóm cardiac glycoside  Nhóm steviol glycoside  Nhóm thioglycosides: sinigrin, sinalbin 1.4.4 Một số nhóm hợp chất glycoside thực vật: Tannin Tannin polyphenol tan nước có Sồi Gồm nhóm tannin tan tannin phức khơng tan Tannin tan nước dẫn xuất đơn benzoic acid gallic acid hexahydroxydiphenic acid liên kết với đường đơn Tannin phức đại phân tử tạo thành từ số gốc hydroxyflavanol Tannin thường không gắn với vách tế bào phenol khác mà nằm không bào Một chức sinh học quan trọng tannin làm chất xua đuồi dinh dưỡng (chất làm ngán ăn) Tannin gây độc cho nấm mốc, nấm men vi khuẩn Saponin Saponin glucoside tự nhiên thường gặp nhiều loài thực vật đặc biệt nhân sâm Saponin có tính chất chung bị hòa tan vào nước, saponin có khả làm giảm sức căng bề mặt dung dịch, tạo nhiều 31 bọt, có độc động vật máu lạnh đặc biệt cá Tạo phức với cholesterol, có vị hắc làm hắc mạnh Một vài loài động vật có saponin hải sâm, cá Ngày nay, saponin cơng nhân thành phần giúp tạo công dụng nhân sâm Sâm nhiều saponin tốt, dựa tiêu chí để đánh giá chất lượng loại sâm Saponin chia làm nhóm dựa cấu trúc phần sapogenins saponin trung tính dẫn xuất steroid saponin có tính acid chứa gốc triterpenoid Nhóm spirostan Saponin Nhóm olenan Nhóm furostan Saponin steroid Saponin triterpenoid Nhóm aminofurostan Nhóm ursan Nhóm lupan Nhóm hopan Saponin triterpenoid tetracylic Saponin triterpenoid pentacylic Nhóm spirosolan Nhóm dammara Nhóm lanostan Nhóm cucurbitan Nhóm solanidan Hình 1.16 Sơ đồ phân loại saponin (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013) 32 Flavonoid Flavonoid nhóm hợp chất thứ cấp gồm khoảng 5000 chất có khung cấu tạo C15 thường cải biến cách gắn thêm gốc (-OH) (-OCH3) Thông thường flavonoid thường tồn dạng phức với glucose acid hữu Trong số có nhóm chất phổ biến flavonone flavonol, authocyacin, roteno Một số nhóm đại diện flavonoid isoflavone, flavanonem, flavonol leucoanthocyanidin (Nguyễn Tiến Thắng, 2012) Flavonoid chủ yếu tập trung ngành hạt kín, lớp mầm Trong thực vật bậc cao flavonoid nhóm sắc tố phổ biến tạo màu cánh hoa từ da cam, đỏ đến xanh dương Trong lớp mầm có khoảng 10 họ tìm thấy có chứa flavonoid Ngồi hàm lượng flavonoid phụ thuộc vào nơi mọc, mọc vùng nhiệt đới núi cao có hàm lượng flavonoid cao nơi thiếu ánh sáng (Ngơ Văn Thu, 2011) 1.4.5 Nhóm tinh dầu Tinh dầu thường hỗn hợp gồm nhiều thành phần, có mùi thơm, khơng tan nước, tan dung môi hữu cơ, bay nhiệt độ thường tách chiết từ thực vật phương pháp chưng cất lôi nước Thông thường tinh dầu đa số chất lỏng có số thể rắn như: menthol, borneol, vanilin, heliotropin Khơng màu màu vàng nhạt sẫm màu oxi hóa Tinh dầu có mặt rộng rãi họ như: họ Cúc (Asteraceae), họ Hoa Tán (Apiaceae), họ Hoa Môi (Lamiaceae), họ Long Nhãn (Lauraceae), họ Sim (Myrtaceae), họ Cam (Rutaceae) họ Gừng (Zingiberaceae) Tinh dầu sử dụng vị thuốc, đông y tinh dầu sử dụng để trị sán (Thymol), diệt ký sinh trùng sốt rét (Artermisinin) ngồi chống viêm, làm lành vết thương, kháng khuẩn diệt khuẩn,… (Ngô Văn Thu, 2011) 33 Phân loại Thành phần hóa học cấu tạo tinh dầu phức tạp chia thành nhóm sau:  Nhóm dẫn xuất monoterpene  Nhóm dẫn xuất sesquiterpene  Nhóm dẫn xuất dẫn xuất nhân thơm  Nhóm hợp chất chứa nitrogen lưu huỳnh Một số nhóm hợp chất tinh dầu thực vật Monoterpene Monoterpene chủ yếu có mặt tinh dầu, có mùi thơm thường tách chiết phương pháp chưng cất lôi nước vài đại diện tiêu biểu monoterpene menthol, geraniol citral sử dụng rộng rãi y học, mỹ phẩm thực phẩm Sesquiterpene Sesquiterpene có cấu tạo từ pharnesylpyrophosphate thường có mặt tinh dầu nhựa thực vật Một số loại serquiterpene hormone ảnh hưởng đến trình lột xác sâu bọ, chất thơm chất gây ngán ăn thực vật Farnesol, abscisic acid phaseic acid số hợp chất sesquiterpene thường thấy 1.5 Giới thiệu chủng vi khuẩn gây bệnh Một số vi khuẩn hay gặp Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli, Bacillus suptilis, Corynebacterium acnes, Các loại vi khuẩn thường xuất da, muỗi chích da để lại vết thương nhỏ mà mắt thường khơng thấy được, lồi vi khuẩn phát huy tác dụng tức làm vết thương sưng đỏ, tạo cảm giác ngứa, dị ứng nhiễm trùng 1.5.1 Staphyllococcus aureus Staphylococcus aureus Robert Koch phát năm 1878, sau thực phân lập từ mủ ung nhọt 34 Năm 1880, Louis Pasteur thực tiến hành phân lập nghiên cứu Staphylococcus aureus Hình 1.17 Staphyllococcus aureus Staphylococcus aureus vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 – 1,5 µm, đứng riêng lẻ thường tạo chùm giống chùm nho, không di động, không sinh bào tử Staphylococcus aureus thường cư trú da, niêm mạc, đường ruột động vật máu nóng Staphylococcus aureus vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường Phát triển nhiệt độ 10 – 45°C, mọc tốt 37°C, pH thích hợp 7,0 – 7,5 Ở mơi trường canh thang sau – làm đục mơi trường, sau 24 làm đục rõ, để lâu lắng cặn Ở mơi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, đường kính khoảng – mm, màu vàng đậm, màu vàng cam màu trắng Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, làm tan máu hoàn toàn Tụ cầu vàng tiết năm loại dung huyết tố (hemolysin): α, β, γ, δ, ε Coagulase S aureus sinh có khả làm đơng huyết tương người động vật chống đông Đây tiêu chuẩn quan trọng để phân biệt tụ cầu vàng với tụ cầu khác Coagulase có tất tụ cầu vàng 35 Coagulase có hai loại: loại tiết môi trường (coagulase tự do), loại bám vào vách tế bào (coagulase cố định) Staphylococcus aureus cho phản ứng catalase dương tính, lên men nhiều loại đường như: mannitol, glucose, lactose, mannose, sucrose, levulose, manit Tụ cầu vàng có khả đề kháng với nhiệt độ hóa chất cao vi khuẩn khơng sinh bào tử khác Nó bị tiêu diệt 80°C giờ, 100°C – phút, sống mơi trường có nồng độ NaCl cao (15%), tồn ngồi mơi trường khô – tháng Vi khuẩn tụ cầu vàng gây bệnh cách gây tổn thương trực tiếp lên quan như:  Da: nhọt da, áp xe, viêm mô tế bào  Hô hấp: viêm khí quản, viêm phổi hoại tử, áp xe phổi biến chứng tràn khí màng phổi, tràn khí trung thất, tràn khí da, tràn mủ màng phổi  Tim: viêm nội tâm mạc, tràn mủ màng tim  Màng não: viêm màng não mủ  Xương: cốt tủy viêm, viêm khớp  Máu: nhiễm trùng máu gây bệnh cách gián tiếp tiết độc tố gây viêm da tróc vẫy hội chứng sốc độc tố (Đại học Y Thái Bình, 2012) 1.5.2 Escherichia coli (E.coli) Hình 1.18 Vi khuẩn E.coli 36 E coli vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước trung bình 0,5 µm x – µm, di động tiêm mao, khơng sinh bào tử, thường tìm thấy đường ruột người động vật máu nóng E coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thơng thường, vi khuẩn hiếu khí kỵ khí tùy nghi, sống nhiệt độ 10 – 46°C, pH 5,5 – Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 37°C, pH thích hợp – 7,2 Môi trường canh thang: Nuôi cấy sau – vi khuẩn phát triển làm đục nhẹ môi trường, sau ngày mặt mơi trường có váng mỏng, ngày sau vi khuẩn lắng xuống đáy ống Môi trường thạch thường: Nuôi cấy sau – 10 nhìn thấy khuẩn lạc riêng rẽ, qua kính phóng đại, khuẩn lạc to dần, tròn lồi, phồng, mặt nhẵn, bờ đều, đường kính khoảng 1,5 mm Những ngày sau, khuẩn lạc chuyển thành màu xám xanh, đục xám Có thể thấy khuẩn lạc dạng R (xù xì) M (nhầy) Mơi trường thạch EMB: E coli có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, có ánh kim tím E coli lên men nhiều loại đường glucose, galactose, lactose, xylose, ramnose,… sinh acid sinh hơi; indol dương tính, methyl đỏ dương tính, Voges Proskauer âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H2S âm tính E coli đề kháng yếu, bị tiêu diệt nhiệt độ 55°C giờ, 60°C 30 phút chết 100°C Tuy nhiên, môi trường bên ngồi chủng E coli độc tồn tới tháng Bình thường E coli sống ruột người không gây bệnh Khi thể suy yếu số chủng trở nên gây bệnh E coli gây bệnh đường ruột tiêu chảy, kiết lỵ mà gây số bệnh khác viêm đường tiết niệu, viêm gan, viêm phế quản, viêm màng phổi,… E coli O157: H7 chủng vi khuẩn gây tiêu chảy phổ biến Ở vài bệnh nhân vi khuẩn gây rối loạn máu suy thận, chí dẫn đến tử vong Chúng ta bị nhiễm E coli qua tiếp xúc hay phơi nhiễm với phân người phân động vật, kể gia cầm phân người động vật 37 xâm nhập vào ao, hồ, sơng hay nói chung nguồn nước sinh hoạt Vi khuẩn lan truyền từ người sang người, thông thường qua người không rửa tay sau vệ sinh E coli lan truyền từ tay đến vật dụng nhà (Chi cục thú y TP Hồ Chí Minh, 2012) 1.5.3 Shigella Theo y học, Shigella tên gọi loại vi khuẩn khơng lơng, thuộc nhóm trực khuẩn Gram âm tính Vi khuẩn Shigella khơng có khả di động khơng có vỏ sinh nhà bào.Vi khuẩn Shigella hình thành men Glucose khơng sinh hơn, lên men Manitol Hầu hết vi khuẩn Shigella khơng lên men Lactose, có loại Sonnie có khả lên men chậm Hình 1.19 Vi khuẩn Shigella Shigella trực khuẩn Gram âm tính, khơng có lơng, khơng có khả di động, khơng có vỏ khơng sinh nha bào Shigella có kháng ngun thân O, khơng có kháng ngun H Căn vào kháng ngun O tính chất sinh hóa, người ta chia Shigella làm nhóm: A, B, C D Ở Việt Nam, Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn thường gặp nhóm B (Shigella flexneri) nhóm A (Shigella dysenteriae) Sau xâm nhập vào thể vi khuẩn Shigella gây kiết lị, nặng bệnh viêm đại tràng trực tràng 38 1.5.4 Salmonella Năm 1874, nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả loại vi khuẩn nguyên nhân gây bệnh thương hàn Năm 1880, Karl Joseph Eberth Robert Koch phát tác nhân gây bệnh sốt thương hàn người Năm1884, Georg Gaffky thành công việc cấy mầm bệnh môi trường nuôi cấy khiết Năm 1889, nhóm nghiên cứu quyền bác sĩ thú y Daniel Elmer Salmon tìm thấy vi khuẩn gây bệnh "dịch tả cho heo" tên vi khuẩn đặt theo tên ơng Hình 1.20 Vi khuẩn Salmonella Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi khơng tạo bào tử, di động tiên mao, sinh sống đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ µm đến µm có vành lơng rung hình roi Salmonella tìm thấy tồn giới động vật máu lạnh động vật máu nóng, mơi trường Các chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm 39 trùng máu (do Salmonella choleraesuis) ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis) Các triệu chứng Salmonella gây chủ yếu tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất sau 12 – 36 sau tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella Các triệu chứng thường kéo dài từ – ngày Trong môi trường canh thang, mọc nhanh, sau 10 làm đục môi trường Môi trường thạch thường, Salmonella phát triển tốt sau 24 giờ, tạo khuẩn lạc dạng s màu trắng xám Salmonella phân loại dựa vào khác cấu trúc kháng nguyên Hiện có khoảng 1.500 typ huyết (còn gọi lồi) Salmonella Đặt tên cho lồi Salmonella tìm lấy tên động vật mang mầm bệnh tên địa phương phân lập chúng lần Sau số loài Salmonella đáng ý nhất: S.typhi: gây bệnh cho người Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu S.typhi gây S.paratyphi A: gây bệnh thương hàn cho người Ở nước ta hay gặp loài sau S.typhi S.paratyphi В: gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, súc vật Bệnh thường gặp nước Châu Âu S.paratyphi С: vừa có khả gây bệnh thương hàn, vừa có khả gây viêm dày ruột nhiễm khuẩn huyết thường gặp nước đông nam Châu Á S.typhimurium S enteritidis gây bệnh cho người súc vật Hai loài nguyên nhân chủ yếu nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn Salmonella S.choleraesuis: nguyên thường gặp nhiễm khuẩn huyết Salmonella nước ta (Syed M Khailid cộng sự, 1990) 40 1.6 Giới thiệu tình hình nghiên cứu khả kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu loại tinh dầu khác từ thực vật 1.6.1 Khả kháng vi sinh vật tinh dầu Ngải cứu Nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Ngải cứu thực Khoa Dược, Đại học Ege, Thổ Nhĩ Kỳ tác giả Baykan Erel (2012) cho kết sau: Staphylococcus aureus: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu 23 mm Pseudomonas aeruginosa: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu 23 mm Escherichia coli: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu 11 mm Salmonella typhimurium: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu 10 mm Candida albicans: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu 20 mm Kết khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật cho thấy tinh dầu Ngải cứu có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt, nồng độ nguyên chất thấy xuất vòng vơ khuẩn tất mẫu thí nghiệm Tinh dầu Ngải cứu có tác dụng diệt khuẩn mạnh chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, chủng vi nấm: Candida albicans 1.6.2 Khảo sát khả kháng vi sinh vật tinh dầu tần dày Kết khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Tần dày thu phương pháp chưng cất lôi nước thực phòng thí nghiệm khoa Khoa học tự nhiên, Đại học Cần Thơ Tác giả Mai Thị Anh Tú (2009) khảo sát hoạt tính sinh học mẫu tinh dầu tần dày thu phương pháp chưng cất lôi nước Kết khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Tần dày lá: 41 Staphylococcus aureus: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu ngun chất trích ly từ Tần dày 30 mm, đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu pha lỗng lần trích ly từ Tần dày 20 mm Escherichia coli: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu nguyên chất trích ly từ Tần dày là: 30 mm, đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu pha lỗng lần trích ly từ Tần dày 19 mm Candida albicans: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu ngun chất trích ly từ Tần dày là: 30 mm, đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu pha lỗng lần trích ly từ Tần dày 17 mm Salmonella: đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu ngun chất trích ly từ Tần dày là: 30 mm, đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu pha lỗng lần trích ly từ Tần dày 20 mm Kết khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật hai mẫu tinh dầu Ngải cứu cho thấy mẫu tinh dầu có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt, nồng độ nguyên chất thấy xuất vòng vơ khuẩn tất mẫu thí nghiệm Tinh dầu Tần dày có tác dụng diệt khuẩn mạnh chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella chủng vi nấm: Candida albicans (Mai Thị Anh Tú, 2009) 1.7 Sắc ký khí ghép khối phổ số ứng dụng (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry) phương pháp sắc ký đại với độ nhạy độ đặc hiệu cao sử dụng nghiên cứu phân tích kết hợp Thiết bị GC-MS cấu tạo thành phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp chất tìm chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả hợp phần riêng lẻ cách mô tả số khối Bằng kết hợp kỹ thuật (GC-MS/Gas Chromatography Mass Spectometry), nhà hoá học đánh giá, phân tích định tính định lượng có cách giải số hóa chất Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC-MS nhiều sử dụng 42 rộng rãi nghành y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm… Sắc ký khí (GC - Gas Chromatography) Sắc ký khí dùng để chia tách hỗn hợp hóa chất phần riêng lẻ, phần có giá trị riêng biệt Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất mẫu bơm vào pha động Trong sắc ký lỏng (LC) pha động dung mơi hữu cơ, GC pha động khí trơ gống helium Pha động mang hỗn hợp mẫu qua pha tĩnh, pha tĩnh sử dụng hóa chất, hóa chất có độ nhạy hấp thụ thành phần hỗn hợp mẫu Thành phần hỗn hợp pha động tương tác với pha tĩnh, hợp chất hỗn hợp tương tác với tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh thoát khỏi cột trước hợp chất tương tác chậm khỏi cột sau Đó đặc trưng pha động pha tĩnh, q trình chia tách xảy thay đổi nhiệt độ pha tĩnh áp suất pha động Cột GC làm thủy tinh, inox thép không rỉ có kích thước, kích cỡ đa dạng Cột GC dài 25m, 30m, 50m, 100m có đường kính nhỏ, bên đường kính tránh lớp polimer đặc biệt nhưphenyl 5% + dimetylsiloxane polymer 95%), đường kính cột thường nhỏ giống ống mao dẫn Thông thường cột sử dụng semivolatile, hợp chất hữu không phân cực PAHs, chất hỗn hợp phân tích cách chạy dọc theo cột Một chất chia tách, rửa giải phóng khỏi cột vào đầu dò Đầu dò có khả tạo tín hiệu lúc nào, phát chất cần phân tích Tín hiệu phát từ máy tính, thời gian từ bơm mẫu đến rửa giải gọi thời gian lưu (TR) Trong thiết bị chạy, máy đưa biểu đồ từ tín hiệu Đây gọi sắc đồ, peak sắc đồ miêu tả tín hiệu tạo nên chất giải hấp từ cột sắc ký vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu, hình đỉnh (peak) biểu diễn chất riêng lẻ, chất tách từ hỗn hợp mẫu phân tích, peak có thời 43 gian lưu (TR) 4,97 phút dodecane, 6.36 phút biphenyl, 7.64 phút chlolobiphenyl, 9.41 phút hexadecanoic acid methyl ester Nếu điều kiện sắc ký nhiệt độ, loại cột… gống chất ln có thời gian lưu giống nhau, biết thời gian lưu hợp chất chấp nhận độ nhạy Tuy nhiên, chất có tính chất giống thường có thời gian lưu giống Hình 1.21 Sắc ký đồ sắc ký khí Khối phổ: Khối phổ dùng để xác định chất hóa học dựa cấu trúc Khi giải hấp hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry) Khi đó, chúng công vào luồng, chúng bị bỡ thành mảnh vụn, mảnh vụn lớn nhỏ; Những mảnh vụn thực tế vật mang điện hay gọi iơn, điều quan trọng hạt cần trạng thái tích điện qua lọc Các khối nhỏ chắn, khối mảnh vỡ chia vật mang gọi tỷ lệ vật mang khối (M/Z); Hầu hết mảnh vụn có điện tích +1, M/Z thường miêu tả phân tử nặng mảnh vụn.Nhóm gồm có nam châm điện gọi tứ cực (quadrapole), tiêu điểm mảnh vụn xuyên qua khe hở vào đầu dò detector, 44 tứ cự thành lập phần mền chương trình hướng mảnh vụn vào khe khối phổ Phân tích kết Máy tính ghi lại biểu đồ lần qt Trục hồnh biểu diễn tỷ lệ M/Z trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu mảnh vụn quét đầu dò detector Đây đồ thị số khối Làm để phân tích kết từ máy tính? Dưới hình khối phổ Trục X khối lượng trục Y số lượng Mỗi hóa chất tạo mơ hình nhất, nói cách khác chất có “dấu vân tay” để nhận dạng, dựa mơ hình ion Trên hình ta thấy phân tử ban đầu có khối lượng Trên sơ đồ khối phổ hạt lớn gọi ion phân tử (molecular ion) Các hạt nhỏ có khối lượng 1,2,3 gọi ion phân mảnh (fragment ions) Trong trường hợp ví dụ ta thấy phân tử chất có xu hướng bị phá vỡ thành tổ hợp 1-4 2-3 Các nhà nghiên cứu so sánh khối phổ thu thí nghiệm họ với thư viện khối phổ chất xác đinh trước Việc giúp họ định danh chất (nếu phép so sánh tìm kết tương ứng) sở để đăng ký chất (nếu phép so sánh không tìm kết tương ứng) Hình 1.22 Mơ hình khối phổ 45 Trong hình 1.23, hình ảnh khối cao dodecane, phần nềm GC/MS giống thư viện hình ảnh dùng để nhận chất chưa biết tồn hỗn hợp mẫu Thư viện so sánh hình ảnh khối từ thành phần mẫu với hình ảnh khối thư viện máy Hình 1.23 Mass-spectrum Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) phân tích hỗn hợp hóa chất phức tạp khơng khí, nước…Nếu mẫu có chất lạ xuất hiện, khối phổ nhận dạng cấu trúc hóa học độc (giống việc lấy dấu vân tay) Cấu trúc chất sau so sánh với thư viện cấu trúc chất biết Nếu không tìm chất tương ứng thư viện nhà nghiên cứu, dựa cấu trúc tìm để phát triển ý tưởng cấu trúc hóa học Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu liệu đóng góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau tiến hành thêm biện pháp để xác định xác loại hợp chất Khi GC kết hợp với MS, trở thành máy phân tích đa năng, nhà nghiên cứu hóa học hòa tan hỗn hợp hợp chất hữu cơ, tách chiết 46 bơm vào máy để nhận dạng chúng, nhà nghiên cứu xác định nồng độ thành phần hóa chất Một số ứng dụng sắc ký khí ghép khối phổ Khác với máy phân tích dư lượng kháng sinh sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS/MS), sắc ký khí ghép khối phổ độ phận giải cao (HRGC/HRMS), GC/MSN sắc ký ghép khối phổ có ứng dụng phân tích độc chất nước tương, nước mắm (3 MCPD ); Nghiên cứu chiết xuất xác định thành phần chất hóa học, độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu hóa chất diệt trùng khác vật liệu hợp chất khác 47 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đề tài 2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài Thí nghiệm tiến hành phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật, Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh Địa chỉ: Lơ E3, Phân khu đào tạo E3, Khu Công nghệ cao Tp.HCM, Phường Hiệp Phú, Quận 9, Tp.HCM 2.1.2 Thời gian thực Đề tài thực từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2018 2.2 Vật liệu 2.2.1 Nguyên liệu Lá Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) thu mua ấp Chợ, xã Tân Phú Trung, huyện Củ Chi, Tp HCM Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Shigella boydii, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium Hình 2.1 a Vườn Ngải cứu b Nhánh Ngải cứu để héo ngày 48 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị Thiết bị:  Bộ chưng cất tinh dầu Clevenger  Autoclave (Đức)  Cân phân tích, cân kỹ thuật  Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức)  Bếp điện  Máy xay khô  Bể điều nhiệt Dụng cụ:  Bao PE  Bông thấm nước, không thấm nước  Pipetman 100 µl, 1000 µl  Becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000ml  Erlen 250 m  Đĩa Petri  Que cấy tăm  Đèn cồn  Ống đong  Pipette  Lọ thủy tinh  Đũa thủy tinh  Ống nghiệm  Phễu thủy tinh  Phễu chiết  Giấy lọc 49 Hình 2.2 Bộ chưng cất lôi nước Clevenger 2.2.3 Hóa chất Các hóa chất để pha mơi trường NA, NB  Na2SO4  NaCl  Nước cất  KOH 0,1N  HCl 0,1N  Thuốc thử phenolphthalein  Ethanol 96o, ethanol 80o ethanol 70o  Môi trường nuôi cấy vi khuẩn là: môi trường Nutrient agar môi trường Nutrient Broth 50 2.3 Phương pháp nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm với nội dung: Nguyên liệu Ngải cứu Nồng độ dung dịch NaCl Xác định ảnh hưởng yếu tố đến khả thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước Thời gian ngâm nguyên liệu dung dịch NaCl Kích thước nguyên liệu Thời gian để héo nguyên liệu Tỷ lệ rắn/lỏng Thời gian chưng cất Chỉ số hóa học tinh dầu Ngải cứu Độ hòa tan ethanol Định lượng tinh dầu Ngải cứu Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu Đánh giá cảm quan Mùi Xác định tiêu hóa lý tinh dầu Ngải cứu Vị Xác định thành phần hóa học tinh dầu Ngải cứu phương pháp GC-MS Escherichia Coli Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus Màu sắc Đánh giá hoạt lực kháng khuẩn Shigella boydii Hình 2.3 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước 51 2.3.1 Tiến hành trích ly tinh dầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng Nguyên liệu (lá Ngải cứu) + Loại bỏ tạp chất + Cắt bỏ héo, già, bỏ rễ Ngâm dung dịch nước + NaCl Ly trích phương pháp lôi nước Hỗn hợp tinh dầu với nước Bình lóng (phễu chiết) Tinh dầu thơ (tinh dầu + nước) Nước Làm khan Na2SO4 Tinh dầu Ngải cứu Hình 2.4 Sơ đồ quy trình chưng cất thu nhận tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước 52 Thuyết minh quy trình: Lắp đặt hệ thống chưng cất nước chưng khoảng từ 30’ đến 180 phút để lấy tinh dầu Ngải cứu dạng thô Sau trình chưng cất trình lắng làm tinh dầu Để cho việc tách tinh dầu dễ dàng, phân lớp rõ ràng lớp nước tinh dầu Sau tách tinh dầu khỏi hỗn hợp nước chưng tiếp tục cho khoảng g Na2SO4 khan để làm khan triệt để hạt nước nằm lớp tinh dầu Lấy phần nước chưng lẫn tinh dầu trữ lại đen chưng lại để thu tinh dầu triệt để Thu tinh dầu làm bảo quản Tính tốn kết so sánh lượng tịnh dầu Ngải cứu Đem tinh dầu Ngải cứu bảo quản thử hoạt tính sinh học 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Tiến hành khảo sát yếu tố: nguyên liệu tươi để héo, loại mẫu Ngải cứu (lá non, già), nguyên liệu để nguyên, cắt nhỏ xay nhuyễn, thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất nồng độ muối Nguyên tắc: cố định yếu tố thay đổi yếu tố để chọn mức tối ưu cho yếu tố Sau cố định yếu tố tiếp tục thay đổi yếu tố khác, tiến hành chọn mức yếu tố tối ưu cho q trình ly trích 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Cố định yếu tố: nguyên liệu mẫu già, để héo, thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nồng độ muối Sau tiến hành trích ly thu tinh dầu so sánh để tìm kích thước nguyên liệu tối ưu 53 Kích Nghiệm Nguyên thức liệu thước nguyên liệu A1 Lá già A2 Lá già A3 Lá già Để nguyên Cắt nhỏ Xay nhuyễn Khối Nồng Thời Thời lượng độ gian gian mẫu muối ngâm để héo (g) (%) (phút) (ngày) 450 150 10 30 450 150 10 30 450 150 10 30 Thời Lượng gian nước (giờ) (ml) 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tuổi nguyên liệu (lá non, già) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Cố định yếu tố: thời gian chưng cất, nồng độ muối, thời gian ngâm mẫu, lượng nước chưng cất, nguyên liệu cắt nhỏ, để héo thay đổi loại Ngải cứu: già non Sau ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu thời gian khác nhau, từ chọn loại nguyên liệu Ngải cứu làm nguyên liệu trích ly tinh dầu Ngải cứu thích hợp Kích Nghiệm Nguyên thức liệu thước nguyên liệu B1 Lá non B2 Lá già Cắt nhỏ Cắt nhỏ Thời Lượng gian nước (giờ) (ml) Khối Nồng Thời lượng độ gian mẫu muối ngâm (g) (%) (phút) Thời gian để héo (ngày) 450 150 10 30 450 150 10 30 54 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Cố định thời gian chưng cất, thời gian ngâm mẫu, nguyên liệu già, để héo, lượng nước chưng cất, nguyên liệu cắt nhỏ, ta thay đổi nồng độ dung dịch NaCl chưng cất sau: 0% (0g/450ml nước cất), 5% (22,5 g/450 ml nước cất), 10% (45 g/450 ml nước cất), 15% (67,5 g/450 ml nước cất) Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dạng nhũ, làm giảm độ tan số thành phần khơng phân cực có tinh dầu vào nước Đồng thời tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến tăng nhiệt độ sôi (tăng áp suất hơi) nước Lượng tinh dầu thu giảm theo tăng nồng độ muối nồng độ cao lớp biểu bì ngồi chứa tinh dầu co lại, ngăn cản tinh dầu ngồi Kích Nghiệm Ngun thức liệu thước nguyên liệu C1 Lá già C2 Lá già C3 Lá già C4 Lá già Cắt nhỏ Cắt nhỏ Cắt nhỏ Cắt nhỏ Thời Lượng gian nước (giờ) (ml) Khối Nồng Thời lượng độ gian mẫu muối ngâm (g) (%) (phút) Thời gian để héo (ngày) 450 150 30 450 150 30 450 150 10 30 450 150 15 30 55 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm nguyên liệu dung dịch NaCl hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Thời gian ngâm nguyên liệu với dung dịch nước muối trước chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu Do có thời gian để tạo thẩm thấu cho tinh dầu mơi trường bên ngồi nên chưng cất tinh dầu thu nhiều từ đầu thể tích tăng đáng kể Đồng thời muối làm tăng tỷ trọng nước phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước tinh dầu bị nước dễ dàng chưng cất Thời gian ngâm khảo sát phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, cố định yếu tố tối ưu Kích Nghiệm Nguyên thức liệu thước nguyên liệu D1 Lá già D2 Lá già D3 Lá già Cắt nhỏ Cắt nhỏ Cắt nhỏ Thời Lượng gian nước (giờ) (ml) Khối Nồng Thời lượng độ gian mẫu muối ngâm (g) (%) (phút) Thời gian để héo (ngày) 450 150 10 450 150 10 30 450 150 10 60 2.3.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Với mức tối ưu chọn, tiếp tục cố định yếu tố lại thay đổi mức thời gian chưng cất sau: 30 phút, giờ, 30 phút, giờ, 30 phút, giờ, 30 phút, Thời gian chưng cất lâu lượng tinh dầu thu nhiều Tuy nhiên, đến thời điển lượng tinh dầu thu không tăng lên theo thời gian Mặt khác, kéo dài thời gian chưng cất 56 ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu nguyên liệu bị cháy khét làm mùi thơm tự nhiên tinh dầu Thời gian chưng cất Nghiệm thức (phút) E1 30 E2 60 E3 90 E4 120 E5 150 E6 180 E7 210 E8 240 2.3.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Cố định yếu tố tối ưu, nguyên liệu làm héo 45 – 50οC mức thời gian ngày, ngày, ngày Sau tiến hành trích ly so sánh lượng tinh dầu thu để chọn độ héo tối ưu Nghiệm thức Thời gian để héo (ngày) F1 F2 F3 F4 57 2.3.2.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Với mức tối ưu yếu tố chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất sau: 300 ml, 450 ml 600 ml Ghi nhận lượng tinh dầu thu nghiệm thức, từ xác định lượng nước chưng cất tối ưu Tỷ lệ nguyên liệu/nước chưng ảnh hượng mạnh đến hiệu suất thu hồi tinh dầu Lượng nước nhiều, số thành phần tinh dầu có tính phân cực tan vào nước Nếu lượng nước q khơng đủ hòa tan chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu Thể tích nước chưng Nghiệm thức (ml) G1 300 G2 450 G3 600 2.3.3 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu Phân tích sơ chất lượng tinh dầu cảm quan phương pháp thực dựa theo tác giả Tôn Long Dày (2013) Nghĩa nghiên cứu dấu hiệu bên mùi, vị, màu sắc, độ suốt, Qua nghiên cứu dấu hiệu bên ngồi phán đoán đánh giá sơ chất lượng tinh dầu mục đích sử dụng tinh dầu Màu sắc độ suốt: Xác định màu sắc độ suốt tinh dầu cách cho tinh dầu vào ống thủy tinh suốt màu có dung tích 20 ml, lắc quan sát ghi nhận xét tính chất, cường độ màu độ suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm, ) Nếu tinh dầu vẩn đục khơng suốt chứng tỏ tạp chất nước Mùi: 58 Mùi biểu bên quan trọng tinh dầu Mỗi loại tinh dầu có mùi đặc trưng Dựa vào mùi biết chất lượng mục đích sử dụng Để xác định mùi, nhỏ giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc bôi vào mu bàn tay ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, 15 phút ngửi lần Ghi nhận xét chất cường độ mùi (thơm dịu, hăng, xốc, ) Vị: Vị biểu bên quan trọng tinh dầu Mỗi loại tinh dầu có mùi vị riêng Để xác định vị, dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét chất (ngọt, đắng,…) cường độ vị (dịu, thoảng,…) (Tôn Long Dày, 2013) 2.3.3.1 Xác định số vật lý a Định lượng tinh dầu Theo (TCVN 8444:2010) hàm lượng tinh dầu tính theo cơng thức: % tinh dầu = số ml tinh dầu thu sau chưng cất số gam ngun liệu tươi khơ × 100% b Tỷ trọng Tỷ trọng tinh dầu 20oC tỷ số khối lượng tinh dầu 20oC khối lượng thể tích nước cất 20oC Do hàm lượng tinh dầu thu lần chưng cất thấp, phương pháp bảo quản chưa tối ưu dẫn đến việc tinh dầu bị quang hóa, oxy hóa ảnh hưởng đến kết đo tỷ trọng Vì việc sử dụng bình tỷ trọng 10 ml khơng phù hợp, thay vào việc đo tỷ trọng thực theo phương pháp thủ công Dùng ống tiêm y tế (loại ml), thân ống tiêm vạch đường làm dấu Cách xác định: Ban đầu, đem cân ống tiêm không ghi số liệu lại (m0) 59 Tiếp theo: Hút nước cất đến vạch (lưu ý ống tiêm khơng có bong bóng khí), đem cân ghi lại số liệu (m1) Rồi xả bỏ nước ống tiêm, vẩy cho khô nước Cuối cùng: Hút tinh dầu khan đến vạch (lưu ý khơng có bong bóng khí ống tiêm) đem cân ghi lại số liệu (m2) Tỷ trọng d20 20 m2 - m0 m1 -m0 (TCVN 189:1993) Với: m0: khối lượng ống tiêm khơng, tính gam (g) m1: khối lượng ống tiêm nước cất, tính gam (g) m2: khối lượng ống tiêm tinh dầu, tính gam (g) Cứ lặp lại nghiệm thức lần: d(tb) = (d1 + d2 + d3)/3 c Độ hòa tan tinh dầu ethanol Pha ethanol 90o, 80o, 70o từ cồn tuyệt đối Dùng pipette chuẩn hút ml tinh dầu Ngải cứu cho vào bình tam giác có nút mài Từ buret nhỏ dần ethanol vào bình đựng tinh dầu Sau lần nhỏ khoảng 0,2 ml vào đậy nút lắc tan hết tinh dầu Tiếp tục nhỏ ethanol vào lắc thu dung dịch đồng suốt, ghi lượng ethanol dùng Lặp lại thao tác lần 2.3.3.2 Xác định số hóa học Chỉ số acid (Index Acid) Chỉ số acid số mg KOH cần thiết để trung hồ acid tự có g tinh dầu KOH trung hoà acid tự tinh dầu theo phản ứng RCOOH + KOH  RCOOK + H2O Cách xác định: Cho vào erlen 100 ml: 10 ml ethanol, thêm vào giọt dung dịch phenolphthalein Cho tiếp vào g tinh dầu, lắc cho dầu tan hoàn toàn Tiếp tục chuẩn độ dung dịch dung dịch KOH 0,1 N đến xuất màu hồng 60 bên 30 giây Ta thực phép đo lần, ghi lại thể tích dung dịch KOH 0,1 N (VKOH) dùng chuẩn độ, lấy kết trung bình Chỉ số acid tính theo cơng thức IA = 5,61⋅V g Trong đó: (TCVN 8444:2010) VKOH: số ml dung dịch KOH 0,1 N dùng chuẩn độ 5,61: số mg KOH có ml dung dịch KOH 0,1 N g: số g tinh dầu dùng để chuẩn độ Chỉ số ester (Index Ester) Chỉ số ester hoá tinh dầu số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng acid béo nằm dạng ester có g tinh dầu Cách xác định: Sử dụng mẫu thử xác định trên, thêm xác 10 ml KOH 0,095 N ethanol Lắp ống sinh hàn ngược vào bình đun cách thủy đến phản ứng xà phòng hóa kết thúc (lúc dung dịch bình màu hồng, đồng thời xuất tinh thể nhỏ màu vàng nâu) Đồng thời làm mẫu đối chứng với 10ml KOH 0,095 N ethanol 10ml ethanol 96o, tiến hành điều kiện Đun xong để nguội, chuẩn độ dung dịch HCl 0,1 N Hiệu số số ml dung dịch HCl 0,1N dùng mẫu đối chứng số ml dung dịch HCl 0,1 N dùng mẫu thử số ml HCl dùng để trung hòa lượng KOH dùng cho phản ứng este hóa Chỉ số ester tính theo cơng thức: IE= 5,61.(V1 -V0) g Trong đó: (TCVN 8444:2010) V0: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (ml) V1: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml) g: số g tinh dầu ngải cứu 61 Chỉ số savon hóa (Index Savon) Chỉ số savon hố số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất acid tự acid kết hợp dạng ester có g tinh dầu Q trình savon hố tinh dầu bao gồm: KOH trung hồ acid tự do: KOH + RCOOH  RCOOK + H2O KOH xà phòng hố ester: KOH + R1COOK +R2OH Chỉ số savon hoá tinh dầu tổng số số ester hoá số acid: IS = IE + IA Trong đó: (TCVN 8444:2010) IS: số savon hoá IE: số ester hoá IA: số acid hố 2.3.3.3 Xác định thành phần hóa học tinh dầu Thành phần hoá học tinh dầu Ngải cứu xác định phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS với điều kiện sau:  Máy sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS:HP6890  Cột mao quản: dài 30 m, đường kính 250 µm, lớp phim dày 250 µm  Nhiệt độ phần bơm mẫu (injector): 250oC  Tỷ lệ dòng (splitless)  Đầu khối phổ tứ cụ (MSD)  Tốc độ dòng khí mang (He) 0,9 ml/phút, áp suất 6.9 psi Chương trình nhiệt phân tích: bắt đầu 60oC, giữ phút Sau tăng lên 100oC, với tốc độ tăng 10oC/phút Tiếp tục tăng đến 280oC với tốc độ tăng 30oC/phút giữ 15 phút 2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị tinh dầu nguyên chất Ngải cứu ấp Chợ, xã Tân Phú Trung, huyện Củ Chi, Tp HCM Chuẩn bị loại vi khuẩn: Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella boydii Chuẩn bị mẫu thuốc kháng sinh Ampicillin để đối chứng 62 Cân xác 100 mg thuốc kháng sinh Ampicillin cần thử, hoà tan vào 10 ml nước cất, thuốc không tan nước hòa tan với DMSO, ta nồng độ dung dịch mẹ 10 mg/ml Dung dịch để bảo quản tủ lạnh Chuẩn bị môi trường Thạch nền: sử dụng môi trường NA, pha NA vào nước cất sau hấp khử trùng 121oC, atm, 15 phút Để nguội đến khoảng 50oC đến 60oC sau đổ vào đĩa petri tiệt trùng Để nguội sau úp ngược đĩa petri lại Môi trường lỏng: sử dụng môi trường NB, pha g NB vào 500 ml nước cất sau chia làm lọ để hấp khử trùng 121oC, atm, 15 phút Để nguội đến nhiệt độ phòng sau cấy E.coli vào lọ số (1), Staphylococcus aureus vào lọ số (2), cấy Shigella vào lọ số 3, cấy Salmonella vào lọ số 4, lọ số (5) dùng để set máy Sau mang lắc Chuẩn bị 20 ống nước muối sinh lý 0,9% hấp khử trùng 121 oC, atm, 15 phút Nguyên tắc Các hợp chất kháng khuẩn có tinh dầu khuếch tán vào môi trường thạch tác động lên vi sinh vật thị Nếu tinh dầu có khả tiêu diệt vi khuẩn xuất vòng kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy kháng sinh Từ đó, xác định hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Tiến hành Lấy sinh khối vi khuẩn hòa vào ống nghiệm chứa ml nước muối sinh lý vô trùng (NaCl 0,9%), lắc Lấy tăm vô khuẩn thấm vào huyền dịch vi khuẩn hoạt hóa đạt mật độ 106 CFU/ml lên mặt thạch NA tiến hành cấy ria tăm vơ khuẩn Sau nhúng đĩa giấy kháng sinh có đường kính mm vào nồng độ tinh dầu đặt vào đĩa petri, làm tương tự với đĩa petri lại theo độ pha lỗng tinh dầu, nhúng đĩa kháng sinh Ampicillin ĐC vào đĩa petri ĐC, giữ yên vòng để tinh dầu kháng sinh Ampicillin ĐC khuếch tán vào môi trường thạch Cuối cùng, đĩa đem ủ tủ ấm 63 37oC 24 tiến hành đọc kết thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm) Phương pháp thu thập xử lý số liệu Đối với thạch đặt đĩa giấy kháng sinh: dùng thước đo vòng vơ khuẩn (tính mm) chụp hình So sánh đường kính vòng vơ khuẩn tinh dầu với kháng sinh Phương pháp tính tốn Kết đường kính vòng vơ khuẩn thu qua lần thí nghiệm lặp lại tính trung bình Mức độ nhạy cảm vi khuẩn với dịch chiết phân loại dựa theo đường kính vòng vơ khuẩn: (Celikel Kavas, 2008)  Đường kính vòng vơ khuẩn < mm: khơng nhạy  Đường kính vòng vơ khuẩn từ – 14 mm: nhạy  Đường kính vòng vơ khuẩn 15 – 19 mm: nhạy  Đường kính vòng vơ khuẩn > 20 mm: cực nhạy 2.4 Thống kê xử lý số liệu Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hồn tồn ngẫu nhiên, đơn yếu tố Các nghiệm thức lặp lại lần Xử lý số liệu thu được, vẽ biểu đồ, đồ thị phần mềm Excel 2016® liệu phân tích ANOVA phần mềm Statistical Analysis Systems 9.1 Tất số liệu sau thu thập ứng với tiêu theo dõi, thống kê biểu diễn dạng số liệu giá trị trung bình ký tự a,b, khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước 3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Tiến hành khảo sát kích thước nguyên liệu Ngải cứu kích thước để nguyên, cắt nhỏ cm xay nhuyễn thu kết sau: Bảng 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu Thể tích Nghiệm thức Kích thước nguyên liệu tinh dầu Hàm lượng thu tinh dầu (%) (ml) A1 Để nguyên 0,142 0,094c A2 Cắt nhỏ 0,668 0,446a A3 Xay nhuyễn 0,472 0,315b (Phụ lục 2) *Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 65 0.500 0.450 0.446 0.400 0.350 0.300 0.315 Hàm lượng tinh dầu thu được% 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.094 0.000 Để nguyên Cắt nhỏ Xay nhuyễn Hình 3.1 Đồ thị ảnh hưởng kích thước ngun liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Theo hình 3.1, nguyên liệu cắt nhỏ cho thể tích tinh dầu 0,668 ml hàm lượng tinh dầu tối ưu là: 0,446% Theo tài liệu nghiên cứu, việc trích ly tinh dầu phương pháp chưng cất lôi nước với nguyên liệu xay cho hàm lượng tinh dầu cao Tuy nhiên qua thực nghiệm lại cho thấy hàm lượng tinh dầu thu nguyên liệu cắt nhỏ nhiều so với nguyên liệu xay nhuyễn Khi xay nhuyễn, tế bào chứa tinh dầu bị vỡ, dễ thẩm thấu vào túi dầu, tinh dầu dễ mơi trường Trong trình xay lại tạo lượng nhiệt định nên dẫn đến việc tinh dầu bị thất q trình xay nhuyễn Đối với ngun liệu xay nhuyễn, tinh dầu thu có màu vàng sáng, mùi tự nhiên so với nguyên liệu cắt nhỏ, tinh dầu xuất màu vàng sậm tiếp xúc nhiệt lâu 3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng tuổi nguyên liệu (lá non, già) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Cố định yếu tố: thời gian chưng cất, nồng độ muối, thời gian ngâm mẫu, lượng nước chưng cất, nguyên liệu cắt nhỏ thay đổi loại Ngải 66 cứu: già non Sau ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu thời gian khác nhau, từ chọn loại nguyên liệu Ngải cứu làm nguyên liệu trích ly tinh dầu Ngải cứu thích hợp Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu Thể tích tinh dầu Hàm lượng tinh dầu thu (ml) (%) B1 0,411 0,274b B2 0,668 0,446a Nghiệm thức (Phụ lục 2) *Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 0.500 0.450 0.400 0.446 0.350 0.300 0.250 0.274 Hàm lượng tinh dầu % 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 Lá già Lá non Hình 3.2 Đồ thị ảnh hưởng tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Căn vào hình 3.2 ghi nhận hàm lượng tinh dầu thu nguyên liệu già tốt 0,446% Qua nhận định tuổi nguyên liệu có ảnh hưởng đến lượng tích lũy tinh dầu nguyên liệu 67 3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Cố định thời gian chưng cất, thời gian ngâm mẫu, nguyên liệu già, lượng nước chưng cất, nguyên liệu cắt nhỏ, ta thay đổi nồng độ dung dịch NaCl chưng cất sau: 0% (0g/450ml nước cất), 5% (22,5 g/450 ml nước cất), 10% (45 g/450 ml nước cất), 15% (67,5 g/450 ml nước cất) Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dạng nhũ, làm giảm độ tan số thành phần không phân cực có tinh dầu vào nước Đồng thời tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến tăng nhiệt độ sôi (tăng áp suất hơi) nước Lượng tinh dầu thu giảm theo tăng nồng độ muối nồng độ cao lớp biểu bì ngồi chứa tinh dầu co lại, ngăn cản tinh dầu ngồi Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu Nghiệm thức Nồng độ muối (%) Thể tích tinh dầu thu (ml) Hàm lượng tinh dầu (%) C1 0,231 0,153c C2 0,345 0,230b C3 10 0,668 0,446a C4 15 0,416 0,281b (Phụ lục 2) *Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 68 0.500 10, 0.446 Hàm lượng tinh dầu (%) 0.450 0.400 0.350 15, 0.281 0.300 5, 0.230 0.250 0.200 Hàm lượng tinh dầu (%) 0, 0.153 0.150 0.100 0.050 0.000 10 15 Nồng độ dung dịch NaCl (%) Hình 3.3 Đồ thị ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dạng nhũ, làm giảm độ tan số thành phần khơng phân cực có tinh dầu vào nước Đồng thời tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến tăng nhiệt độ sôi (tăng áp suất hơi) nước (W.F.Furter and R.A.Cook, 1967) Lượng tinh dầu thu giảm theo tăng nồng độ muối nồng độ cao lớp biểu bì ngồi chứa tinh dầu co lại, ngăn cản tinh dầu Mặt khác, làm tăng nhiệt độ sôi nước nên việc thêm muối NaCl vào q trình chưng cất khơng thể áp dụng cho tinh dầu có nhiệt độ sơi thấp bền với nhiệt Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Hồng (2011) khảo sát mẫu Ngải cứu già thu thập Quảng Nam cho kết thể tích tinh dầu thu 1,6 ml nồng độ NaCl 10%, mức nồng độ 15 20% lượng tinh dầu thu không tăng thêm Dựa vào bảng 3.3, nhận xét nồng độ muối 10% nồng độ tối ưu để trích ly tinh dầu Ngải cứu 69 3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng thời gian ngâm dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Thời gian ngâm nguyên liệu với dung dịch nước muối trước chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu Do có thời gian để tạo thẩm thấu cho tinh dầu mơi trường bên ngồi nên chưng cất tinh dầu thu nhiều từ đầu thể tích tăng đáng kể Đồng thời muối làm tăng tỷ trọng nước phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước tinh dầu bị nước dễ dàng chưng cất Thời gian ngâm khảo sát phút, 30 phút, 60 phút Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm nguyên liệu dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu Nghiệm thức Thời gian ngâm (phút) Thể tích tinh dầu thu (ml) Hàm lượng tinh dầu (%) D1 0,200 0,133c D2 30 0,668 0,446a D3 60 0,350 0,233b (Phụ lục 2) *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 70 0.500 30, 0.446 Hàm lượng tinh dầu (%) 0.450 0.400 0.350 0.300 60, 0.233 0.250 Hàm lượng tinh dầu (%) 0.200 0.150 0, 0.133 0.100 0.050 0.000 30 60 Thời gian ngâm mẫu (phút) Hình 3.4 Đồ thị ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lơi nước Hiện chưa có nghiên cứu tinh dầu Ngải cứu khảo sát thời gian ngâm nguyên liệu trước chưng cất Tuy nhiên dựa vào kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm chiết tỏi Lý Sơn nhóm tác giả Nguyễn Minh Chính cộng cho thấy thời gian ngâm nguyên liệu trước chưng cất tối ưu Tác giả kết luận việc ngâm tỏi dung dịch muối NaCl trước chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước (Nguyễn Minh Chính cộng sự, 2011) Dựa vào hình 3.5., tơi nhận xét mức thời gian ngâm mẫu 30 phút, lượng tinh dầu thu cao nhất: 0,668 ml, hàm lượng tinh dầu tối ưu 0,446% Vì vậy, kết luận mức thời gian 30 phút thời gian ngâm tối ưu để trích ly tinh dầu Ngải cứu 3.1.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Cố định yếu tố nguyên liệu già, cắt nhỏ, nồng độ dung dịch NaCl, thời gian ngâm mẫu, lượng nước Khảo sát thời gian chưng từ 30 phút đến 240 phút so sánh để tìm thời gian tối ưu ly trích tinh dầu Ngải cứu 71 Lá Ngải cứu cắt nhỏ, cho 150 g ± 0,001 g Ngải cứu vào bình cầu, chưng cất lơi theo nước thu lấy tinh dầu Ngải cứu Tinh dầu làm khan với bột Na2SO4 khan Kết thu trình bày bảng Bảng 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu Thời gian chưng Thể tích tinh dầu Hàm lượng tinh cất (phút) (ml) dầu thu (%) E1 30 0,220 0,147c E2 60 0,268 0,179c E3 90 0,377 0,251bc E4 120 0,509 0,339ab E5 150 0,584 0,389a E6 180 0,668 0,446a E7 210 0,653 0,435a E8 240 0,648 0,432a Nghiệm thức (Phụ lục 2) *Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 72 0.500 0.450 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 30 Hàm lượng tinh dầu (%) 0.147 60 0.179 90 0.251 120 0.339 150 0.389 180 0.446 210 0.435 240 0.432 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lơi nước Dựa vào hình 3.5, thời gian từ 30 phút đến giờ, tinh dầu tiết chậm Từ 30 phút đến giờ, tinh dầu tăng nhanh bắt đầu chậm sau 30 phút Hàm lượng tinh dầu thu thời điểm 0,446% bắt đầu bị hao hụt bớt 0,432% sau Thời gian chưng cất lâu lượng tinh dầu thu nhiều Tuy nhiên đến thời điểm định lượng tinh dầu khơng tăng thêm bị hao hụt bớt Mặt khác việc kéo dài thời gian chưng cất ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu nguyên liệu bị cháy, khét làm mùi thơm tự nhiên tinh dầu So sánh với kết tác giả Nguyễn Thị Hồng (2011), với 100g nguyên liệu Ngải cứu già, ngâm 300 ml dung dịch NaCl 10%, kết thu lượng tinh dầu 1,4 ml sau chưng cất 73 Tuy nhiên mẫu nguyên liệu thuộc vùng khác nên kết có chênh lệch Từ đó, nhận xét mẫu Ngải cứu nghiên cứu này, ghi nhận thời gian chưng cất tối ưu 3.1.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Cố định yếu tố tối ưu, nguyên liệu làm héo 45 – 50οC mức thời gian ngày, ngày, ngày Sau tiến hành ly trích so sánh lượng tinh dầu thu để chọn độ héo tối ưu Bảng 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu Thời gian để héo Thể tích tinh dầu Hàm lượng tinh (ngày) (ml) dầu thu (%) F1 0,142 0,094c F2 0,370 0,247b F3 0,668 0,446a F4 0,228 0,152c Nghiệm thức (Phụ lục 2) *Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 0.500 0.450 5, 0.446 Hàm lượng tinh dầu (%) 0.400 0.350 0.300 0.250 3, 0.247 Hàm lượng tinh dầu (%) 0.200 7, 0.152 0.150 0.100 0, 0.094 0.050 0.000 Thời gian để héo (ngày) 74 Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng thời gian để héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lơi nước 3.1.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Với mức tối ưu yếu tố chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất sau: 300 ml, 450 ml, 600 ml Ghi nhận lượng tinh dầu thu nghiệm thức, từ xác định lượng nước chưng cất tối ưu Tỷ lệ nguyên liệu / nước chưng ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất thu hồi tinh dầu Lượng nước nhiều, số thành phần tinh dầu có tính phân cực tan vào nước Nếu lượng khơng đủ hòa tan chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu Bảng 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng lượng nước chưng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu Thể tích nước Thể tích tinh dầu Hàm lượng tinh chưng (ml) (ml) dầu thu (%) G1 300 0,360 0,271b G2 450 0,668 0,446a G3 600 0,407 0,240b Nghiệm thức (Phụ lục 2) *Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 0.500 0.450 0.446 0.400 0.350 0.300 0.250 0.271 0.240 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 300 450 600 75 Hàm lượng tinh dầu (%) Hình 3.7 Đồ thị ảnh hưởng hàm lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước Với yếu tố cố định, tiến hành khảo sát lượng nước chưng cất Dựa vào hình 3.3 với mức nước 300 ml, 450 ml, 600 ml, lượng tinh dầu thu thay đổi đáng kể Tỷ lệ Ngải cứu/nước chưng ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất thu hồi tinh dầu Lượng nước nhiều, số thành phần tinh dầu có tính phân cực tan vào nước Nếu lượng nước q khơng đủ hòa tan chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu dẫn đến nguyên liệu dễ bị cháy, khét, ảnh hưởng xấu đến chất lượng hiệu suất thu tinh dầu So sánh kết khảo sát tác giả Nguyễn Thị Hồng Khi giữ nguyên yếu tố khác thay đổi lượng nước chưng cất, kết cho thấy lượng nước tối ưu để trích ly 500 ml tương đương tỷ lệ nguyên liệu/nước 1:3 Dựa vào hình 3.7, kết khảo sát thí nghiệm cho thấy hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu lượng nước chưng cất 450 ml cao (0,446%) tương đương với tỷ lệ nguyên liệu/nước 1:3 Khi tăng lượng nước chưng cất, hàm lượng tinh dầu giảm Từ rút kết luận mức 450ml tương đương tỷ lệ nguyên liệu/nước 1:3, tinh dầu thu nhận nhiều tối ưu Kết phù hợp với mẫu nguyên liệu khảo sát nghiên cứu 3.2 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu Ngải cứu 3.2.1 Đánh giá cảm quan Tinh dầu Ngải cứu ly trích phương pháp chưng cất lơi nước thu có tính chất sau:  Màu: suốt màu vàng sáng  Mùi: có mùi hắc, nồng  Vị: có vị đắng nhẹ, the cay 76 Hình 3.8 Tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 3.2.2 Định lượng tinh dầu Ngải cứu Tiến hành định lượng tinh dầu Ngải cứu, lấy 150 g Ngải cứu cắt nhỏ 0,5 – cm chưng cất điều kiện tối ưu thực nghiệm, kết thu sau: Bảng 3.8 Kết định lượng tinh dầu Ngải cứu Hàm lượng tinh Khối lượng Thể tích tinh dầu nguyên liệu (g) thu (ml) 150 0,624 0,416 150 0,730 0,487 150 0,651 0,434 Số lần Hàm lượng trung dầu thu (%) 0,446 bình (%) Nhận xét thảo luận: Hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu điều kiện tối ưu 0,446% Hàm lượng tinh dầu thu thực nghiệm mang tính tương đối so với loại tinh dầu thuộc chi Artemisia Hàm lượng tinh dầu thu thực nghiệm nhỏ hàm lượng tinh dầu thu điều kiện tối ưu cảu tác giả Nguyễn Thị Hồng thời 77 gian trích ly tối ưu thực nghiệm giờ, nhanh thời gian trích ly tác giả 3.2.3 Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu Tiến hành thí nghiệm xác định tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu ta thu kết sau: Bảng 3.9 Kết xác định tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu Số lần m0 m1 m2 D 2,696 3,748 3,610 0,869 2,680 3,745 3,632 0,893 2,713 3,750 3,628 0,882 Trung bình 2,696 3,748 3,623 0,881 Nhận xét thảo luận: Trong tinh dầu Ngải cứu thu chứa hàm lượng lớn D-camphor có tỉ trọng khoảng 0,910 – 0,950 cineole tỷ trọng khoảng 0,868 – 0,930 Do vậy, tỷ trọng trung bình tinh dầu Ngải cứu thu là: 0,881 có sở Hiện chưa có tài liệu nghiên cứu công bố tỉ trọng tinh dầu Ngải cứu, so sánh với kết thu loài Ngải cao hoa vàng (Đinh Huỳnh Kiệt, Nguyễn Xuân Dũng cộng sự,1990) với d25 0,9011 có tương đồng với kết thực nghiệm So với tỷ trọng nước 1, tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu chắn nhẹ nước, chưng cất tinh dầu Ngải cứu thu nằm trên, nước nằm 3.2.4 Chỉ số hóa học tinh dầu Ngải cứu Tiến hành xác định số lý hóa tinh dầu Ngải cứu thu kết sau: 78 Bảng 3.10 Kết xác định số hóa học tinh dầu Ngải cứu Số lần IA IE IS 3.366 36,465 39,831 3.927 37,857 41,514 3.366 37,026 40,392 Trung bình 3.533 37,026 40,579 Kết luận:  Chỉ số acid tinh dầu Ngải cứu là: IA = 3,533  Chỉ số ester hóa tinh dầu Ngải cứu là: IE = 37,026  Chỉ số savon hóa tinh dầu Ngải cứu là: IS = 40,579 3.2.5 Độ hòa tan ethanol Tiến hành xác định độ hòa tan tinh dầu ethanol 96o, 90o, 80o thu kết sau: Bảng 3.11 Kết xác định độ hòa tan tinh dầu Ngải cứu ethanol Thể tích Số lần ethanol tuyệt đối (ml) Thể tích Thể tích Thể tích ethanol 90o ethanol 80o ethanol 70o (ml) (ml) (ml) 10,3 14 23,6 48 10,5 14,2 24,3 48,7 10,5 14,5 24 47,5 10,43 14,23 23,97 48,07 1:10,43 1:14,23 1:23,97 1:48,07 Thể tích trung bình Tỷ lệ hòa tan tinh dầu Nhận xét thảo luận: Dựa vào tính chất vật lý tinh dầu, tinh dầu Ngải cứu gần không tan nước dễ bay lại tan tốt cồn dung môi hữu cơ, loại dầu mỡ, tan phần dung dịch kiềm, 79 Vì vậy, tăng nồng độ ethanol tỷ lệ thuận với độ hòa tan tinh dầu Nồng độ ethanol cao, tinh dầu tan tốt 3.3 Kết xác định thành phần hóa học tinh dầu Bảng 3.12 Kết xác định thành phần hóa học hàm lượng tương đối hợp chất mẫu tinh dầu Ngải cứu phương pháp GC – MS Độ tương Hàm TT Rt Tên chất lượng Mass hợp khổi phổ (%) 5,082 1R-α-Pinene 3,090 136 950 5,344 Camphene 6,463 136 950 5,725 1-Octen-3-ol 2,357 128 820 5,826 β-Pinene 1,743 136 931 5,971 β-Myrcene 0,985 136 951 6,035 2,3-Dehydro-1,8-cineole 0,379 152 832 6,295 α-Phellandrene 0,535 136 929 6,528 γ-Terpinene 0,730 136 933 6,680 o-Cymene 0,778 134 943 10 6,849 Eucalyptol (Cineole) 16,80 154 951 11 7,376 Pinocamphyl tiglate, iso- 1,840 236 793 12 8,393 Filifolone 0,919 150 873 13 8,814 p-Menth-2-en-1-ol 2,679 154 905 14 8,902 Chrysanthenone 2,996 150 944 15 9,245 Cis-2-Menthenol 2,361 154 900 16 9,435 D-(+)-Camphor 31,78 152 945 17 9,831 Pinocarvone 1,124 150 918 18 9,908 Camphol 5,707 154 937 19 10,168 Terpinen-4-ol 1,464 154 906 20 10,474 α-Terpinol 0,812 154 919 21 10,644 (-)-Myrtenol 2,048 152 873 80 22 10,879 Trans-Piperitol 1,160 154 898 23 10,965 Levoverbenone 0,457 150 894 24 11,144 Cis-Carveol 0,432 152 935 25 15,562 β-Elemene 0,825 204 909 26 16,314 Caryophyllene 3,240 204 952 27 17,144 Humulene 1,508 204 947 28 17,799 D-Germacrene 2,016 204 943 29 18,172 Bicyclogermacren 0.715 204 908 30 18,751 Cadina-1(10),4-diene 0,370 204 912 31 20,226 Caryophyllene oxide 0,805 220 902 32 20,424 Viridiflorol 0,508 222 909 33 21,817 Neointermedeol 0,410 222 879 (Phụ lục 4) * Kết phân tích có giá trị mẫu thí nghiệm Nhận xét thảo luận: Dựa vào bảng 3.12 cho thấy thành phần hóa học chiếm hàm lượng lớn tinh dầu Ngải cứu D-camphor (31,78%) cineole (16,80%), ngồi có chất α-Pinene (3,09%), β-Pinene (1,743%) Kết thu nhận có tương đồng với chất có mặt thành phần tinh dầu Ngải cứu thu thập miền Bắc Việt Nam (Thao et al., 2004), nhiên vị trí địa lí, thổ nhưỡng khác dẫn đến hàm lượng chất có khác biệt, cụ thể nghiên cứu tác giả ghi nhận hàm lượng cineole 21,7% cao kết bảng 3.12 5,9%; hàm lượng camphor 14,7% thấp kết bảng 3.12 17,08%; hàm lượng α-Pinene 4%; β-Pinene 9,8% Camphor hay long não ứng dụng nhiều việc xua đuổi côn trùng, thực tế sử dụng long não dạng rắn đặt tủ quần áo giúp xua đuổi gián, bọ Người Ấn Độ cổ đại sử dụng long não loại thuốc điều trị sốt Ngày long não sử dụng dạng lỏng loại thuốc ho thuốc thông mũi Tuy nhiên liều lượng sử dụng phải thông qua bác sĩ Thơng qua bảng kết 3.12 cho thấy xuất camphene camphol tiền 81 chất camphor Điều kết luận hàm lượng camphor tinh dầu Ngải cứu nghiên cứu tương đối cao Cineole sử dụng làm hương liệu, nước hoa mỹ phẩm mức thấp (0,002%) sản phẩm khác Cineole thành phần số loại nước súc miệng, thuốc ho Ngồi hoạt chất sử dụng thuốc trừ sâu thuốc chống trùng Vì vậy, tinh dầu Ngải cứu có tiềm to lớn vai trò chất phụ gia bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm, ức chế số vi sinh vật gây hại Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis, Escheichia coli (Erel et al.,2012) Ức chế mạnh chủng nấm Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata ND31, Candida tropicalis PNT20 (Lê Thị Thanh Thảo, 2018); Aspergillus niger (Blagojevic et al., 2006) 3.4 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước 3.4.1 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Kết hoạt tính kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu thể bảng 3.13 qua đường kính vùng ức chế Bảng 3.13 Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu Nghiệm thức A0 Độ pha lỗng tinh dầu Đường kính vòng Ngải cứu kháng khuẩn (mm) Kháng sinh Ampicillin (ĐC) 14 A1 Tinh dầu nguyên chất 21,333a A2 10-1 16,333b A3 10-2 12,667c A4 10-3 10,333d A5 10-4 8,667d (Phụ lục 3) *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 82 Nhận xét thảo luận Sau lần thực kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus nồng độ vi khuẩn 106 CFU/ml, ghi nhận kết sau: Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng tinh dầu ngun chất: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 21,333a mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng ≥ 20 mm Đánh giá: cực nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-1: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 16,333b mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng 15 – 19 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-2: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 12,667c mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng từ – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-3: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 10,333d mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng từ – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-4: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 8,667d mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng từ < mm Đánh giá: khơng nhạy (Celikel Kavas, 2008) Kết đường kính vòng kháng khuẩn kháng sinh Ampicillin đối chứng 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Dựa vào bảng 3.13., kết nghiệm thức A1 có đường kính vòng kháng khuẩn lớn, đạt mức cực nhạy Nghiệm thức A1 có vòng kháng nhạy kháng sinh Ampicillin đối chứng xét có kết kháng khuẩn tốt Ở nồng độ pha loãng tinh dầu lại, kết cho thấy nghiệm thức, đường kính vòng kháng khuẩn nằm mức nhạy nhạy Nhìn chung, tinh dầu Ngải cứu trích ly từ phương pháp chưng cất lơi nước cho kết kháng Staphylococcus aureus tốt tốt kháng sinh đối chứng nồng độ pha lỗng 83 Hình 3.9 Kết kháng Staphylococcus aureus a Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu b Kết kháng Staphylococcus aureus đối chứng kháng sinh Ampicilin 3.4.2 Hoạt tính kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Kết hoạt tính kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu thể bảng 3.14 qua đường kính vùng ức chế Bảng 3.14 Kết kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu Nghiệm thức B0 Độ pha loãng tinh dầu Đường kính vòng Ngải cứu kháng khuẩn (mm) Kháng sinh Ampicillin (ĐC) 17 B1 Tinh dầu nguyên chất 18,333a B2 10-1 14,667b B3 10-2 10,333c B4 10-3 9,000c B5 10-4 6,000d (Phụ lục 3) *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 84 Nhận xét thảo luận Sau lần thực kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu chủng vi khuẩn E.coli nồng độ vi khuẩn 106 CFU/ml, ghi nhận kết sau: Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng tinh dầu ngun chất: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 18,333a mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng 15 – 19 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-1: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 14,667b mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng - 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-2: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 10,333c mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-3: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 9,000c mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng từ – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-4: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 6,000d mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng < mm Đánh giá: khơng nhạy (Celikel Kavas, 2008) Kết đường kính vòng kháng khuẩn kháng sinh đối chứng 17 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Kết đường kính vòng kháng khuẩn kháng sinh Ampicillin đối chứng 17 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Dựa vào bảng 3.13., kết nghiệm thức A1 có đường kính vòng kháng khuẩn lớn, đạt mức nhạy Nghiệm thức A1 có vòng kháng nhạy kháng sinh Ampicillin đối chứng xét có kết kháng khuẩn tốt Ở nồng độ pha lỗng tinh dầu lại, kết cho thấy nghiệm thức, đường kính vòng kháng khuẩn nằm mức nhạy nhạy trừ nồng độ pha lỗng 10-4 khơng nhạy Nhìn chung tinh dầu Ngải cứu trích ly từ phương pháp chưng cất lơi nước cho kết kháng E.coli tốt Theo kết khảo sát hoạt lực kháng 85 khuẩn tinh dầu Ngải cứu Erel cộng tiến hành vào năm 2012, vòng kháng khuẩn đo nồng độ tinh dầu nguyên chất 11 mm Hình 3.10 Kết kháng E.coli a Kết kháng E.coli tinh dầu Ngải cứu b Kết kháng E.coli đối chứng kháng sinh 3.4.3 Kết hoạt tính kháng Salmonella typhimurium tinh dầu Ngải cứu thu phương pháp chưng cất lôi nước Kết hoạt tính kháng Salmonella typhimurium tinh dầu Ngải cứu thể bảng 3.15 qua đường kính vùng ức chế 86 Bảng 3.15 Kết kháng Samonella typhimurium tinh dầu Ngải cứu Nghiệm thức C0 Độ pha lỗng tinh dầu Đường kính vòng Ngải cứu kháng khuẩn (mm) Kháng sinh Ampicillin 15 (ĐC) C1 Tinh dầu nguyên chất 14,667a C2 10-1 12,000b C3 10-2 10,333c C4 10-3 9,000d C5 10-4 7,333e (Phụ lục 3) *Ghi chú: Trong cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a,b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b, ) sai khác thống kê với p < 0,05 Nhận xét thảo luận Sau lần thực kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu chủng vi khuẩn Salmonella nồng độ vi khuẩn 106 CFU/ml, ghi nhận kết sau: Ở nồng độ ngun chất: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 14,667a mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-1: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 12,000b mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-2: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 10,333c mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-3: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 9,000d mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng từ – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-4: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 7,333e mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình mm Đánh giá: không nhạy (Celikel Kavas, 2008) 87 20 mm Đánh giá: cực nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-1: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 20,333a mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng > 20 mm Đánh giá: cực nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-2: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 16,667b mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng 15 - 19 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Ở nồng độ tinh dầu pha loãng 10-3: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 10,333c mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình nằm khoảng từ – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) 89 Ở nồng độ tinh dầu pha lỗng 10-4: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là: 9,3333c mm Kết luận: đường kính vòng kháng khuẩn trung bình khoảng từ – 14 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Kết đường kính vòng kháng khuẩn kháng sinh Ampicillin đối chứng 17 mm Đánh giá: nhạy (Celikel Kavas, 2008) Dựa vào bảng 3.16., kết nghiệm thức D1 D2 có đường kính vòng kháng khuẩn trung bình đạt mức cực nhạy, tốt so với kháng sinh Ampicilin Từ cho thấy tinh dầu Ngải cứu trích ly từ phương pháp chưng cất lôi nước cho kết kháng Shigella boydii tốt Hình 3.12 Kết kháng Shigella boydii a Kết kháng Shigella boydii tinh dầu Ngải cứu b Kết kháng Shigella boydii đối chứng kháng sinh 90 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ trình nghiên cứu ta thu thông số kỹ thuật cho q trình trích ly tinh dầu Ngải cứu phương pháp chưng cất lôi nước quy mơ phòng thí nghiệm:  Ngun liệu cắt nhỏ: cm  Tỷ lệ Ngải cứu/nước: 1:3  Nồng độ dung dịch NaCl: 10%  Thời gian ngâm nguyên liệu: 30 phút  Thời gian chưng cất: 180 phút kể từ giọt tinh dầu ngưng tụ nhỏ xuống ống hứng tinh dầu Tinh dầu Ngải cứu thu có màu vàng sáng, nhẹ nước, có mùi nồng đặc trưng, vị cay the Đã xác định số vật lý hóa học tinh dầu Ngải cứu sau:  Hàm lượng tinh dầu Ngải cứu: 0,446%  Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu: 0,881  Chỉ số acid (IA): 3,533  Chỉ số savon hóa (IS): 40,579  Chỉ số ester hóa (IE): 37,026  Chỉ số ethanol: Tỷ lệ tinh dầu/cồn tuyệt đối = 1:10,43 Tỷ lệ tinh dầu/cồn 96o = 1:14,23 Tỷ lệ tinh dầu/cồn 80o = 1:23,97 Tỷ lệ tinh dầu/cồn 70o =2 1:48,07 Thành phần hóa học tinh dầu Ngải cứu D-camphor (31,78%) cineole (15,80%), có chất α-Pinene (3,09%), β-Pinene (1,743%) Kết kháng khuẩn khảo sát loại vi khuẩn: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Shigella boydii cho thấy tinh dầu Ngải cứu có khả kháng loại vi khuẩn gram (+), gram (-) Tinh dầu nguyên chất có khả kháng vi sinh vật mạnh có hoạt lực kháng 91 khuẩn mạnh kháng sinh Ampicillin đối chứng Khả kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu giảm dần theo nồng độ pha loãng tinh dầu Kết cho thấy dù nồng độ pha loãng tinh dầu Ngải cứu thấp 10-4 cho kết nhạy chủng Salmonella typhimurium, Escherichia coli 4.2 Kiến nghị Đề tài cần nghiên cứu thêm:  Các loại Ngải cứu phân bố lãnh thỗ Việt Nam điều kiện canh tác, độ tươi, héo Ngải cứu ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly tinh dầu phương pháp chưng cất  Ứng dụng phương pháp vào trình chưng cất như: chưng cất nước có hỗ trợ vi sóng, sóng siêu âm,…  Xác định tính chất vật lý khác tinh dầu thu như: số chiết quang, số khúc xạ, nhiệt độ kết tinh tinh dầu,…  Xác định số hóa học như: số iod,…  Phát triển sản phẩm từ tinh dầu Ngải cứu ứng dụng thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Tất Lợi, 2004 Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kỹ Thuật [2] Lã Đình Mỡi, 2001 Tài ngun thực vật có tinh dầu Việt Nam, NXB Nông Nghiệp [3] Lê Ngọc Thạch, 2003 Tinh Dầu, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [4] Mai Thị Anh Tú, 2009 Khảo sát tinh dầu tần dầy lá, Đại học Cần Thơ [5] Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh [6] Nguyễn Quốc Châu Thanh, 2013 Ly trích khảo sát thành phần hóa học tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus stapf), Trường Đại học Cần Thơ [7] Nguyễn Tấn Thịnh, 2013 Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp lược vàng Callisia fragrans (lindl) Wood, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Công nghệ Kỹ thuật, Tp.HCM [8] Nguyễn Tiến Thắng, 2012 Công nghệ sản xuất sinh phẩm Nhà xuất Bộ giáo dục đào tạo – Trường đại học công nghệ kỹ thuật Tp.HCM [9] Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu lốt ly trích từ phương pháp lơi nước phương pháp vi sóng, Trường Đại học Cần Thơ [10] Nguyễn Thị Hồng, 2011 Nghiên cứu xác định thành phần cấu tạo số hợp chất hóa học tinh dầu từ Ngải cứu Quảng Nam Đại học Đà Nẵng, Luận văn Thạc sĩ khoa học [11] Phùng Thị Ái Hữu, 2012 Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hoá học tinh dầu sả chanh Cẩm Lệ - Đà Nẵng, Trường Đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng [12] Tơn Long Dày, 2013 Ly trích khảo sát thành phần hóa học tinh dầu Bạc Hà Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp 93 [13] Tôn Nữ Minh Nguyệt cộng sự, 2010 Chất kháng khuẩn thực vật, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh [14] Lê Thị Thanh Thảo cộng sự, 2018 Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật chống oxy hóa thuộc họ Asteraceae Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, phụ tập 22, số 1, 2018 2.Tài liệu tiếng Anh [15] Juvatkar PV, Kale MK., Jalalpure SS, Waghulde Sandeep, Naik Pravin, Jain Vishal, Antimicrobial activity of Leaves of Artemisia vulgaris L, USC.ES [16] Sujatha Govindaraj and Bollipo D RanjithaKumari, Composition and Larvicidal Activity of Artemisia vulgaris L Stem Essential Oil Against Aedes aegypti, Jordan Journal of Biological Sciences, Volume 6, Number 1, March 2013, Pages 11 – 16 [17] Garza I, Swanson J W Prophylaxis of migraine Neuropsychiatr Dis Treat 2006 September; 2(3): 281–291 [18] Asakura K, Kanemasa T, Minagawa K, et al 2000 Alpha-eudesmol, a P/Q-type Ca2+ channel blocker, inhibits neurogenic vasodilation and extravasation following electrical stimulation of trigeminal ganglion Brain Res, 873:94–101 [19] Tsuneki H, Ma EL, Kobayashi S, Sekizaki N, Maekawa K, Sasaoka T, Wang MW, Kimura I Antiangiogenic activity of beta-eudesmol in vitro and in vivo Eur J Pharmacol 2005 Apr 11;512(2-3):105-15 [20] Ma EL, Li YC, Tsuneki H, Xiao JF, Xia MY, Wang MW, Kimura I Beta-eudesmol suppresses tumour growth through inhibition of tumour neovascularisation and tumour cell proliferation J Asian Nat Prod Res 2008 Jan-Feb;10(1-2):159-67 [21] Chiou L C., Chang C C Antagonism by β-eudesmol of neostigmineinduced neuromuscular failure in mouse diaphragms European journal of pharmacology ISSN 0014-2999 1992, vol 216, no2, pp 199-206 94 [22] Chiou LC, Ling JY, Chang CC beta-Eudesmol as an antidote for intoxication from organophosphorus anticholinesterase agents Eur J Pharmacol 1995 Jan 13;292(2):151-6 [23] Mugwort (Artemisia vulgaris) Oils Chapter | 65 579 Essential Oils in Food Preservation, Flavor and Safety, First Edition, 2016, 573-579 [24] Alizade M., Aghaei M., Saadatian M., Sharifian I Chemical composition of essential oil of Artemisia vulgaris from West Azerbaijan, Iran Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 2012 [25] Asta, J., Juste, B., 2006 Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L (Mugwort) from North Lithuania Chemistry 1, 12– 15 [26] Bamoniri, A., Mirjalili, B.B.F., Mazoochi, A., Batooli, H., 2010 Chemical composition of Artemisia vulgaris L from Kashan area isolated by nano scale injection Iran J Org Chem (4), 533–536 [27] Barney, J.N., Hay, A.G., Weston, L.A., 2005 Isolation and characterization of allelopathic volatiles from Mugwort (Artemisia vulgaris) J Chem Ecol 31 (2), 247–265 [28] Bhatt, L.R., Lee, J.S., Baek, S.H., 2007 Evalution of antioxidant activity of essential oil from Artemisia vulgaris Korean J Orient Physiol Pathol 21 (2), 528–531 [29] Blagojevic, P., Radulovic, N., Palic, R., Stojanovic, G.J., 2006 Chemical composition of the essential oil of Serbian wild-growing Artemisia absinthium and Artemisia vulgaris J Agric Food Chem 54, 470–478 [30] Erel, S.B., Reznicek, G., Senol, S.G., Yavasogulu, N.U.K., Konyalioglu, S., Zeybek, A.U., 2012 Antimicrobial and antioxidant properties of Artemisia L species from western Anatolia Turk J Biol 36, 75–84 95 [31] Gilani, A.H., Yaeesh, S., Jamal, Q., Ghayur, M.N., 2005 Hepatoprotective activity of aqueous-methanol extract of Artemisia vulgaris Phytother Res 19, 170–172 [32] Govindaraj, S.P., Kumari, B.D.R., 2013 Composition and larvicidal activity of Artemisia vulgaris L stem essential oil against Aedesaegypti Jordan J Biol Sci (1), 11–16 [33] Gruenwald, J., Brendler, T., Jaenicke, C., 2008 PDR of Herbal Medicine, fourth ed Medical Economics Company [34] Haider, F., Dwivedi, P.D., Naqvi, A.A., Bagchi, G.D., 2003 Essential oil composition of Artemisia vulgaris harvested at different growth periods under Indo-Gangetic plain conditions J Essent Oil Res 15, 376–378 [35] Harimath, S.K., Kolume, D.G., Muddapur, U.M., 2011 Antimicrobial activity of Artemisia vulgaris Linn (Damanaka) Int J Res Ayurveda Pharm (6), 1674–1675 [36] Hussain, A.I., Anwar, F., Sherazi, S.T.H., Przybylski, R., 2008 Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depend on seasonal variations Food Chem 108, 986–995 [37] Jerkovic, I., Mastelic, J., Milos, M., Juteau, F., Masotti, V., Viano, J., 2003 Chemical variability of Artemisia vulgaris L essential oils originated from the Mediterranean area of France and Croatia Flavour Fragr J 18, 436–440 [38] Judzentiene, A., Buzelyte, J., 2006 Chemical composition of essential oils of Artemisia vulgaris L (Mugwort) from plants grown in North Lithuania Chemistry 17 (1), 12–15 [39] Mucciarelli, M., Caramiello, R., Maffei, M., 1995 Essential oils from some Artemisia species growing spontaneously in North-West Italy Flavour Frag J 10, 25–32 96 [40] Pino, J.A., Rohlado, A., Fuentcs, V., 1999 Composition of the essential oil of Artemisia vulgaris L herb from Cuba J Essent Res 11, 477–478 [41] Sharifian, I., Hashemi, S.M., Darvishzadeh, A., 2013 Fumigant toxicity of essential oil of Mugwort (Artemisia vulgaris L.) against three major stored product beetles Arch Phytopathol PFL 46 (4), 445–450 [42] Silva, T.D.J.A., 2004 Mining the essential oils of the Anthemideae Afr J Biotechnol (12), 706–720 [43] Sun, W.C., Han, J.X., Yang, W.Y., Deng, D.A., Yue, X.F., 1992 Antitumor activities of derivatives of artemisic acid and artemisinin B in vitro Acta Pharm Sin 13, 541–543 [44] Surburg, H., Panten, J., 2006 Common Fragrance and Flavor Materials Preparation, Properties and Uses, fifth ed Wiley-VCH, Weinheim ISBN: 978-3-527-31315-0 [45] Tang, W., Eisenbrand, G., 2011 Handbook of Chinese Medicinal Plants: Chemistry, Pharmacology, Toxicology, vol Wiley VCH, Weinheim ISBN: 978-3-527-32226-8 [46] Thao, N.T.P., Thuy, N.T., Hoi, T.M., Muselli, T.H.T.A., Bighelli, A., Castola, V., Casanova, J., 2004 Artemisia vulgaris L from Vietnam: chemical variability and composition of the oil along the vegetative life of the plant J Essent Oil Res 16, 358–361 [47] Tigno, X.T., Guzman, F.D., Flora, A.M.T.V., 2000 Phytochemical analysis and hemodynamic actions of Artemisia vulgaris L Clin Hemorheol Micro-circ 23, 167–175 [48] Tobyn, G., Denham, A., Whitelegg, M., 2011 The Western Herbal Tradition: 2000 Years of Medicinal Plant Knowledge Elsevier Churchil Livingstone ISBN: 978-0-443-10344-5 pp 123 [49] Walter, H.L., Memory, P.F.E.L., 2003 Medical Botany: Plants Affecting Human Health, second ed John Wiley and Sons, New York ISBN: 978-0-471-62882-8 pp 345 97 [50] Wang, J., Zhu, F., Zhou, X.M., Niu, C.Y., Lei, C.L., 2005 Repellent and fumigant activity of essential oil from Artemisia vulgaris to Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) J Stored Prod Res 42, 339–347 [51] Willcox, M., 2009 Artemisia species: from traditional medicines to modern antimalarial and back again J Altern Complem Med 15, 101– 109 [52] Wright, C.W., 2002 Artemisia: Medicinal and Aromatic Plantsindustrial Profiles Taylor and Francis, New York ISBN: 978-0-41527212-4 [53] Yoshikawa, M., Shimada, H., Matsuda, H., Yamahara, J., Murakami, N., 1996 Bioactive constituents of Chinese natural medicines Chem Pharm Bull 44 (9), 1656–1662 [54] Govindaraj S, Kumari BD, Cioni PL, Flamini G Mass propagation and essential oil analysis of Artemisia vulgaris J Biosci Bioeng, 2008 Mar; 105 (3): 176-83 Tài liệu Internet [55] Chi cục thú y TP Hồ Chí Minh, Ngộ độc thực phẩm vi khuẩn E coli, 6/2012, http://chicucthuyhcm.org.vn/new/2005/09/23/Ngo-doc-thuc-pham-do-vikhuan-Ecoli.aspx [56] Đại Học Y Thái Bình, Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp, 5/2012, http://thuvien.yhvn.vn/node/1030 http://thuvien.yhvn.vn/node/1029 http://thuvien.yhvn.vn/node/1012 [57] https://vi.wikipedia.org/wiki/Ngải_cứu 98 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần chất môi trường cách pha số dung dịch thử Dung dịch chuẩn độ KOH 0,1 N Cân khoảng 0,56 g KOH rắn, hòa tan 100 ml ethanol 96o, ta dung dịch KOH cồn nồng độ khoảng 0,1 N Môi trường tăng sinh NB Cân xác g mơi trường Peptone, g mơi trường Beef extract (có thể thay g môi trường Meat extract), 15 g muối NaCl Hòa 23 g mơi trường Nutrient Broth 1000 ml nước cất vô trùng Đun sôi, khuấy khử trùng nồi hấp 121°C 15 phút PH cuối 7,0 ± 0,2 Môi trường cấy kháng khuẩn NA Cân xác g mơi trường Peptone, g mơi trường Beef extract (có thể thay g môi trường Meat extract), 15 g muối NaCl 15 g Agar Hòa 38 g mơi trường Nutrient Agar 1000 ml nước cất vô trùng Đun sôi, khuấy khử trùng nồi hấp 121°C 15 phút PH cuối 7,0 ± 0,2 Phụ lục 2: Xử lý thống kê yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu trình chưng cất phương pháp lơi nước Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng kích cỡ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu nhận sau 3h chưng cất Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Model 0.18920267 0.09460133 124.49 Error 0.00455933 0.00075989 Corrected Total 0.19376200 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.976469 9.672310 0.027566 0.285000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.18920267 0.09460133 124.49 F F Model 0.04420417 0.04420417 30.24 0.0053 Error 0.00584667 0.00146167 Corrected Total 0.05005083 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.883185 10.62485 0.038232 0.359833 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.04420417 0.04420417 30.24 0.0053 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.001462 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.0867 t Grouping Mean N NT A 0.44567 B1 B 0.27400 B2 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaCl chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu nhận sau 3h chưng cất Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Model 0.13765667 0.04588556 94.51 Error 0.00388400 0.00048550 Corrected Total 11 0.14154067 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.972559 7.935437 0.022034 0.277667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.13765667 0.04588556 94.51 F F NT 0.15263756 0.07631878 112.29 F F F NT 0.30299363 0.04328480 15.75 F NT 0.21357667 0.07119222 131.23 F F 0.0002 Corrected Total 0.07865089 R-Square Coeff Var Root MSE Mean 0.937920 8.945683 0.028527 0.318889 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.07376822 0.03688411 45.32 0.0002 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.000814 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.057 t Grouping Mean N NT A 0.44567 G2 B 0.27100 G3 B B 0.24000 G1 Phụ lục 3: Xử lý thống kê kết mức độ kháng khuẩn tinh dầu Ngải cứu nhóm vi sinh vật thị Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu Ngải cứu Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 308.4000000 77.1000000 105.14 F NT 308.4000000 77.1000000 105.14 F Model 283.3333333 70.8333333 177.08 F NT 283.3333333 70.8333333 177.08 F Model 95.33333333 23.83333333 119.17 F NT 95.33333333 23.83333333 119.17 F Model 348.4000000 87.1000000 118.77 F NT 348.4000000 87.1000000 118.77