SO SÁNH hàm LƯỢNG TERPENOIDS và HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM in vitro của các CAO CHIẾT vỏ THÂN QUÝT GAI (atalantia buxifolia)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH HÀM LƯỢNG TERPENOIDS VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM in vitro CỦA CÁC CAO CHIẾT VỎ THÂN QUÝT GAI (Atalantia buxifolia) Người hướng dẫn: TS TRƯƠNG THỊ DIỆU HIỀN Người thực hiện: TẠ NHẬT THÚY ANH Lớp : 14060302 Niên khóa: 2014 – 2019 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Trương Thị Diệu Hiền Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, luận văn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Trường Đại học Tơn Đức Thắng khơng liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền gây trình thực đề tài (nếu có) TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Tác giả (ký tên ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Người xưa có câu: “Một làm chẳng nên non, ba chụm lại nên núi cao”, thật vậy, phía sau thành cơng cần có hợp tác hỗ trợ từ nhiều phía giúp đỡ mang ý nghĩa to lớn Trong suốt trình thực khóa luận, em may mắn nhiều anh, chị, bạn bè q thầy quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình Song, dìu dắt, bảo người Thầy chìa khóa quan trọng giúp em định hướng hồn thành khóa luận cách tốt Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô Trương Thị Diệu Hiền ln tận tình dạy, truyền đạt cho em khơng kiến thức bổ ích mà kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện giúp em học hỏi, khắc phục hoàn thiện đề tài khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể Q thầy trường Đại học Tôn Đức Thắng truyền đạt cho em vốn kiến thức quý giá suốt thời gian học tập rèn luyện trường Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đặc biệt bạn phòng nghiên cứu chun đề ln hỗ trợ, động viên quan tâm em thời gian qua Do thời gian thực khóa luận vốn kiến thức hạn chế, thế, thiếu sót khơng thể tránh khỏi Em kính mong nhận nhận xét, góp ý quý thầy để khóa luận hồn thiện Một lần em xin trân trọng cảm ơn! TÓM TẮT Từ xưa đến nay, loài thuộc họ Citrus trở thành phần quen thuộc thuốc Đông y, lưu truyền rộng rãi dân gian Trong đó, Qt gai (A buxifolia) loài tiêu biểu ứng dụng điều trị bệnh viêm, hen, suyễn Nhằm góp phần tăng cao liệu khoa học giá trị dược liệu Quýt gai, đề tài tiến hành đánh giá ảnh hưởng dung môi, nhiệt độ tách chiết, thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng terpenoids phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai khả kháng viêm in vitro cao chiết Đề tài khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết (hexane, ethyl acetate (EtOAc), acetone (Me2CO), ethanol (EtOH), hexane:ethyl acetate (1:1), hexane:acetone (1:1), hexane:ethanol (1:1), nhiệt độ ngâm mẫu (6, 26, 46, 66 86 o C), thời gian ngâm mẫu (0, 12, 24, 36 48 giờ), đến hàm lượng terpenoids phân lớp cao chiết PE, HE cao tổng Kết cho thấy, terpenoids phát tất phân đoạn dịch chiết vỏ thân Quýt gai điều kiện tách chiết khác phương pháp thị màu đặc trưng Hàm lượng terpenoids phân lớp PE HE thấp chiết lỏng lỏng với dịch chiết hexane, 0,185e ± 0,016 % 0,324e ± 0,016 % Hàm lượng terpenoids phân lớp HE cao chiết với dịch hexane:acetone (0,731 a ± 0,042%) Ở nhiệt độ tách chiết 66 oC, hàm lượng terpenoids thu cao hai phân lớp cao chiết, 1,102a ± 0,042 % phân lớp PE 0,843a ± 0,042 % phân lớp HE Với thời gian ngâm 24 cho kết lượng terpenoids cao với 1,102a ± 0,042% phân lớp PE 0,843a ± 0,042 % phân lớp HE Thành phần hóa học phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) xác định kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) HPLC với ursolic acid (Sigma, Singapore) làm chất chuẩn Kết cho thấy, giá trị R f spot cao chiết tương ứng với R f chất chuẩn ursolic acid (Rf = 0,31) Với thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro, thông qua tiêu: khả ức chế biên tính albumin, ức chế phân giải protein, ổn định màng tế bào, kháng enzyme lipoxxygenase Kết cho thấy phân lớp cao chiết HE cao tổng có khả kháng viêm tốt Cụ thể, khả ức chế biến tính albumin nồng độ 200 μg/mL cho thấy, cao tổng cao HE cho kết ức chế biến tính albumin cao khơng khác biệt mặt thống kê, 69,114 a ± 1,989 % 67,251a ± 1,976 % Tương tự, khả ức chế phân giải protein, phần trăm ức chế phân giải protein cao tổng đạt 65,272 a ± 0,396 %, chiếm ưu so với phân lớp PE (57,932b ± 0,951), khơng khác biệt có nghĩa mặt thống kê với phân đoạn HE (64,167a ± 0,527 %) Với khả ức chế tan huyết, cao tổng cao HE cho kết ức chế 55,922a ± 0,329 % 53,860a ± 0,917 % Kết khảo sát khả ổn định màng tế bào cho thấy, nồng độ 200 μg/mL, phần trăm ức chế tan huyết cao chiết tổng đạt 55,922 a ± 0,329 %, cao so với phân lớp PE (48,556b ± 1,446), không khác biệt với phân đoạn HE (53,860a ± 0,917 %) Cao chiết tổng cho kết ức chế hoạt động enzyme lipoxygenase đạt 60,661a ± 0,537 %, cao so với phân đoạn HE (59,265b ± 0,646 %) Tuy nhiên, giá trị IC50 cho thấy, phân lớp HE có hoạt tính ức chế tối ưu với giá trị IC 50 thu thấp (106,53 ± 9,224 μg/mL) Tóm lại, đề tài điều kiện tách chiết tối ưu để thu nhận terpenoids từ vỏ thân Quýt gai: hỗn hợp dung môi hexane:acetone (1:1) 66 oC 24 ngâm mẫu Cùng với khả kháng viêm in vitro phân đoạn cao chiết, góp phần tăng thêm luận khoa học cho nghiên cứu sau Quýt gai (A buxifolia) MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Giới thiệu Quýt gai (Atalantia buxifolia) 2.2 Phương pháp chiết lỏng - lỏng để thu nhận hợp chất tự nhiên 2.3 Triệu chứng viêm phương pháp điều trị CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12 3.1 Địa điểm thời gian thực 12 3.2 Đối tượng nghiên cứu 12 3.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất .12 3.4 Phương pháp tiến hành 12 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 19 4.1 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến diện nhóm terpenoids dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 19 4.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến hàm lượng terpenoids phân lớp dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 21 4.3 Sắc ký lớp mỏng (TLC) HPLC .25 4.4 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC .42 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Abs CHCl3 cs DMSO EtOAc EtOH HPLC : Khả hấp thu xạ (Absorbance) : Chloroform : cộng : Dimethyl sulfoxide : Ethyl acetate : Ethanol : Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) IC50 : Nồng độ ức chế 50% đối tượng khảo sát (Half maximal inhibitory concentration) Me2CO : Acetone MeOH : Nước cất NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) NSAIDs : Thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal antiinflammatory drugs) OD : Optical density RBCs : Tế bào hồng cầu (Red blood cells) Rf : Hệ số lưu giữ (Retention factor) SD : Độ lệch chuẩn (Standard deviation) TLC : Sắc ký mỏng (Thin layer chromatography) tR : Thời gian lưu (retention time) DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 2.1: Cây qt gai Hình 3.1: Quy trình thu nhận cao chiết tổng vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 13 Hình 3.2: Quy trình thu nhận cao terpenoids vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) .14 Hình 4.1: Sắc ký lớp mỏng phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) soi bước sóng 254 nm (a) màu chất phun (b) 26 Hình 4.2: Phương trình đường chuẩn ursolic acid 27 Hình 4.3: Khả ức chế biến tính albumin phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 29 Hình 4.4: Khả ức chế phân giải protein phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 31 Hình 4.5: Khả ổn định màng tế bào phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 33 Hình 4.6: Khả kháng enzyme lipxygenase phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 35 32 200 IC50 (μg/mL) 48,556b ± 1,446 53,860a ± 0,917 55,922a ± 0,329 210,160 ± 13,495 159,91 ± 1,995 158,32 ± 1,595 Kết bảng 4.9 cho thấy, phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai ( A buxifolia) ảnh hưởng có nghĩa đến khả ức chế tan huyết theo tăng dần nồng độ Tại nồng độ 100 μg/mL, khả ổn định màng phân đoạn cao chiết tốt so với đối chứng dương aspirin (22,982 ± 5,698 %) Trong đó, phân lớp cao chiết PE cho kết ức chế thấp (33,707 c ± 1,983 %), tiếp đến cao chiết tổng (40,130b ± 1,065 %) phân lớp HE có khả ổn định màng cao với 44,196a ± 1,704 % Khi tăng nồng độ đến 200 μg/mL, khả ức chế tan huyết cao chiết tổng đạt 55,922 a ± 0,329 %, chiếm ưu so với phân lớp PE (48,556b ± 1,446), khơng khác biệt có nghĩa mặt thống kê với phân đoạn HE (53,860a ± 0,917 %) Bên cạnh đó, giá trị IC50 cho thấy, cao chiết tổng có khả ổn định màng tế bào tốt với IC 50 = 158,32 ± 1,595 μg/mL, không khác biệt nhiều so với phân lớp HE (159,91 ± 1,995 μg/mL) thấp phân lớp PE (210,160 ± 13,495 μg/mL) So sánh với nghiên cứu G Leelaprakas [28], nồng độ 200 μg/mL, dịch chiết MeOH từ Enicostemma Axillare cho kết ức chế đạt 48 %, thấp so với phân đoạn cao chiết từ vỏ thân Quýt gai Tuy nhiên, theo nghiên cứu Govindappa [46], dịch chiết ethanol từ Wedalia tribiloba có khả ổn định màng tốt so với dịch chiết từ loài A buxifolia (78,11%) Kết so sánh cho thấy tiềm việc kết hợp dịch chiết A buxifolia với dịch chiết từ nhiều loài thực vật khác, góp phần tạo nên loại thuốc điều trị viêm hiệu lành tính 33 60 b 50 a a a b %I 40 30 a a c b a b b 20 10 25 50 100 200 Nồng độ mẫu (ppm) PE HE CT Hình 0.8: Khả ổn định màng tế bào phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 4.4.4 Kháng enzyme lipoxygenase Lipoxygenase thuộc nhóm enzyme oxi hóa, có chứa phân tử sắt khơng mang nhân heme trung tâm hoạt động Enzyme liên quan mật thiết đến đáp ứng miễn dịch thể - viêm, thông qua phản ứng phân giải arachidonic acid Các chất điều hòa trung gian tạo thành (leuketrienes, prostaglandin,…) đóng vai trò quan trọng việc gây tổn thương nghiêm trọng cho mô tế bào [57, 58] Do đó, khảo sát khả kháng lipoxygenase tiêu quan trọng nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro Qua kết khảo sát tiêu ức chế biến tính albumin, ức chế phân giải protein khả ổn định màng tế bào, phân lớp cao chiết HE cao tổng có hoạt tính mạnh so với phân lớp PE Vì thế, hai cao chiết tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng lipoxygenase kết thể bảng 4.10: Bảng 4.11: Khả kháng enzyme lipxygenase phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) Nồng độ mẫu % Kháng enzyme lipoxygenase 34 (μg/mL) 25 50 100 200 IC50 (μg/mL) Phân lớp HE 31,671a ± 0,555 43,638a ± 0,520 57,135a ± 0,552 59,265b ± 0,646 Cao tổng 30,764b ± 0,014 42,338a ± 0,939 53,657b ± 0,891 60,661a ± 0,537 106,53 ± 9,224 114,49 ± 5,372 Nhìn chung, phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt gai ảnh hưởng có nghĩa đến khả ức chế hoạt động enzyme lipoxygenase theo tăng dần nồng độ Tại nồng độ 100 μg/mL, tỉ lệ kháng enzyme lipoxygenase phân đoạn cao chiết thấp so với đối chứng dương indomethacin (65,140 ± 2,177 %) nồng độ Trong đó, phân lớp cao chiết HE cho kết ức chế tốt hai loại cao chiết khảo sát, với tỉ lệ 57,135 a ± 0,552 % Cao chiết tổng cho kết ức chế hoạt động enzyme lipoxygenase đạt 60,661 a ± 0,537 %, cao so với phân đoạn HE (59,265b ± 0,646 %) nồng độ 200 μg/mL Tuy nhiên, giá trị IC50 cho thấy, phân lớp HE có hoạt tính ức chế tối ưu với giá trị IC 50 thu thấp (106,53 ± 9,224 μg/mL) So sánh với nghiên cứu G Leelaprakas [28], nồng độ 200 μg/mL, dịch chiết MeOH từ Enicostemma Axillare cho kết ức chế đạt 17 %, thấp 3,45 lần so với phân đoạn cao chiết từ vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) Kết so sánh cho thấy, lồi A buxifolia có hiệu ức chế enzyme lipoxygenase cao so với Enicostemma Axillare Kết chứng minh loài có tác dụng ngăn cản q trình chuyển hóa arachidonic acid, tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu hỗ trợ điều trị viêm 35 70 a 60 50 %I 40 30 a a b a b a b 20 10 25 50 100 200 Nồng độ mẫu (ppm) HE CT Hình 0.9: Khả kháng enzyme lipxygenase phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 36 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Kết thu từ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết (hexane, ethyl acetate (EtOAc), acetone (Me 2CO), ethanol (EtOH), hexane:ethyl acetate (1:1), hexane:acetone (1:1), hexane:ethanol (1:1)), nhiệt độ ngâm mẫu (6, 26, 46, 66 86 oC), thời gian ngâm mẫu (0, 12, 24, 36 48 giờ), đến hàm lượng terpenoids phân lớp cao chiết hoạt tính kháng viêm in vitro phân đoạn dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) được: Terpenoids phát tất phân đoạn dịch chiết vỏ thân Quýt gai điều kiện tách chiết khác phương pháp thị màu đặc trưng Điều kiện tách chiết tối ưu để thu nhận terpenoids từ vỏ thân Quýt gai: hỗn hợp dung môi hexane:acetone (1:1) 66 oC 24 ngâm mẫu Thành phần hóa học phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) xác định kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) HPLC với ursolic acid (Sigma, Singapore) làm chất chuẩn Kết cho thấy, giá trị R f cao chiết tương ứng với Rf chất chuẩn ursolic acid (R f = 0,31) Ở bước sóng 254 nm, khơng có xuất ursolic acid Các phân đoạn cao chiết lại xuất hầu hết spot giống Dựa theo độ đậm màu spot, dự đốn sơ bộ: hàm lượng chất diện phân lớp PE so với hai cao chiết lại Phân lớp cao chiết PE có spot, cao chiết HE có spot có spot xuất vị trí cao tổng Kết phân tích HPLC xác định hàm lượng ursolic acid có cao chiết HE cao tổng Với thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro, kết phân đoạn cao chiết từ vỏ thân Quýt gai có khả kháng viêm tốt, góp phần hỗ trợ điều trị viêm Cụ thể, khả ức chế biến tính albumin nồng độ 200 μg/mL cho thấy, cao tổng cao HE cho kết ức chế biến tính albumin cao khơng khác biệt mặt thống kê, 69,114 a ± 1,989 % 67,251a ± 1,976 %, phân lớp PE có phần trăm ức chế thấp với 52,565 b ± 0,978 % Tương tự, khả ức chế phân giải protein, phần trăm ức chế phân giải protein 37 cao tổng đạt 65,272a ± 0,396 %, chiếm ưu so với phân lớp PE (57,932 b ± 0,951), khơng khác biệt có nghĩa mặt thống kê với phân đoạn HE (64,167 a ± 0,527 %) Với khả ức chế tan huyết, cao tổng cao HE cho kết ức chế cao không sai khác biệt mặt thống kê, 55,922 a ± 0,329 % 53,860a ± 0,917 % Kết khảo sát khả ổn định màng tế bào cho thấy, nồng độ 200 μg/mL, phần trăm ức chế tan huyết cao chiết tổng đạt 55,922 a ± 0,329 %, cao so với phân lớp PE (48,556b ± 1,446), không khác biệt với phân đoạn HE (53,860a ± 0,917 %) Thông qua kết tiêu trên, phân lớp HE cao chiết tổng lựa chọn để khảo sát khả ức chế hoạt động enzyme lipoxygenase Tại nồng độ 200 μg/mL, cao chiết tổng cho kết ức chế hoạt động enzyme lipoxygenase đạt 60,661a ± 0,537 %, cao so với phân đoạn HE (59,265b ± 0,646 %) Tuy nhiên, giá trị IC50 cho thấy, phân lớp HE có hoạt tính ức chế tối ưu với giá trị IC50 thu thấp (106,53 ± 9,224 μg/mL) Qua đó, tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu điều trị viêm đối phân đoạn cao chiết HE cao tổng Quýt gai (A buxifolia) 5.2 Kiến nghị Với mục đích nghiên cứu sâu giá trị dược liệu Quýt gai (A buxifolia) Việt Nam, thực thêm thí nghiệm phân tích sau:  Xác định thành phần cấu trúc hợp chất phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt gai  Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vivo cao chiết vỏ thân Quýt gai chuột  Khảo sát hoạt tính kháng nấm, ung thư cao terpenoids từ cao vỏ thân Quýt gai 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam Y học, 2007 Nguyễn Kim Phi , Phương pháp cô lập hợp chất hữu 2007: NXB Đại học Quốc gia TP.HCM Tiếng Anh T Wu, C C., Acricone alkaloids from the root bark of Severinia buxifolia in Hainan Chemical and pharmaceutical bulletin 48(1), 2000 Y Yang, W Y., W Zuo, Y Zeng, S Liu, W Mei, H Dai, Two new acridone alkaloids from the branch of Atalantia buxifolia and their biological activity Journal of Asian natural products research 15(8), 2013 Wu T.S., L Y L., Chan Y.Y., Wu P.L., Kouh C.S., Wu S.J., Wang Y, Tetranortriterpenoid insect antifeedants from Severinia buxifolia Phytochemistry, 1997 Chen, C L., FW & Kuo, Pei-Chung & Shi, LS & Wang, JJ & Wu, TS, A new sesquiterpene, alpha-santalane-11,12,13-triol from the root bark of Severinia buxifolia in Hainan Chinese Chemical Society Taipei, 2001 Guo-Ming, G., Studies on the chemical constituents of Dongfeng-u Atalantia buxifolia [J] Acta Pharmaceutica Sinica 12, 1987 Mokhtar, S., A pharmacognostical study of Atalantia buxifolia (Family Rutaceae) cultivated in Egypt CU Theses, 2017 Bacher, M., et al., Complete 1H and 13C NMR data assignment of new constituents from Severinia buxifolia Magn Reson Chem, 2010 48(1): p 8388 10.Wang, G., Tang, W & Bidigare, R.R In Ed: Zhang L., & Demain, A.L., Natural Products Drug Discovery and Therapeutic Medicine Terpenoids As Therapeutic Drugs As Pharmaceutical Agents Humana Press, 2005 11 T Wu, C C., F Lin, Constituents of the Root Bark of Severinia buxifolia Collected in Hainan Journal of natural products 64(8), 2001 12 Yang, T., et al., A new tetranortriterpenoid from the roots of Atalantia buxifolia J Asian Nat Prod Res, 2012 14(6): p 581-5 13 Guo, Z.-K., et al., A new apotirucallane-type triterpenoid from Atalantia buxifolia Journal of Asian Natural Products Research, 2015 17(10): p 10181023 14 Y Yin, F H., Y Huang, Z Shen, Study of the effect of Atalantia buxifolia on relieving cough and phlegm Journal of Guangdong Pharmaceutical University 6, 2013 15 Ragasa, C., et al., A New Triterpene from Atalantia retusa Merr Vol 67b 2012 426-432 39 16 Raga Dennis D., C J C., Ganacias Richard Lester S., and Mandia Emelina H, Anti-nociceptive and anti-inflammatory activities of Atalantia retusa Merr Pharmacognosy Journal, 2(7), 2010: p 173-177 17 G H Morrison, a H F., Solvent Extraction in Analytical Chemistry Wiley, New York, 1975 18 NN, A., A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants, Principle, Strength and Limitation Med Aromat Plants, 2015 19 Abdelouaheb Djilani, B L., Rachid Soulimani, Amadou Dickob and ChaffiqueYounos, New Extraction Technique for Alkaloids J Braz Chem Soc., 2006 17(3): p 518-520 20 Dima Muhammad, J H., Nathalie Lalun, Jean-Hugues Renault, Hélène Bobichon, Mohammed Nour and Laurence Voutquenne-Nazabadioko, Isolation of Flavonoids and Triterpenoids from the Fruits of Alphitonia Neocaledonica and Evaluation of their Anti-oxidant, Antityrosinase and Cytotoxic Activities Phytochemical Analysis 2014 21 T Llano, M A., A Koutinas, Chr Gardeli, H Papapostolou, A Coz1, N Quijorna, A Andres, M Komaitis, Liquid–Liquid Extraction of Phenolic Compounds from Spent Sulphite Liquor Springer Science+Business Media Dordrecht 2015, 2015 22 Stedman, Stedman's Medical Dictionary Reference Reviews 21(1), 2007 28th ed 23 Kaspers DL, H S., Jameson JL, Fauci AS, Longo DL, Loscalzo J, Harrison’s Principles of internal medicine New York: McGraw-Hill Companies, 2015 19th ed 24 Nordqvist, C., Everything you need to know about inflammation Medical News Today MediLexicon, Intl., 2017 25 Slater, D., et al., Pharmacology of nonsteroidal antiinflammatory drugs and opioids Seminars in interventional radiology, 2010 27(4): p 400-411 26 Swartz, S L and R G Dluhy, Corticosteroids: clinical pharmacology and therapeutic use Drugs, 1978 16(3): p 238-55 27 Sangita Chandra, P C., Protapaditya Dey, Sanjib Bhattacharya, Evaluation of in vitro anti-inflammatory activity of coffee against the denaturation of protein Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2012: p 178-180 28 G Leelaprakash, S M D., Invitro Anti-Inflammatory Activity Of Methanol Extract Of Enicostemma axillare International Journal of Drug Development & Research, 2011 3(3) 29 Dhami, N., Trends in Pharmacognosy: A modern science of natural medicines Journal of Herbal Medicine, 2013 3(4): p 123-131 30 Hostanska, K., et al., Alteration of anti-inflammatory activity of Harpagophytum procumbens (devil's claw) extract after external metabolic activation with S9 mix J Pharm Pharmacol, 2014 66(11): p 1606-14 40 31 Abdelouahab, N a C H., “Effect of the major glycosides of Harpagophytum procumbens (Devil’s Claw) on epidermal cyclooxygenase-2 (COX-2) in vitro.” Journal of natural products 71(5), 2008: p 746-749 32 Aberham, A., S Schwaiger, H Stuppner and M Ganzera, “Quantitative analysis of iridoids, secoiridoids, xanthones and xanthone glycosides in Gentiana lutea L roots by RP-HPLC and LC–MS.” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 45(3), 2007: p 437-442 33 C Cavallito, J B., Allicin, the antibacterial principle of Allium sativum I Isolation, physical properties and antibacterial action Journal of the American Chemical Society 66(11), 1944: p 1950-1951 34 Shukla Y, K N., Cancer chemoprevention with garlic and its constituents Cancer Lett, 2007: p 247:167–181 35 Keiss HP, D V., Hartung T, Haffner T, Trueman L, Auger J, Kahane R, Vollmar AM, Garlic (Allium sativum L modulates cytokine expression in lipopolysaccharide-activated human blood thereby inhibiting NF-kappaB activity J Nutr 133 (7), 2003: p 2171–2175 36 Ankri, S and D Mirelman, Antimicrobial properties of allicin from garlic Microbes Infect, 1999 1(2): p 125-9 37 Zaveri, N., Green tea and its polyphenolic catechins: medicinal uses in cancer and noncancer applications Life sciences 78(18), 2006: p 2073-2080 38 Schoonbroodt, S., Piette, J., Oxidative stress interference with the nuclear factor-kappa B activation pathways Biochemical Pharmacology 60 (8), 2000: p 1075–1083 39 P Ravindran, K N.-B., M Shylaja, Cinnamon and cassia: the genus Cinnamomum CRC press, 2003 40 Parker, X H a T L., Antiinflammatory Activity of Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) Bark Essential Oil in a Human Skin Disease Model Phytother Res., 2017: p 5822 41 Abulude, F., Phytochemical screnning and mineral contents of leaves of some Nigerian woody plants Research Journal of Phytochemistry, 2010 4(3) 42 Nisha S Gambhava, S B E., Ishwarsinh S Rathod, Mahesh T Chhabria and Arpit H Patwari, Estimation of ursolic acid and oleanolic acid from leaves of Plumeria obtusa by HPTLC method after iodine derivatization Der Pharma Chemica, 2013 5(3): p 44-50 43 Sherma, J., Thin-layer and paper chromatography Analytical chemistry 60(12), 1988 44 Narayan Ghorai, S C., Shamik Gucchait, Samir Kumar Saha & Suman Biswas, Estimation of total Terpenoids concentration in plant tissues using a monoterpene, Linalool as standard reagent Protocol Exchange, 2012 45 Gladis Raja Malar C, C C., Phytochemical Screening, Total Flavonoid, Total Terpenoid and AntiInflammatory Activity of Aqueous Stem Extract of Salacia oblonga Journal of Chemical and Pharmaceutical Sciences, 2017 10(1) 41 46 Govindappa M., N S S., Poojashri M N., Sadananda T S and Chandrappa C P., Antimicrobial, antioxidant and in vitro anti-inflammatory activity of ethanol extract and active phytochemical screening of Wedelia trilobata (L.) Hitchc Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, 2011 3(3): p 43-51 47 AJ, O O a F., Anti‐protease and membrane stabilizing activities of extracts of Fagra zanthoxiloides, Olax subscorpioides and Tetrapleura tetraptera Int J of Pharmacong 1995, 1995 33: p 65-69 48 Anne E Harman-Ware, R S., Gary F Peter and Mark Davis, Determination of Terpenoid content in Pine by Organic solvent extraction and Fast-GC analysis Frontiers in Energy Research, 2016 49 Iloki-Assanga, S B., et al., Solvent effects on phytochemical constituent profiles and antioxidant activities, using four different extraction formulations for analysis of Bucida buceras L and Phoradendron californicum BMC Res Notes, 2015 8: p 396 50 GA Ayoola, H C., SA Adesegun, AA Adepoju-Bello,K Obaweya, EC Ezennia, TO Atangbayila, Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Some Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern Nigeria Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2008 7(3): p 1019-1024 51 M Bowman, S B., A Churchill, D Hellie, J Starrett, Y Causby, J Ellis, D Ensley, J Maness, D Meyer, Extraction method for the isolation of terpenes from plant tissue and subsequent determination by gas chromatography Microchemical journal 56(1), 1997: p 10-18 52 Cracolice, M., Basics of Introductory Chemistry with Math Review 2009: Cengage Learning 53 Wieslaw Oleszek, I K a A S., TLC of Triterpenes (Including Saponins), in Thin Layer Chromatography in Phytochemistry 2007, CRC Press 54 Walker HK, H W., Hurst JW, Serum Albumin and Globulin, in Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations 1990, Butterworths: Boston 55 Yerramsetty Nagaharika, V k., Shaik Rasheed, Ramadosskarthikeyan, Antiinflammatory activity of leaves of Jatropha gossypifolia L by hrbc membrane stabilization method Journal of Acute Disease, 2013: p 156-158 56 Arun Shirwaikar, S D., E N Siju, Anti-Inflammatory activity of Thespesia populnea fruits by Membrane Stabilization International Journal of PharmTech Research, 2011 3(4): p 2060-2063 57 Dekker, R W a F J., Inflammation, Cancer and Oxidative Lipoxygenase Activity are Intimately Linked Cancers, 2014 6: p 1500-1521 58 Funk, C D., Lipoxygenase Pathways as Mediators of Early Inflammatory Events in Atherosclerosis Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2006 26: p 1204-1206 42 PHỤ LỤC ĐC1; ĐC2; ĐC3;ĐC4; ĐC5; ĐC6; ĐC7 mẫu dịch chiết vỏ thân Quýt gai thu chiết với dung môi Hexane, EtOAc, Me2CO, EtOH, Hexane:EtOAc, Hexane:Me2CO, Hexane:EtOH 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 mẫu dịch chiết Hexane, EtOAc, Me2CO, EtOH, Hexane:EtOAc, Hexane:Me2CO, Hexane:EtOH sau thêm CHCl3 H2SO4 Phụ lục 1: Ảnh hưởng dung môi tách chiết đến diện terpenoids vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) ĐC1 ĐC2 ĐC3 ĐC4 ĐC5 ĐC6 ĐC7 Phụ lục 2: Ảnh hưởng dung môi tách chiết đến diện terpenoids phân đoạn PE vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) ĐC1 ĐC4 ĐC5 ĐC6 ĐC7 phân ĐC3 ĐC7 ĐC2; ĐC2 ĐC3;ĐC4; ĐC1; ĐC5; ĐC6; lần 4lượt dịch mẫu đoạn pE vỏ thân Quýt gai thu chiết với dung môi Hexane, EtOAc, Me2CO, EtOH, Hexane:EtOAc, Hexane:Me2CO, Hexane:EtOH 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 mẫu dịch chiết Hexane, EtOAc, Me2CO, EtOH, Hexane:EtOAc, Hexane:Me2CO, Hexane:EtOH sau thêm CHCl3 H2SO4 Phụ lục 3: Ảnh hưởng dung môi tách chiết đến diện terpenoids phân đoạn TE vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) ĐC1 ĐC2 ĐC3 ĐC4 ĐC5 ĐC6 ĐC7 43 ĐC1; ĐC2; ĐC3;ĐC4; ĐC5; ĐC6; ĐC7 dịch mẫu phân đoạn TE vỏ thân Quýt gai thu chiết với dung môi Hexane, EtOAc, Me2CO, EtOH, Hexane:EtOAc, Hexane:Me2CO, Hexane:EtOH 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 mẫu dịch chiết Hexane, EtOAc, Me2CO, EtOH, Hexane:EtOAc, Hexane:Me2CO, Hexane:EtOH sau thêm CHCl3 H2SO4 Phụ lục 4: Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết đến diện terpenoids vỏ ĐC1 ĐC2 thân Quýt gai (A buxifolia) ĐC3 ĐC4 ĐC5 ĐC1; ĐC2; ĐC3;ĐC4; ĐC5 mẫu dịch chiết vỏ thân Quýt gai thu chiết với dung môi Hexane:Me2CO nhiệt độ 6oC, 26OC, 46OC, 66OC, 86OC 1, 2, 3, 4, mẫu dịch chiết Hexane:Me2CO nhiệt độ 6oC, 26OC, 46OC, 66OC, 86OC sau thêm CHCl3 H2SO4 Phụ lục 5: Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết đến diện terpenoids phân ĐC1 ĐC2 ĐC3 ĐC4 đoạn PE vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) ĐC5 44 ĐC1; ĐC2; ĐC3;ĐC4; ĐC5 mẫu dịch chiết vỏ thân Quýt gai thu chiết với dung môi Hexane:Me2CO nhiệt độ 6oC, 26OC, 46OC, 66OC, 86OC 1, 2, 3, 4, mẫu dịch chiết Hexane:Me2CO nhiệt độ 6oC, 26OC, 46OC, 66OC, 86OC sau thêm CHCl3 H2SO4 Phụ lục 6: Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết đến diện terpenoids phân ĐC1 đoạn TE vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) ĐC2 ĐC3 ĐC5 ĐC2; thân Quýt gai thu ĐC5ĐC4 ĐC1; ĐC3;ĐC4; là4mẫu dịch chiết vỏ chiết với dung môi Hexane:Me2CO nhiệt độ 6oC, 26OC, 46OC, 66OC, 86OC 1, 2, 3, 4, mẫu dịch chiết Hexane:Me2CO nhiệt độ 6oC, 26OC, 46OC, 66OC, 86OC sau thêm CHCl3 H2SO4 Phụ lục 7: Ảnh hưởng thời gian tách chiết đến diện terpenoids vỏ ĐC1 ĐC2 ĐC3 Quýt gai 4(A buxifolia) ĐC5 thân ĐC4 45 ĐC1; ĐC2; ĐC3;ĐC4; ĐC5 mẫu dịch chiết vỏ thân Quýt gai thu chiết với dung môi Hexane:Me2CO nhiệt độ 66OC 0h, 12h, 24h, 36h, 48h 1, 2, 3, 4, mẫu dịch chiết Hexane:Me2CO nhiệt độ 66OC 0h, 12h, 24h, 36h, 48h sau thêm CHCl3 H2SO4 Phụ lục 8: Ảnh hưởng thời gian tách chiết đến diện terpenoids phân ĐC1 ĐC2 ĐC3 ĐC4 gaiĐC5 PE vỏ đoạn thân Quýt (A buxifolia) ĐC1; ĐC2; ĐC3;ĐC4; ĐC5 mẫu dịch chiết vỏ thân Quýt gai thu chiết với dung môi Hexane:Me2CO nhiệt độ 66OC 0h, 12h, 24h, 36h, 48h 1, 2, 3, 4, mẫu dịch chiết Hexane:Me2CO nhiệt độ 66OC 0h, 12h, 24h, 36h, 48h sau thêm CHCl3 H2SO4 ĐC1 Phụ lục 9: Ảnh hưởng thời gian tách chiết đến diện terpenoids phân ĐC2 ĐC3 ĐC4 ĐC5 đoạn TE vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 46 ĐC1; ĐC2; ĐC3;ĐC4; ĐC5 mẫu dịch chiết vỏ thân Quýt gai thu chiết với dung môi Hexane:Me2CO nhiệt độ 66OC 0h, 12h, 24h, 36h, 48h 1, 2, 3, 4, mẫu dịch chiết Hexane:Me2CO nhiệt độ 66OC 0h, 12h, 24h, 36h, 48h sau thêm CHCl3 H2SO4 ... 36 48 giờ) 2 So sánh hàm lượng terpenoids phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt gai điều kiện tách chiết khác So sánh hoạt tính kháng viêm in vitro phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt gai 3 CHƯƠNG... So sánh hàm lượng terpenoids hoạt tính kháng viêm in vitro cao chiết vỏ thân quýt gai (Atalantia buxifolia) với mục đích làm sáng tỏ thành phần hóa học, đặc biệt nhóm terpenoids khảo sát hoạt. .. hàm lượng terpenoids phân lớp dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 21 4.3 Sắc ký lớp mỏng (TLC) HPLC .25 4.4 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia)