SO SÁNH hàm LƯỢNG TERPENOIDS và HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM in vitro của các CAO CHIẾT vỏ THÂN QUÝT GAI (atalantia buxifolia)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPSO SÁNH HÀM LƯỢNG TERPENOIDS VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM in vitro CỦA CÁC CAO CHIẾT VỎ THÂN QUÝT GAI Atalantia buxifolia Người hướng dẫn: TS... buxifolia chính là một tro

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SO SÁNH HÀM LƯỢNG TERPENOIDS

VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM in vitro

CỦA CÁC CAO CHIẾT VỎ THÂN

QUÝT GAI (Atalantia buxifolia)

Người hướng dẫn: TS TRƯƠNG THỊ DIỆU HIỀN

Người thực hiện: TẠ NHẬT THÚY ANH

Lớp : 14060302

Niên khóa: 2014 – 2019

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

LỜI CAM ĐOAN

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sựhướng dẫn khoa học của TS Trương Thị Diệu Hiền Các nội dung nghiên cứu, kếtquả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trướcđây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánhgiá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệutham khảo

Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như sốliệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồngốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm vềnội dung luận văn của mình Trường Đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đếnnhững vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện đề tài(nếu có)

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Tác giả (ký tên và ghi rõ họ tên)

cô quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình

Song, sự dìu dắt, chỉ bảo của người Thầy chính là chìa khóa quan trọng giúp

em định hướng và hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất Với lòng kính trọng vàbiết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô Trương Thị Diệu Hiền đã luôn tậntình chỉ dạy, truyền đạt cho em không chỉ những kiến thức bổ ích mà còn là nhữngkinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện giúp em học hỏi, khắc phục và hoàn thiện đề tàikhóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Quí thầy cô tại trường Đại học Tôn ĐứcThắng đã truyền đạt cho em những vốn kiến thức quý giá trong suốt thời gian họctập và rèn luyện tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đặc biệt là các bạn tại phòngnghiên cứu chuyên đề đã luôn hỗ trợ, động viên và quan tâm em trong thời gianqua

Do thời gian thực hiện khóa luận và vốn kiến thức còn hạn chế, vì thế, nhữngthiếu sót trong bài là không thể tránh khỏi Em kính mong nhận được những nhậnxét, góp ý của quý thầy cô để bài khóa luận được hoàn thiện hơn

Một lần nữa em xin trân trọng cảm ơn!

TÓM TẮT

Từ xưa đến nay, các loài cây thuộc họ Citrus đã trở thành một phần quen

thuộc trong những bài thuốc Đông y, được lưu truyền rộng rãi trong dân gian Trong

đó, cây Quýt gai (A buxifolia) chính là một trong những loài tiêu biểu được ứng

dụng điều trị các bệnh viêm, hen, suyễn Nhằm góp phần tăng cao dữ liệu khoa học

và giá trị dược liệu của cây Quýt gai, đề tài đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng củadung môi, nhiệt độ tách chiết, thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng terpenoids trong

các phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai cũng như khả năng kháng viêm in vitro của

các cao chiết này

Đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết (hexane, ethyl acetate

hexane:acetone (1:1), hexane:ethanol (1:1), nhiệt độ ngâm mẫu (6, 26, 46, 66 và 86

phân lớp cao chiết PE, HE và cao tổng Kết quả cho thấy, terpenoids được phát hiệntrong tất cả các phân đoạn dịch chiết của vỏ thân Quýt gai ở những điều kiện táchchiết khác nhau bằng phương pháp chỉ thị màu đặc trưng Hàm lượng terpenoidstrong phân lớp PE và HE thấp nhất khi chiết lỏng lỏng với dịch chiết hexane, lần

chiết 66 oC, hàm lượng terpenoids thu được cao nhất ở cả hai phân lớp cao chiết, lần

phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) được xác định bằng kỹ thuật sắc

ký lớp mỏng (TLC) và HPLC với ursolic acid (Sigma, Singapore) làm chất chuẩn.Kết quả cho thấy, giá trị Rf của các spot ở các cao chiết tương ứng với Rf của chấtchuẩn ursolic acid (Rf = 0,31)

Với thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro, thông qua các chỉ

tiêu: khả năng ức chế biên tính albumin, ức chế phân giải protein, ổn định màng tếbào, kháng enzyme lipoxxygenase Kết quả cho thấy phân lớp cao chiết HE và caotổng có khả năng kháng viêm tốt Cụ thể, khả năng ức chế biến tính albumin ở nồng

độ 200 μg/mL cho thấy, cao tổng và cao HE cho kết quả ức chế biến tính albumin

khảo sát khả năng ổn định màng tế bào cũng cho thấy, ở nồng độ 200 μg/mL, phần

0,917 %) Cao chiết tổng cho kết quả ức chế hoạt động enzyme lipoxygenase đạt

giá trị IC50 cho thấy, phân lớp HE có hoạt tính ức chế tối ưu với giá trị IC50 thu đượcthấp nhất (106,53 ± 9,224 μg/mL)

Tóm lại, đề tài đã chỉ ra được điều kiện tách chiết tối ưu để thu nhận

trong 24 giờ ngâm mẫu Cùng với khả năng kháng viêm in vitro của các phân đoạn

cao chiết, sẽ góp phần tăng thêm luận cứ khoa học cho các nghiên cứu về sau trên

cây Quýt gai (A buxifolia)

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây Quýt gai (Atalantia buxifolia) 3

2.2 Phương pháp chiết lỏng - lỏng để thu nhận hợp chất tự nhiên 6

2.3 Triệu chứng viêm và phương pháp điều trị 8

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 12

3.2 Đối tượng nghiên cứu 12

3.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 12

3.4 Phương pháp tiến hành 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 19

4.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến sự hiện diện của nhóm terpenoids trong dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 19

4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hàm lượng terpenoids

trong các phân lớp dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 21

4.3 Sắc ký lớp mỏng (TLC) và HPLC 25

4.4 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết vỏ thân cây Quýt gai (A buxifolia) 28

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

NSAIDs : Thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal

anti-inflammatory drugs)

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang Hình 2.1: Cây quýt gai 3

Hình 3.1: Quy trình thu nhận cao chiết tổng vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 13 Hình 3.2: Quy trình thu nhận cao terpenoids vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 14 Hình 4.1: Sắc ký lớp mỏng của các phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt gai (A.

buxifolia) soi ở bước sóng 254 nm (a) và hiện màu bằng chất phun (b) 26

Hình 4.2: Phương trình đường chuẩn ursolic acid 27 Hình 4.3: Khả năng ức chế sự biến tính albumin của các phân lớp cao chiết vỏ thân

Quýt gai (A buxifolia) 29

Hình 4.4: Khả năng ức chế sự phân giải protein của các phân lớp cao chiết vỏ thân

Quýt gai (A buxifolia) 31

Hình 4.5: Khả năng ổn định màng tế bào của các phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt

gai (A buxifolia) 33

Hình 4.6: Khả năng kháng enzyme lipxygenase của các phân lớp cao chiết vỏ thân

Quýt gai (A buxifolia) 35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1: Quy trình xác định hàm lượng terpenoids tổng trong cao chiết vỏ thân

Quýt gai (A buxifolia) 16

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của dung môi đến sự hiện diện terpenoids trong các cao chiết

vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 19

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hiện diện terpenoids trong các cao chiết

vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 20

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến sự hiện diện terpenoids trong các cao

chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia) 21

Bảng 4.4: Hàm lượng terpenoids trong các phân lớp cao chiết thu được từ dịch

chiết tổng của các loại dung môi khác nhau 22

Bảng 4.5: Hàm lượng terpenoids trong các phân lớp cao chiết thu được từ dịch

chiết tổng ở nhiệt độ khác nhau 23

Bảng 4.6: Hàm lượng terpenoids trong các phân lớp cao chiết thu được từ dịch

chiết tổng ở thời gian ngâm khác nhau 24

Bảng 4.7: Khả năng ức chế sự biến tính albumin của các phân lớp cao chiết vỏ thân

Quýt gai (A buxifolia) 28

Bảng 4.8: Khả năng ức chế sự phân giải protein của các phân lớp cao chiết vỏ thân

Quýt gai (A buxifolia) 30

Bảng 4.9: Khả năng ổn định màng tế bào của các phân lớp cao chiết vỏ thân Quýt

gai (A buxifolia) 32

Bảng 4.10: Khả năng kháng enzyme lipxygenase của các phân lớp cao chiết vỏ thân

Quýt gai (A buxifolia) 34

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Dược liệu thiên nhiên từ lâu đã trở thành một phần không thể thiếu trong nền

Y học cổ truyền Việt Nam Đặc biệt, với sự phong phú và đa dạng của các giốngdược liệu quý ở khắp các miền đất nước, nền Y học cổ truyền ngày nay đã phát triểnvượt bậc và được sử dụng như một liệu pháp điều trị thay thế các thuốc Tây y.Trong đó, các loài cây thuộc họ cam thảo luôn đóng vai trò tiên phong trong hỗ trợđiều trị các bệnh như: cảm cúm, nhức đầu, tiêu khát, chướng bụng, táo bón…[1].Ngoài những loài nổi bật như cam, chanh, bưởi…thì phải kể đến cây Quýt gai (hay

còn gọi là Cây gai xanh, Atalantia buxifolia) được ứng dụng trong điều trị hen

suyễn, giảm ho, tiêu đờm, viêm khớp…Tuy nhiên, tác dụng chữa bệnh của loài câynày chưa được hiểu rõ và chỉ được lưu truyền trong dân gian Hiện nay, trên thếgiới, đã có một vài nghiên cứu phát hiện các nhóm hợp chất tồn tại trong cây Quýtgai như phenolics, alkaloids, terpenoids…[3, 4] cũng như chứng minh được khảnăng kháng khuẩn, côn trùng…của loài này [5-7] Qua đó, nhận thấy được cây Quýt

gai (A buxifolia) là một dược liệu quý với thành phần hóa học đa dạng và hoạt tính

sinh học phong phú, nhưng vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi ở Việt Nam Từ đó,việc nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất tự nhiên và tác dụng dược lý ở cây Quýtgai là rất quan trọng và cấp thiết với nền y học Việt Nam cũng như thế giới

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “So sánh hàm lượng terpenoids và

hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết vỏ thân quýt gai (Atalantia

buxifolia)” với mục đích làm sáng tỏ thành phần hóa học, đặc biệt là nhóm

terpenoids và khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro, góp phần cung cấp dữ liệu

khoa học và tăng cao giá trị sử dụng của loài cây này

Khóa luận được thực hiện với các mục đích chính:

1 Khảo sát sự hiện diện của nhóm terpenoids đối với các dung môi chiết

(hexane, ethyl acetate (EtOAc), acetone (Me2CO), ethanol (EtOH),hexane:ethyl acetate (1:1), hexane:acetone (1:1), hexane:ethanol (1:1), nhiệt

48 giờ)

2 So sánh hàm lượng terpenoids trong các phân đoạn cao chiết vỏ thân Quýt

gai ở những điều kiện tách chiết khác nhau

3 So sánh hoạt tính kháng viêm in vitro của các phân đoạn cao chiết vỏ thân

Quýt gai

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây Quýt gai (Atalantia buxifolia)

2.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái [1]

Cây.Quýt gai (Atalantia buxifolia) là loài.cây nhỏ, cao chừng 1 m, thân mang

nguyên, dai, hình.bầu.dục đầu.tròn, thuôn tròn ở phía cuống Lá có nhiều điểm tinh

2 hạt

thường gặp ở những bờ rào, lẫn với cây tre hay cây bụi khác

2.1.2 Thành phần hóa thực vật

sinh.học nổi bật và quan trọng [8-10]

2.1.2.1 Terpenoids

chất thứ.cấp với hơn 30,000 hợp chất đã được tìm thấy bao.gồm cả steroids.Terpenoids được tạo thành bởi một.chuỗi các đơn.vị isoprene (C5) thu nhận từisopentenyl (3-methyl-3-en-1-yl) pyrophosphate Tùy theo số.lượng các đơn vịisoprene mà terpenoids được chia thành các.nhóm sau: monoterpenes (C10),

Hình 0.1: Cây quýt gai

(Nguồn:www.onlineplantguide.com)

sesquiterpenes (C15), diterpenes (C20), sesterpenes (C25), triterpenes (C30),tetraterpenes (C40) và polyterpenes [10] Hai nhóm hợp.chất triterpenes vàsesquiterpenes hầu.hết được tìm.thấy nhiều trong.vỏ rễ và thân cây Quýt gai (A.

buxifolia) Năm 1986, mười một.hợp chất hóa học được phân.tách từ lá Quýt gai:

được Wu và cs [11] phát hiện vào năm 2001 là isovaleroylcycloseverinolide và

nhân (Nuclear Magnetic Resonance – NMR) Năm 2012, Yang và cs [12] đã

xác.định được một tetranortriterpenoid mới là 6-deacetyl-severinolide, cùng.với sáutetranortriterpenoid đã.biết khác là severinolide, acetyl-isoepiatalantin…từ dịch

NMR Đến năm 2015, Guo và cs [13] đã phân.tách được một triterpene mới

trúc hoàn.thiện của triterpene.này được xác.định bằng phương pháp quang.phổ 1D,

cũng.đã.được phân tách từ.vỏ.rễ Quýt.gai (A buxifolia) như: santalene,

α-santalen-11-one, dihydro-α-santalen-12-one, 12,13- epoxy-α-santalene… [5, 6]

2.1.2.2 Phenolics

chưa được nghiên cứu rộng rãi Năm 2010, Bacher và cs [9] đã phát hiện

các.coumarin (seselin, isomeranzin, suberosin epoxide, bergaptene, imperatorine,suberosine, bergamottin) trong dịch.chiết ethanol từ lá Quýt gai Đồng thời,

xác.định vào năm 2010

2.1.2.3 Alkaloids

Nhiều nghiên cứu đã chỉ.ra rằng alkaloids hiện.diện nhiều trong rễ và vỏ thâncây.Quýt gai (A buxifolia) Guo-Ming [7] đã phân.tách thành.công hai acridone

alkaloids mới là atalafoline và atalafoline-B từ rễ của A buxifolia Cấu trúc của

2,3-dimethoxy-1,4,5-trihydroxy-10-methylacridone

2.1.3 Ứng dụng của cây Quýt gai trong y học cổ truyền

Dược tính của cây.Quýt gai (A buxifolia) được lưu.truyền trong dân.gian và

nghiên cứu về.tác dụng dược học của loại.cây này như: khả.năng trị ho, diệt.côn

Trị ho

các dịch chiết khác.nhau từ cây Quýt gai (A buxifolia) Kết quả cho.thấy, dịch chiết

so.với các dịch.chiết ethyl acetate, nước và petroleum ether [14]

Kháng khuẩn

Yang và cs [4] đã nghiên.cứu hoạt.tính kháng khuẩn của.hai acridonealkaloid (3-methoxy-1,4,5-trihydroxy-10-methylacridone và 2,3-dimethoxy-1,4,5trihydroxy-10-methylacridone) từ dịch.chiết cành Quýt gai (A buxifolia) trên

Staphylococcus aureus Bên cạnh đó, vào năm 2012, Ragasa và cs [15] đã đánh.giá

aureus và B subtilis Các triterpene có hoạt.tính kháng khuẩn.tốt nhất trên B.

subtilis với đường.kính vòng.kháng là 55 mm Mặt khác, hiệu.quả kháng của

14 mm

Diệt côn trùng

Wu và cs (1997) [5] đã.nghiên cứu hiệu.quả diệt côn.trùng của hai hợp.chất

tetranorterpenoid (severinolide và cycloepiatalantin) từ dịch chiết rễ A buxifolia trên Plutella xylostella Trong đó, kết.quả nghiên cứu cho.thấy severinolide có khả

năng ức chế sự phát triển của P xylostella tốt hơn so với cycloepiatalantin, với

giá.trị ED50 tại nồng độ 0,0625 %

Kháng viêm

của λ-carrageenan trên.chuột Sau 1 giờ, mức độ.sưng tấy của chân.chuột đã

BW Từ đó, kết quả chứng.minh rằng, các hợp.chất trong.cây thuộc chi Atalantia có

khả năng kháng.viêm rất tốt

2.2 Phương pháp chiết lỏng - lỏng để thu nhận hợp chất tự nhiên

pháp chiết lỏng – lỏng được sử.dụng rộng.rãi bởi tính đơn.giản, thời gian ngắn và

tan vào hai.pha lỏng và hai pha lỏng này không.hòa tan vào nhau Hằng số phân.bố

thời.điểm cân bằng, được.biểu diễn bằng hằng.số phân bố K

Ca: Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng

Cb: Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng

loại bỏ sơ.bộ các tạp bẩn hoặc các nhóm.chất có hằng số phân bố.nhỏ hơn nhómchất mục tiêu

2.2.2 Ảnh hưởng của phương pháp chiết lỏng – lỏng đến hiệu suất tách chiết hợp chất tự nhiên

Hằng số phân bố của.các chất tan ít bị ảnh hưởng bởi.nhiệt độ hoặc nồng.độ

trọng, đặc.biệt là pH axít yếu và pH bazơ yếu [2]

chiết khác nhau sẽ cho hiệu.suất thu hồi, các nhóm.chất có độ phân.cực khác nhau[18]

Vào năm 2006, Abdelouaheb.và cs [19] đã ứng dụng phương.pháp chiết

stramonium và Ruta graveolens Hàm lượng alkaloids thu.được cao nhất (0,8g/100g

dịch mẫu này bằng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và thu nhận hai phân lớp dịch chiết làethyl acetate và n-butanol Phân lớp ethyl acetate chứa chủ yếu triterpene vàflavonoids Mặt khác, phân lớp n-butanol chủ yếu là các chất thuộc nhóm phenolics

Vì thế, phân lớp n-butanol có khả năng chống oxi hóa tốt hơn so với phân lớp còn

có độ phân cực khác nhau sẽ có khả năng hòa tan các nhóm chất khác nhau Liano

và cs [21] cũng đã tìm được điều kiện tách chiết phù hợp để ly trích phenolics từ

dịch thải trong sản xuất bột giấy bằng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng Hàm lượngphenolics khi chiết với diethyl ether đạt 3353 mg/L, cao nhất so với các dung môicòn lại như: hexane, benzen, chloroform Tỉ lệ (mẫu:dung môi) cho kết quả hàmlượng phenolics vượt trội nhất là tỉ lệ 1:3 Bên cạnh đó, các phân đoạn trên cũng đã

được khảo sát hoạt tính chống oxi hóa Kết quả cho thấy phân đoạn diethyl ether cókhả năng kháng oxi tốt nhất, chỉ số chống oxi hóa (antioxidant activity index-AAI)vượt ngưỡng 4,87; tạo điều kiện cho việc nghiên cứu ứng dụng của dịch thải nàyvào các sản phẩm trong đời sống

2.3 Triệu chứng viêm và phương pháp điều trị

2.3.1 Triệu chứng viêm

hoặc trung hòa các tác.nhân gây tổn thương [22]

Các giai đoạn chính diễn.ra trước và trong quá.trình gây viêm bên trong cơthể [23, 24]:

bào bị.tổn thương, nhằm cung.cấp một hàm lượng máu lớn.hơn chocác.mô bị tổn thương Do đó, khu.vực viêm sẽ nóng và đỏ hơn

miễn dịch, dịch.lỏng và protein xuyên.qua các mao mạch đến tế.bào tổnthương nhiều hơn Từ.đó, khu vực viêm bị.sưng tấy do tích.tụ một lượnglớn các chất

- Bạch cầu trung.tính và các tế bào miễn.dịch khác không.chỉ tiêu diệt các

thương do.viêm sẽ truyền tín.hiệu đến các neuron thần.kinh của não, gâycho người bệnh cảm.giác đau nhức tại khu.vực viêm

2.3.2 Phương pháp điều trị

2.3.2.1 Tây y

viêm như aspirin, acetaminophen, celebrex, Chúng được chia thành hai nhómchính như sau [24]:

Non‐steroidal anti‐inflammatory drugs (NSAIDs):

các triệu.chứng viêm nhẹ hoặc trung bình Một số loại thuốc nổi.bật như:acetaminophen, aspirin, ibuprofen, naproxen, diclofenac… Chúng có khả năng

ức.chế enzyme cyclooxygenase (COX) - enzyme quan.trọng trong con đường

những.chất trung gian gây.nên sự viêm mô tế.bào và kích thích truyền tín.hiệu đến

góp phần chống.viêm, giảm đau và giảm.sốt mạnh Tuy nhiên, chúng cũngđồng.thời ức chế sự cân.bằng nội môi trong dạ.dày và gây tổn thương các cơ.quan

nghiêm trọng khác như: loét dạ.dày, suy hô hấp [25]

Corticosteroids:

các tác.nhân gây viêm mô tế bào Một số loại thuốc nổi bật như: prednisone,celestone, medrol…Corticosteroids giúp bổ sung hormone steroids trong cơ thể,

điều hòa hoạt.động của hệ miễn dịch, góp.phần ngăn cản sự phân.giải phospholipid,giảm tích.tụ arachidonic acid và các chất trung.gian khác (prostaglandins,

thuốc này trong thời.gian dài có thể gây béo phì, trầm cảm, cao.huyết áp, rối

phân giải các.chất bởi các enzyme (protease, lipoxydase…) và đặc.biệt là sự có.mặtcủa tế bào hồng cầu tại mô bị tổn thương [27, 28]

2.3.2.2 Y học cổ truyền

Dược liệu tự.nhiên là những loại thực vật thông dụng hằng.ngày nhưng lại cócác hoạt.tính sinh học như diệt vi.khuẩn, vi nấm, bên cạnh đó những loại dược liệu

nay, thay vì sử.dụng các chất hóa.học để điều trị bệnh thì các nhà khoa học trênthế.giới lại đang hướng đến nghiên.cứu sử dụng những thảo.dược từ thiên.nhiên

Cây vuốt quỷ (Harpagophytum):

Một số nghiên cứu khẳng định vai trò của chất chiết xuất từ cây vuốt quỷnhư glycosides, có tác dụng ức chế và giảm tiết một số cytokine gây viêm, rõ nhất

là TNFα; IL-6; IL-1β; PG-E2 [30] Đặc biệt là vai trò ức chế enzyme COX-2 củachiết xuất cây vuốt qủy đã được rất nhiều nghiên cứu chứng minh hiệu quả [31].Năm 2007, Aberham và cs [32] đã đánh giá trên lâm sàng và chứng minh hiệu quảgiảm đau và chống viêm đặc hiệu của vuốt quỷ với bệnh viêm khớp dạng thấp,viêm khớp do bệnh Gout và thoái hóa khớp

Tỏi (Allium sativum):

thuốc trị bệnh thần.kì từ thiên nhiên Chất allicin giúp tỏi có.mùi vị nồng đặc trưng

Năm 2007, Shukla.và cs [34] đã chứng.minh tỏi có tác dụng ức.chế sự phát triểncủa khối u và kích thích chu trình apoptosis, góp phần hỗ trợ điều trị ung thư Ngoài

ra, tỏi còn có khả năng ức.chế kích hoạt NFκB - nhân tố truyền tín hiệu quan.trọngnhằm khởi đầu quá trình viêm [35] Các nghiên cứu cho thấy tỏi có thể giúp hạhuyết.áp và giảm mức cholesterol Bên cạnh đó, tỏi có hoạt.tính chống lao,

diệt.khuẩn, nấm như: Pseudomonos aeruginosa, Candida albicans, Streptococcus spp, Salmonella spp; diệt virus viêm gan, cúm B [36].

Trà xanh (Camellia sinensis) [37]:

Các hợp chất polyphenol chủ.yếu trong trà xanh như: catechin,

đau, sốt nhanh chóng [38]

Quế (Cinnamomum) [39]:

cao trong điều trị các triệu chứng viêm trên da [40]

về hoạt.tính sinh học của các thành.phần hợp chất trong các loại dược.liệu đã được

và chỉ ra các hoạt.tính kháng viêm của các.loại dược liệu tự.nhiên trong phạm vi in

vitro và in vivo như: Sangita và cs [27] đã đánh giá khả năng ức chế biến.tính

năng ổn định protein albumin cao với.giá trị IC50 là 40 ppm so với IC50 của

tính kháng viêm của dịch chiết methanol từ cây Enicostemma axillare với các

hơn so với đối chứng dương sử dụng là diclofenac Raga và cs [16] đã dùng dịch

và khẳng.định được tiềm.năng kháng viêm của các hợp.chất trong cây này

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Đề tài khóa luận bắt đầu từ ngày 15 tháng 08 năm 2018 và kết thúc vào ngày

Trường đại học Tôn Đức Thắng

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là vỏ.thân cây quýt gai (A buxifolia) có nguồn.gốc tạihuyện Phú Lộc, Thừa Thiên Huế, Việt Nam Mẫu cây sau khi thu nhận được đónggói trong các túi chuyên dụng, giữ.lạnh bằng đá khô trong suốt.quá trình vận chuyển

3.3.2 Hóa chất

Hóa chất và các dung môi sử dụng:

3.4 Phương pháp tiến hành

3.4.1 Xử lý nguyên liệu

Phần thân cây Quýt gai (A buxifolia) được loại.bỏ gai nhọn, sau đó táchriêng lõi và thu nhận vỏ Phần vỏ sấy khô ở nhiệt độ 55 oC – 60 oC, nghiềnthành.bột, bảo quản ở 55 oC đến khi phân tích

3.4.2 Quy trình thu nhận cao chiết tổng vỏ thân Quýt gai

Thu dịch chiết tổng

Cao tổng

Cô cạn

Bột vỏ thân được chiết với các dung môi khác nhau: Hexane, ethyl acetate

hexane:acetone (1:1), hexane:ethanol (1:1) với tỷ lệ 1:20 (v/v) Mẫu được lần lượtngâm dầm trong các khoảng thời gian: 0, 12, 24, 36 và 48 giờ ở nhiệt độ khác nhau:

6 oC, 26 oC, 46 oC, 66 oC và 86 oC Sau đó, mẫu được đồng.nhất trong 5 giờ, lọc vàthu dịch chiết tổng Dịch chiết tổng được cô cạn ở 60oC và thu nhận cao tổng

3.4.3 Quy trình thu nhận cao terpenoids vỏ thân Quýt gai

Hòa tan cao chiết bằng ethanol 70%

Dịch mẫuChiết với Petroleum ether

Cô cạnCao HE

Hình 0.2: Quy trình thu nhận cao chiết tổng vỏ thân Quýt gai (A buxifolia)

Hình 0.3: Quy trình thu nhận cao terpenoids vỏ thân Quýt gai (A buxifolia)

Cao tổng được hòa tan bằng ethanol 70% Sau đó, dịch mẫu được chiết lỏng – lỏngvới petroleum ether với tỉ lệ (1:1, v/v) trong 1 giờ, thu phân lớp petroleum phía trên(PE), cô cạn thành cao PE Tiếp tục chiết dịch mẫu còn lại với hỗn hợp hexane:ethylacetate (85:15) với tỉ lệ (1:1, v/v) trong 1 giờ, thu phân lớp phía trên (HE) , cô cạn

Phânlớp dưới

thành cao HE Các cao chiết được bảo quản trong tủ lạnh 4 oC-6 oC cho các thínghiệm tiếp theo.

1.1.1 Xác định sự hiện diện và hàm lượng terpenoids trong dịch chiết vỏ thân Quýt gai (A buxifolia)

3.4.3.1 Phương pháp chỉ thị màu

giữa hai phân lớp cho thấy sự hiện diện của terpenoids

3.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

(đặc biệt là ursolic acid và oleanic acid) trong dịch chiết vỏ thân A buxifolia Pha

methanol (8,2:1,8:0,5) [42] Chất chuẩn được sử dụng là ursolic acid và oleanic acid(Sigma, Singapore), được pha trong MeOH nguyên chất để đạt nồng độ 100 g/mL

Sau khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một quãng xác định, lấy

spot trên bản mỏng Tính giá.trị Rf (Retention factor) của mẫu và chất chuẩn

hệ số tồn lưu (Retention factor – Rf) Với cùng một.hệ dung.môi giải ly thì hai.chấtgiống nhau sẽ có giá trị Rf bằng nhau [43]:

 Trong đó l là khoảng.cách từ tuyến xuất.phát tới tâm vệt sắc ký, l0 là khoảngcách từ tuyến xuất.phát tới tuyến dung môi Như vậy Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1 Khi

Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di chuyểnbằng tốc độ của dung môi

3.4.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng terpenoids tổng

Hàm lượng terpenoids tổng được xác định dựa theo phương pháp của Ghorai

và cs [44] Linalool (Sigma) được dùng làm chất chuẩn với nồng độ từ 1-10mg/mL.

Quy trình được thực hiện theo bảng 3.1, như sau:

Bảng 3.1: Quy trình xác định hàm lượng terpenoids tổng trong cao chiết vỏ

thân Quýt gai (A buxifolia)

Lắc đều và đo độ hấp phụ ở bước sóng 538nm

Từ đó, xây dựng đường chuẩn linalool với nồng độ từ 1 – 10 mg/mL với mẫutrắng là MeOH Hàm lượng terpenoids tổng được tính theo công thức:

W: khối lượng mẫu ngâm (g)

3.4.4 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết vỏ thân cây Quýt gai (A buxifolia)

Các chỉ tiêu đánh giá khả năng kháng viêm in vitro bao gồm: khả năng ức

chế biến.tính albumin, ức chế sự phân.giải protein, ức chế sự tan huyết do nhiệt vàkháng enzyme lipoxygenase [27, 28, 45]

Các cao chiết được hòa tan với DMSO thành dãy nồng độ: 25, 50, 100, 200μg/mL Đối chứng dương sử dụng là Aspirin (Sigma, Singapore) và Indomethacin

3.4.4.1 Ức chế sự biến tính albumin

Thí nghiệm được tiến hành theo nghiên cứu của Govindappa và cs [46] vào

năm 2011 Hỗn hợp phản ứng gồm 1 mL dịch mẫu và 1 mL albumin 1% (w/w).Điều chỉnh pH của hỗn hợp đạt giá trị 6,3-6,4 bằng HCl 0,1N Sau đó, ủ mẫu ở 37

hỗn hợp và đo giá trị quang phổ hấp phụ của phản ứng ở bước sóng 660 nm Đốichứng dương sử dụng là aspirin với nồng độ 100 μg/mL

Công thức xác định % ức chế biến tính albumin như sau:

Trong đó:

Control: mẫu đối chứng âm (DMSO)

Sample: mẫu thí nghiệm

3.4.4.2 Ức chế sự phân giải protein

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Leelaprakash và cs [28] và

AJ [47] Hỗn hợp phản ứng gồm 1mL dịch mẫu, 0,06 mg trypsin và 1 mL đệm

70%, ly tâm lạnh (3000 v/p) trong 10 phút, thu dịch nổi và đo giá trị quang phổ hấp

μg/mL

Công thức tính % ức chế tương tự với thí nghiệm albumin

3.4.4.3 Khả năng ổn định màng tế bào - ức chế tan huyết bởi nhiệt độ

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1 mL dịch mẫu hòa với 1 mL Red Blood Cells (RBC)