Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro của thân cây Kê huyết đằng (Millettia dielsiana Harms) tại Tuyên Quang

Từ thân cây Kê huyết đằng (Millettia dielsiana Harms) đã xử lý và chiết mẫu thu nhận được các cặn chiết, trong đó cặn chiết tổng EtOH (220 g) và cặn chiết phân đoạn lần lượt là etyl axetat (MDE, 60 g), nước (MDW, 150 g). Phân tích định tính cặn chiết tổng của thân cây Kê huyết đằng chứa các nhóm chất thuộc steroid, alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin và tannin.

No.21_June 2021 |p.93-99 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ EVALUATION OF IN VITRO ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITIES FROM THE STEMS OF MILLETTIA DIELSIANA GROWING IN TUYEN QUANG PROVINCE Tran Duc Dai1,*, Dao Viet Hung2, Vu Thi Thu Le2, Vu Thanh Dat3 Tan Trao University, Vietnam Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry, Vietnam Thuyloi University, Vietnam * Địa email : ducdaitq@gmail.com http://doi.org/10.51453/2354-1431/2021/555 Article info Recieved: 21/3/2021 Accepted: 3/5/2021 Keywords: Ficus hirta, Moraceae, treatment, antiinflammatory, IC50 Abstract From the stem of Millettia dielsiana Harms was processed and partitioned to obtain crude extract (EtOH, 220 g), ethyl acetate fraction (MDE, 60 g) and water fraction (MDW, 150 g) The quantitative phytochemical of crude extract (EtOH) from the stem of Millettia dielsiana Harms has contain a significant of steroids, alkaloids, flavonoids, coumarins, saponins and tannins content The in vitro antiinflammatory activity of several extracts showed crude extract (EtOH) good the anti-inflammatory with IC50 value of 46,98 µg/ml and did not show cytotoxicity, the ethyl acetate fraction and water fraction displayed moderate anti-inflammatory with IC50 value of 33,07 µg/ml 95,46 µg/ml, respectively No.21_June 2021 |p.93-99 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM IN VITRO CỦA THÂN CÂY KÊ HUYẾT ĐẰNG (MILLETTIA DIELSIANA HARMS) TẠI TUYÊN QUANG Trần Đức Đại1,*, Đào Việt Hùng2, Vũ Thị Thu Lê2, Vũ Thành Đạt3 Trường Đại học Tân Trào, Việt Nam Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Việt Nam Trường Đại học Thủy Lợi, Việt Nam * Email address : ducdaitq@gmail.com http://doi.org/10.51453/2354-1431/2021/555 Thông tin tác giả Ngày nhận bài: 21/3/2021 Ngày duyệt đăng: 3/5/2021 Từ khóa: Millettia dielsiana, Millettia, định tính, kháng viêm, IC50 Tóm tắt: Từ thân Kê huyết đằng (Millettia dielsiana Harms) xử lý chiết mẫu thu nhận cặn chiết, cặn chiết tổng EtOH (220 g) cặn chiết phân đoạn etyl axetat (MDE, 60 g), nước (MDW, 150 g) Phân tích định tính cặn chiết tổng thân Kê huyết đằng chứa nhóm chất thuộc steroid, alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin tannin Thử hoạt tính kháng viêm cặn chiết thu nhận từ thân Cỏ máu cho thấy, cặn tổng EtOH nồng độ 100 µg/ml có khả ức chế sản sinh NO mạnh không gây độc cho cho tế bào với giá trị IC50 46,98 µg/ml Đối với cặn MDE MDW biểu hoạt tính kháng viêm tốt với giá trị IC50 33,07 µg/ml 95,46 µg/ml I MỞ ĐẦU Chi Thàn mát (Millettia) có khoảng 260 loài phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trong đó, châu Phi có khoảng 139 lồi châu Á với khoảng 121 loài [1] Ở Việt Nam, chi Thàn mát (Millettia) có khoảng 12 lồi phân bố rộng khắp nước [2] Các loài thực vật thuộc chi Thàn mát (Millettia) thường sử dụng vào mục đích khác chống ung thư, chống viêm, kháng virut, diệt khuẩn, diệt côn trùng diệt sâu bệnh [1] Thành phần hóa học thực vật chi Thàn mát (Millettia) nghiên cứu thuộc nhóm flavonoid có khung isoflavone, flavanone, flavanonol, chalcone, rotenoid, Trong đó, hợp chất isoflavone phân lập nhiều Cây Kê huyết đằng hay Cỏ máu (Millettia dielsiana) cách gọi dân gian người xưa, dịch tiết gần giống với máu người [2] sử dụng để làm thuốc chữa viêm khớp, an thần, tăng cường tiết điều trị số loại bệnh thiếu máu, lưng gối đau mỏi, chân tay tê liệt kinh nguyệt không Cùng với đó, có vị đắng, tính bình tác dụng bổ huyết, thống, nhiệt, giải độc, thừa cân… [3] Nhóm nghiên cứu Haoyu Ye cộng thử nghiệm hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO in vitro 11 hợp chất isoflavone phân lập từ dịch chiết etyl axetat thân loài Millettia dielsiana Harms Kết thu cho thấy, hợp chất Millesianin C, T.D.Dai et al/ No.21_Jun 2021|p.93-99 durallone, barbigerone, ichthynone, durmillone, methoxicalpogonium isoflavone A, calopogonium isoflavone A, millesianin D, millesianin I thể ức chế đáng kể sản sinh NO với giá trị IC 50 từ 1,37 đến 2,22 μM Ngoài ra, hydroxi-6-methoxi-3-4methylenedioxi-8-3-3-dimethylallyl-isoflavone Millesianin H khơng thể hoạt tính [4] Ở nước ta, nhóm nghiên cứu Lê Đức Đạt cộng phân lập nhận dạng 15 hợp chất từ thân Cỏ máu chiết etanol Hợp chất thu gồm có hợp chất isoflavone glucoside Mildiside A 14 dẫn xuất khác hợp chất phenolic Kết đánh giá khả ức chế tạo NO tế bào RAW264.7 LPS gây nên 15 hợp chất phân lập từ thân Cỏ máu cho thấy, hợp chất (3S)-vestitol biểu ức chế mạnh với giá trị IC50 16,0 μM Tiếp đó, hợp chất isoliquiritigenin tupichinol C thể hoạt tính mức trung bình với giá trị IC 50 31,2 μM 38,4 μM Các hợp chất lại cho thấy biểu hoạt tính yếu [5] Như vậy, Kê huyết đằng (Millettia dielsiana Harms) nghiên cứu hợp chất phân lập từ loài nguồn thông tin quý giá giúp nhà khoa học có định hướng nghiên cứu sâu hoạt tính hoạt tính kháng viêm Trong nghiên cứu trình bày hoạt tính kháng viêm in vitro thơng qua ức chế sản sinh NO cặn chiết tổng phân đoạn, định tính nhóm chất thân Kê huyết đằng (Millettia dielsiana) II THỰC NGHIỆM Nguyên liệu Mẫu thân Kê huyết đằng thu hái Yên Sơn - Tuyên Quang vào tháng 08 năm 2019 TS Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học Millettia dielsiana Harms, họ Fabaceae Mẫu tiêu lưu giữ Bảo tàng Thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Dung môi, hóa chất, thiết bị Dung mơi, hóa chất: n-hexan, etyl axetat, metanol, etanol, vanilin, axit sunfuric đặc, mỏng silica gel (20x20 cm), silica gel (40x63 μm) Dụng cụ: phễu chiết 2000 ml; cốc 500 ml, 1000 ml; ống đong 25 ml, 50 ml; bình cầu đáy trịn 250 ml, 1000 ml; cột sắc kí có ϕ 30 mm, 40 mm, 60 mm; giấy lọc 60 mm; micropipet; giá đỡ; bút chì; bơng thủy tinh; lọ penicilin; thước kẻ 30 cm; bình triển khai sắc kí Thiết bị: máy quay chân không N-1300 (Nhật); máy khuấy từ gia nhiệt RCT basic IKAMAG (Malaysia); máy siêu âm S100H (Đức); đèn soi UV VL-8.MC (Pháp); tủ hút ZJ-TFG-12 (Việt Nam); cân kỹ thuật PA214C (Philippines) Dòng tế bào: RAW 264,7 American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA cung cấp; lipopolysaccharides (LPS), Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) cung cấp từ Life Technologies, Inc, (Gaithersburg, MD, USA) Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1napthylethylenediaminedihydrochloride dimethyl sulfanilamide (DMSO) Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật, tạo cao chiết Mẫu thân Kê huyết đằng sau thu hái thái nhỏ, phơi bóng mát sấy khô nhiệt độ 60 oC đến khối lượng không đổi, sau đem nghiền nhỏ Mẫu ngâm chiết lần với etanol thiết bị siêu âm nhiệt độ phịng Dịch tổng cất kiệt dung mơi áp suất giảm, nhiệt độ 50 oC thu cặn tổng etanol (EtOH) Cặn tổng etanol (EtOH) thêm nước chiết với dung môi etyl axetat (EtOAc) Sau cất kiệt dung môi thu cặn chiết phân đoạn tương ứng etyl axetat (MDE) nước (MDW) Quy trình ngâm chiết thân Kê huyết đằng trình bày hình 3.2 Khảo sát định tính cặn chiết [6,7] 3.2.1 Phát steroid Lấy 10 mg cặn tổng, thêm ml dung dịch NaOH 10% đun cách thủy đến khơ Hồ tan cặn ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tính steroid với thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp ml anhydrit axetic với ml cloroform để lạnh 0oC, sau cho thêm giọt H2SO4 đậm đặc) Lấy ml dịch cloroform thêm giọt thuốc thử, dung dịch xuất màu xanh thời gian phản ứng dương tính 3.2.2 Phát alkaloid T.D.Dai et al/ No.21_Jun 2021|p.93-99 Lấy 10 mg cặn tổng, thêm ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào ống nghiệm, ống ml nước lọc mức độ bền vững bọt Nếu bọt cao 3-4 cm bền 15 phút phản ứng dương tính 3.2.7 Phát tannin Ống (1): 1-2 giọt dung dịch axit silicostungtic Lấy 10 mg cặn tổng, thêm 10 ml metanol + nước 5%, có tủa trắng nhiều phản ứng dương cất, khuấy nhỏ 2-3 giọt FeCl3 5%, có tính Ống (2): 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff xuất màu da cam phản ứng dương tính Ống (3): 3-5 giọt thuốc thử Mayer, xuất tủa trắng phản ứng dương tính 3.2.3 Phát flavonoid Lấy 10 mg cặn tổng, thêm 10 ml metanol, đun nóng cho tan lọc qua giấy lọc Lấy ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm bột magie (Mg) kẽm (Zn), sau cho vào giọt HCl đậm đặc, đun bình cách thuỷ vài phút Dung dịch xuất màu đỏ màu hồng phản ứng dương tính với flavonoid 3.2.4 Phát coumarin Dịch để thử định tính chuẩn bị mục phát steroid Lấy vào ống nghiệm, ống ml dịch thử cho vào ống 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ hai ống đến sôi, để nguội cho thêm ml nước cất màu xanh lục hay đen phản ứng dương tính 3.3 Thử hoạt tính sinh học cặn chiết Hoạt tính kháng viêm in vitro thơng qua khả ức chế sản sinh NO tế bào RAW264,7 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) chuột thực phịng Sinh học Thực nghiệm, Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nuôi cấy tế bào RAW264,7 theo phương pháp Fumio Amano cộng [8] Xác định hoạt tính kháng viêm dịng tế bào RAW264,7 theo phương pháp phân tích Griess Verena M Dirsch cộng [9] Cách tiến hành cụ thể sau: tế bào RAW264,7 (đại thực bào chuột) nuôi cấy 48 môi trường nuôi cấy Dulbecco cải tiến (DMEMDulbecco’s Modified Eagle Medium) 37 oC, 5% vào ống Nếu chất lỏng ống có kiềm CO2, 10% huyết phơi bị (FBS-Fetal Bovine ống khơng kiềm xem phản ứng Serum) Sau dịch tế bào chuyển lên giếng dương tính, đem axit hố ống có kiềm phiến 96 với mật độ 2,5x105 tế bào/giếng Tế bào vài giọt HCl đậm đặc làm cho dịch kích thích với µl mẫu đối chứng (-) LPS vẩn đục màu vàng xuất tạo (0,1 mg/ml) 24 bổ sung thuốc tủa phản ứng dương tính Ngồi ra, làm chất thử nồng độ khác Cardamonin phản ứng diazo hoá với axit sulfanilic môi sử dụng làm mẫu đối chứng (+) Dịch huyền trường axit, cho màu da cam đến cam nhạt cho phù tế bào ủ với thuốc thử Griess kết dương tính coumarin NaNO2 nồng độ khác để xây dựng 3.2.5 Phát glucoside tim Chuẩn bị dịch thử định tính làm mục phát steroid Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5 ml dịch thử, thêm vào giọt dung dịch natri prussiat 0,5% giọt NaOH 10% không xuất màu đỏ phản ứng âm tính với vịng butenolit 3.2.6 Phát saponin Chuẩn bị dịch thử mục phát đường chuẩn Đo hỗn hợp phản ứng bước sóng λ = 570 nm Hàm lượng NO cao mật độ quang lớn xác định dựa vào đường chuẩn NaNO2, so sánh % với mẫu đối chứng (-) LPS Khả ức chế sản sinh NO mẫu xác định theo công thức sau: % Ức chế = 100 – [(Hàm lượng NO mẫu thử/Hàm lượng NOLPS)×100] steroid Lấy ống nghiệm ống cho ml dịch III Kết nghiên cứu thử Ống cho ml HCl loãng, ống cho ml 3.1 Thu nhận phân tích định tính cặn chiết NaOH lỗng bịt miệng ống nghiệm, lắc 3.1.1 Thu nhận cặn chiết vòng phút theo chiều dọc, quan sát xuất T.D.Dai et al/ No.21_Jun 2021|p.93-99 Hình Sơ đồ quy trình ngâm chiết thân Kê huyết đằng (Millettia dielsiana Harms) Mẫu thân Kê huyết đằng sau thu hái dung mơi etyl axetat, sau cất kiệt dung mơi thu thái nhỏ, phơi bóng mát, sấy khô nhiệt độ cặn chiết phân đoạn tương ứng o 60 C đến khối lượng không đổi 5000 g, đem etyl axetat (MDE: 60 g, hiệu suất chiết 1,2%) nghiền nhỏ ngâm chiết lần với etanol (EtOH) nước (MDW: 150 g, hiệu suất chiết 3%) thiết bị siêu âm nhiệt độ phòng Dịch tổng 3.1.2 Phân tích định tính cặn chiết tổng thu cất kiệt dung môi áp suất giảm, nhiệt độ 50 oC thu cặn tổng EtOH (220 g) Cặn tổng EtOH thêm nước chiết với Kết phân tích định tính nhóm chất từ cặn chiết tổng trình bày bảng ng Kết phân tích định tính nhóm chất từ cặn chiết tổng TT Nhóm chất Steroid Alkaloid Thuốc thử Hiện tượng Cặn tổng Lieberman-Bourchardt Màu xanh + Dragendorff Vàng da cam + Dung dịch axit silicostungtic 5% Kết tủa trắng + Mayer Kết tủa trắng + Dung dịch nhạt màu dẫn Flavonoid Zn(Mg) + HCl Coumarin Phản ứng tạo kết tủa bơng Có kết tủa + Glucoside tim Legal Không màu - Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền NaOH + Tanin FeCl3 Màu xanh + đến màu đỏ nhạt + Chú thích: (+) Ph n ứng dương tính; (-) Ph n ứng âm tính Kết thu cho thấy nhóm chất chứa thân Kê huyết đằng gồm steroid, alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin tannin 3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học cặn chiết Thử hoạt tính kháng viêm cặn chiết thu nhận từ thân Cỏ máu đánh giá thông qua ức chế sinh NO kích thích LPS đại thực bào RAW 264,7 Kết thử hoạt tính kháng viêm cặn chiết trình bày bảng T.D.Dai et al/ No.21_Jun 2021|p.93-99 B ng Kết thử khả ức chế sản sinh NO tế bào RAW 264,7 Tên mẫu Nồng độ mẫu Đối chứng (-) (-) Đối chứng (+) [Cardamonin] LPS Cặn EtOH Cặn MDE Cặn MDW Tỷ lệ ức chế sản sinh NO (%) Tỷ lệ tế bào sống sót (%) 100,00 ± 1,30 104,76 ± 0,15 0,3 µM 45,85 ± 2,12 86,47 ± 0,21 3,0 µM 86,93 ± 0,96 71,80 ± 0,51 (-) 0,00 ± 0,96 100 µg/ml 75,30 ± 2,20 86,74 ± 2,30 30 µg/ml 43,50 ± 1,90 91,21 ± 1,90 10 µg/ml 26,20 ± 1,00 97,30 ± 1,70 100 µg/ml 97,05 ± 0,50 101,47 ± 1,30 30 µg/ml 54,27 ± 3,20 105,92 ± 0,90 10 µg/ml 28,23 ± 3,60 103,15 ± 0,60 100 µg/ml 51,25 ± 1,30 107,60 ± 1,20 30 µg/ml 30,99 ± 0,30 103,80 ± 0,80 10 µg/ml 24,27 ± 0,40 102,50 ± 1,60 IC50 2,12 µM 46,98 µg/ml 33,07 µg/ml 95,46 µg/ml Kết bảng cho thấy, cặn chiết thể hoạt tính ức chế đại thực bào RAW 264,7 sản sinh NO khoảng nồng độ khảo sát (p < 0,05) với LPS đối chứng (-), đối chứng (+) cardamonin 0,3 µM Cặn tổng EtOH nồng độ 100 µg/ml có khả ức chế sản sinh NO mạnh không gây độc cho cho tế bào với IC50 46,98 µg/ml Cặn MDE biểu hoạt tính kháng viêm tốt với IC50 33,07 µg/ml, cặn MDW thể tốt IC50 95,46 µg/ml Như vậy, hoạt tính kháng viêm Kê huyết đằng (Millettia dielsiana Harms) tập chung chủ yếu phân đoạn phân cực MDE Một số nghiên cứu chi Thàn mát (Millettia) nhận thấy chi Thàn mát (Millettia) có hoạt tính kháng viêm mạnh chủ yếu hợp chất flavone isoflavone thể [4,5] Từ đó, cặn MDE ưu tiên cho việc nghiên cứu thành phần hóa học KẾT LUẬN Từ mẫu thân Kê huyết đằng (Millettia dielsiana Harms) xử lý chiết mẫu khô thu nhận cặn chiết, cặn chiết tổng EtOH (220 g) cặn chiết phân đoạn MDE (60 g, hiệu suất chiết 1,2%), MDW (150 g, hiệu suất chiết 3%) Phân tích, định tính cặn chiết tổng thân Kê huyết đằng chứa nhóm chất thuộc steroid, alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin tannin Thử hoạt tính kháng viêm cặn chiết thu nhận từ thân Kê huyết đằng cho thấy, cặn tổng EtOH nồng độ 100 µg/ml có khả ức chế sản sinh NO mạnh không gây độc cho cho tế bào với IC50 46,98 µg/ml Đối với cặn MDE, cặn MDW biểu hoạt tính kháng viêm tốt với giá trị IC50 33,07 µg/ml 95,46 µg/ml Lời cảm ơn: Các kết nghiên cứu hỗ trợ kinh phí từ Đề tài sở năm 2021 trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên REFERENCES [1] Banzouzi, J.T., Prost, A., Rajemiarimiraho, M., Ongoka, P (2008) Traditional Uses of the African Millettia species (Fabaceae) International Journal of Botany (4): 406-420 [2] Khoi, N.D et al (2003) List of plant species in Vietnam Agriculture Publishers, 2, Vietnam [3] Bich, D.H., Chung, D.Q., Chuong, B.X., Dong, N.T., Dam, D.T., Hien, P.V., Lo, V.N., Mai, P.D., Man, P.K., Nhu, D.T., Lap, N., Toan, T (2006) The medicinal plants and animals in Vietnam Scientific & Technical Publishing, 1, Vietnam [4] Haoyu, Y et al (2014) Bioactivity-guided isolation of anti-inflammation flavonoids from the T.D.Dai et al/ No.21_Jun 2021|p.93-99 stems of Millettia dielsiana Harms Fitoterapia 95: 154-159 [5] Dat, L.D et al (2019) Anti-inflammatory secondary metabolites from the stems of Millettia on coastal medicinal plants of boloor, mangalore Indo American Journal of Pharmaceutical Sciences 5(2): 1309-1315 [8] Fumio, A (1999) Inhibitory Effects of dielsiana Harms ex Diels Carbohydrate Research Hydrolyzable 484: 1-5, Vietnam dodecandrum Lour on Nitric Oxide Production by a Murine Macrophage-Like Cell Line, RAW264.7, [6] Baghel, P.S., Sudip, R.Dr (2017) Preliminary phytochemical screening of certain aphrodisiac plants used in traditional system of medicine International Journal of Botany Studies 2(5): 33-36 Tannis from Melastoma Activated with Lipopolysaccharide and Interferonγ Biological and Pharmaceutical Bulletin 2(6): 647-653 [9] Verena M.D et al (1998) The Griess Assay: Suitable for a Bio-guided Fractionation of [7] Jothi, M.M., Lakshman, K (2018) Preliminary studies of phytochemical investigation Anti-Inflammatory Plan Extracts Plant Med 64(5): 423-426  ... 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM IN VITRO CỦA THÂN CÂY KÊ HUYẾT ĐẰNG (MILLETTIA DIELSIANA HARMS) TẠI TUYÊN QUANG Trần Đức Đại1,*, Đào Việt Hùng2, Vũ Thị... ứng âm tính Kết thu cho thấy nhóm chất chứa thân Kê huyết đằng gồm steroid, alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin tannin 3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học cặn chiết Thử hoạt tính kháng viêm cặn... tích, định tính cặn chiết tổng thân Kê huyết đằng chứa nhóm chất thuộc steroid, alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin tannin Thử hoạt tính kháng viêm cặn chiết thu nhận từ thân Kê huyết đằng cho