TỐI ưu hóa QUY TRÌNH sử DỤNG ENZYME để TÁCH CHIẾT ROSMARINIC ACID từ lá xô THƠM (salvia officinalis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP đáp ỨNG bề mặt RSM

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH SỬ DỤNG ENZYME ĐỂ TÁCH CHIẾT ROSMARINIC ACID TỪ LÁ XÔ THƠM (Salvia officinalis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT RSM Người hướng dẫn: ThS NGUYỄN HOÀNG CHINH Người thực hiện: TRẦN YẾN BÌNH Lớp: 14060301 Khố: 18 2 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 3 LỜI CẢM ƠN 4 LỜI CAM ĐOAN 5 TÓM TẮT KHÓA LUẬN 6 MỤC LỤC 7 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 8 DANH MỤC BẢNG 9 DANH MỤC HÌNH 10 10 DANH MỤC BIỂU ĐỒ 61 61 khoảng 13 mg/g thấp khoảng mg/g Còn tăng thời gian tách chiết hàm lượng rosmarinic acid tăng theo đến giá trị định giảm dần tiếp tục tăng thời gian chiết, hàm lượng rosmarinic acid xác định cao (khoảng mg/g) thời gian tách chiết Xét tương tác nhân tố, ta thấy hàm lượng rosmarinic acid thu cao (khoảng 13.5 mg/g) nhiệt độ 60 0C thời gian tách chiết giờ, so với thời gian tách chiết nhiệt độ 60 0C hàm lượng rosmarinic acid khơng có khác biệt Từ cho thấy khơng có tương tác nhiệt độ thời gian lên hàm lượng rosmarinic acid theo kết phân tích thống kê tương tác nhiệt độ thời gian khơng có nghĩa (P > 0.05) 4.2.3 Kết kiểm chứng tối ưu mơ hình thí nghiệm Kết tối ưu hóa quy trình sử dụng enzyme để tách chiết rosmarinic acid mục đích quan trọng việc thu nhận rosmarinic acid với hàm lượng cao Từ số liệu thực nghiệm thu được, phần mềm Minitab dự đoán điều kiện tối ưu mà hàm lượng rosmarinic acid đạt giá trị cao cụ thể sau: với nồng độ enzyme 5.45%, tỷ lệ nước/mẫu 51.5 ml/g, nhiệt độ 52.5 0C thời gian hàm lượng rosmarinic acid đạt giá trị tối đa 14.168 mg/g (Hình 4.1) 62 62 Hình 4.12 Kết tối ưu hóa điều kiện tách chiết ảnh hưởng lên hàm lượng rosmarinic acid Để kiểm chứng kết tối ưu dự đốn từ mơ hình, tiến hành thực thí nghiệm dựa điều kiện tối ưu Kết kiểm chứng thực nghiệm cho thấy với điều kiện dự đoán từ mơ hình hàm lượng rosmarinic acid xác định 14.109 ± 0.301 mg/g Điều chứng tỏ hàm lượng rosmarinic acid dự đốn từ mơ hình (14.168 mg/g) so với thực nghiệm hoàn toàn tương đương nhau, từ cho thấy độ xác cao phương pháp RSM việc xác định điều kiện tối ưu ảnh hưởng lên hàm lượng rosmarinic acid Theo nghiên cứu Fatma Ebru cộng (2017) thu nhận rosmarinic acid phương pháp sử dụng ethanol 70% tách chiết 40 – 50 0C khoảng thời gian – hàm lượng rosamrinic acid 7.42 mg/g Từ đó, lần khẳng định việc tối ưu hóa quy trình sử dụng enzyme để tách chiết rosamrinic acid phương pháp đáp ứng bề mặt nghiên cứu có ý nghĩa 63 63 4.3 Kết khảo sát kháng oxi hóa từ dịch chiết Biểu đồ 4.13 Khả bắt gốc tự DPPH mẫu dịch chiết Biểu đồ 4.14 Khả bắt gốc tự DPPH vitamin C Khả kháng oxi hóa dịch chiết vitamin C thể qua Biểu đồ 4.13 Biểu đồ 4.14 Hiệu kháng oxi hóa dịch chiết vitamin C xác định dựa vào khả khử 50% gốc tự DPPH thể qua giá trị IC50 (Bảng 4.9) 64 64 Bảng 4.19 Khả khử 50% gốc tự DPPH dịch chiết mẫu vitamin C Mẫu Dịch chiết Vitamin C Giá trị IC50 (μg/ml) 1209.73 ± 146.25 93.83 ± 0.05 Kết từ Bảng 4.9 cho thấy, khả kháng oxi hóa dịch chiết 1.209 ± 0.146 mg/ml thấp 12.89 lần so với khả kháng oxi hóa vitamin C 93.93 ± 0.05 µg/ml Mặc dù khả kháng oxi hóa dịch chiết xô thơm thấp vitamin C khả kháng oxi hóa dịch chiết xơ thơm cao số khác theo nghiên cứu Eldeen cộng (2011) giá trị IC 50 Phèn đen (Phyllanthus reticulatus) 10.8 mg/ml thấp dịch chiết xô thơm 8.93 lần, nghiên cứu Xin Wang cộng (2017) giá trị IC 50 Dương xỉ (Selaginella remotifolia) 1.575 mg/ml thấp 1.30 lần, cao dịch chiết Hà Thủ Ô (Streptocaulon juventas) (IC50 = 2.586 mg/ml) 2.14 lần Từ cho thấy xơ thơm có tiềm việc điều trị bệnh chống oxi hóa 4.4 Kết định tính rosmarinic acid dịch chiết sắc ký mỏng TLC Kết sắc ký mỏng dịch chiết xô thơm đối chiếu với rosmarinic acid chuẩn, hệ dung môi khai triển gồm toluene – ethyl acetate – formic acid (5:4:1), quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm (hình 4.4) 65 65 Hình 4.13 Hình ảnh sắc ký đồ mẫu dịch chiết xô thơm rosmarinic acid chuẩn C: Rosmarinic acid; S: dịch chiết xô thơm Bảng 4.20 Hệ số di chuyển dịch chiết xô thơm rosmarinic acid Rf = 0.486 Rosmarinic acid Vạch 1: Rf = 0.722 Vạch 2: Rf = 0.653 Vạch 3: Rf = 0.597 Vạch 4: Rf = 0.486 Dịch chiết xô thơm Khi quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm, sắc ký đồ dịch chiết xô thơm xuất vạch, có vạch đậm có giá trị R f gần tương đương với rosmarinic acid chuẩn (R f = 0.486) Điều chứng tỏ dịch chiết xơ thơm có diện rosmarinic acid 66 66 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Kết sắc ký lớp mỏng cho thấy có diện rosmarinic acid dịch chiết, khẳng định khả hữu hiệu enzyme để tách chiết rosmarinic acid Từ khảo sát đơn nhân tố cho thấy loại enzyme ảnh hưởng lên hàm lượng rosmarinic acid nhiều cellulose protamex Thơng qua mơ hình BBD phương pháp đáp ứng bề mặt RSM dự đoán hàm lượng rosmarinic acid 14.168 mg/g nhân tố ảnh hưởng đến hàm lượng rosmarinic acid tối ưu sau: nồng độ enzyme 5.45%, tỷ lệ nước/mẫu 51.5 ml/g, nhiệt độ 52,5 0C, thời gian Kết thu thực nghiệm 14.109 ± 0.301 mg/g Giá trị kết thực nghiệm tương đương với dự đốn từ mơ hình, điều cho thấy phương pháp RSM – BBD xác định điều kiện tối ưu để thu nhận hàm lượng rosmarinic acid cao từ xô thơm Bên cạnh đó, khả kháng oxi hóa dịch chiết xơ thơm 1.209 ± 0.146 mg/g Từ cho thấy việc sử dụng enzyme để tách chiết rosmarinic acid tiềm lớn công nghiệp dược 5.2 Kiến nghị Do thời gian thực hạn chế nên nghiên cứu mang tính chất sơ lược quy trình sử dụng enzyme để tách chiết rosmarinic acid từ xơ thơm Vì vậy, nên có nghiên cứu sau: − Sử dụng enzyme để tách chiết rosmarinic acid từ lồi khác họ nhằm tìm rosmarinic acid lồi có chứa nhiều rosmarinic acid − Nghiên cứu quy trình tinh rosmarinic acid − Khảo sát khả kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư − 67 67 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp xây dựng đường chuẩn rosmarinic acid  Nguyên tắc: Rosmarinic acid phản ứng với Zirconium (IV) oxide chloride tạo phức màu vàng, có độ hấp thu màu bước sóng 362nm  Chuẩn bị dung dịch rosmarinic chuẩn: Cân xác 0.005 g rosmarinic acid hòa tan ethanol, định mức lên ml ethanol, thu dung dịch rosmarinic acid chuẩn có nồng độ 1000 µg/ml  Chuẩn bị thuốc thử Zirconium (IV) oxide chloride: Cân khoảng 1.6117 g thuốc thử Zirconium (IV) oxide chloride nước cất định mức lên 10 ml nước cất, thu dung dịch Zirconium (IV) oxide chloride có nồng độ 0.5M  Dựng đường chuẩn rosmarinic acid: Pha rosmarinic acid có nồng độ 100, 200, 400, 600, 800, 1000 µg/ml Sau đó, hút 200 µl dung dịch rosmarinic acid pha lỗng vào ống nghiệm có đánh số thứ tự, bổ sung 4.6 ml ethanol 200 µg thuốc thử Zirconium (IV) oxide chloride, lắc Sau phút, đem xác định độ hấp phụ quang phổ bước sóng 362nm Dựng đường chuẩn Hình Đường chuẩn hàm lượng rosmarinic acid Phụ lục 2: Kết phân tích ANOVA nhân tố ảnh hưởng lên hàm lượng rosmarinic acid từ xô thơm  Kết phân tích thống kê ảnh hưởng loại enzyme lên hàm lượng rosmarinic acid từ xô thơm 68 68 69 69  Kết phân tích thống kê ảnh hưởng nồng độ enzyme lên hàm lượng rosmarinic acid từ xô thơm 70 70  Kết phân tích thống kê tỷ lệ nước/mẫu ảnh hưởng lên hàm lượng rosmarinic acid từ xô thơm 71 71  Kết phân tích thống kê nhiệt độ ảnh hưởng lên hàm lượng rosmarinic acid từ xơ thơm 72 72  Kết phân tích thống kê thời gian ảnh hưởng lên hàm lượng rosmarinic acid từ xô thơm 73 73 Phụ lục 3: Kết tối ưu hóa nhân tố ảnh hưởng lên hàm lượng rosmarinic acid từ xô thơm Box-Behnken Design Factors: Base runs: Base blocks: 27 Replicates: Total runs: Total blocks: 27 Center points: Results for: Worksheet Response Surface Regression: ROSMARINIC ACID versus A, B, C, D The analysis was done using coded units Estimated Regression Coefficients for ROSMARINIC ACID Term Constant A B C D A*A B*B C*C D*D A*B A*C A*D B*C B*D C*D Coef 13.8600 -0.1233 0.5583 0.4575 0.0042 -1.8988 -4.4488 -0.6500 0.2000 -0.3225 -0.0125 0.7100 -0.2950 0.0675 -0.1150 S = 0.852717 R-Sq = 94.08% SE Coef 0.4923 0.2462 0.2462 0.2462 0.2462 0.3692 0.3692 0.3692 0.3692 0.4264 0.4264 0.4264 0.4264 0.4264 0.4264 T 28.153 -0.501 2.268 1.859 0.017 -5.142 -12.048 -1.760 0.542 -0.756 -0.029 1.665 -0.692 0.158 -0.270 PRESS = 49.7655 R-Sq(pred) = 66.21% P 0.000 0.625 0.043 0.088 0.987 0.000 0.000 0.104 0.598 0.464 0.977 0.122 0.502 0.877 0.792 R-Sq(adj) = 87.16% Analysis of Variance for ROSMARINIC ACID Source DF Seq SS Regression 14 138.553 Linear 6.435 A 0.183 B 3.741 C 2.512 D 0.000 Square 129.265 A*A 5.630 B*B 120.340 C*C 3.082 D*D 0.213 Interosmarinic acidction A*B 0.416 A*C 0.001 A*D 2.016 B*C 0.348 Adj SS Adj MS F P 138.553 9.897 13.61 0.000 6.435 1.609 2.21 0.129 0.183 0.183 0.25 0.625 3.741 3.741 5.14 0.043 2.512 2.512 3.45 0.088 0.000 0.000 0.00 0.987 129.265 32.316 44.44 0.000 19.228 19.228 26.44 0.000 105.554 105.554 145.17 0.000 2.253 2.253 3.10 0.104 0.213 0.213 0.29 0.598 2.852 2.852 0.475 0.416 0.416 0.57 0.464 0.001 0.001 0.00 0.977 2.016 2.016 2.77 0.122 0.348 0.348 0.48 0.502 0.65 0.688 74 74 B*D C*D Residual Error Lack-of-Fit Pure Error Total 1 12 10 26 0.018 0.053 8.726 8.585 0.141 147.278 0.018 0.053 8.726 8.585 0.141 0.018 0.053 0.727 0.858 0.070 0.03 0.07 0.877 0.792 12.21 0.078 Unusual Observations for ROSMARINIC ACID Obs 10 StdOrder 21 23 ROSMARINIC ACID 10.550 9.116 0.651 10.110 8.990 0.651 5.640 6.755 0.651 Fit SE Fit 1.434 1.120 -1.115 Residual 2.60 R 2.04 R -2.03 R St Resid R denotes an observation with a large standardized residual Estimated Regression Coefficients for ROSMARINIC ACID using data in uncoded units Term Constant A B C D A*A B*B C*C D*D A*B A*C A*D B*C B*D C*D Coef 13.8600 -0.123333 0.558333 0.457500 0.00416667 -1.89875 -4.44875 -0.650000 0.200000 -0.322500 -0.0125000 0.710000 -0.295000 0.0675000 -0.115000 Predicted Response for New Design Points Using Model for ROSMARINIC ACID Point 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Fit 8.5167 9.1162 11.6329 10.2412 13.7567 13.9783 8.9896 7.1533 12.7521 6.7550 12.8333 10.0979 10.7429 13.8600 11.9046 12.9904 10.9646 11.3238 11.5788 9.4821 13.0717 8.9554 13.8600 SE Fit 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.492317 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.651274 0.492317 95% ( 7.0977, ( 7.6972, (10.2139, ( 8.8222, (12.3377, (12.5593, ( 7.5706, ( 5.7343, (11.3331, ( 5.3360, (11.4143, ( 8.6789, ( 9.3239, (12.7873, (10.4856, (11.5714, ( 9.5456, ( 9.9047, (10.1597, ( 8.0631, (11.6527, ( 7.5364, (12.7873, CI 9.9357) 10.5353) 13.0519) 11.6603) 15.1757) 15.3973) 10.4086) 8.5723) 14.1711) 8.1740) 14.2523) 11.5169) 12.1619) 14.9327) 13.3236) 14.4094) 12.3836) 12.7428) 12.9978) 10.9011) 14.4907) 10.3744) 14.9327) 95% ( 6.1788, ( 6.7784, ( 9.2951, ( 7.9034, (11.4188, (11.6405, ( 6.6518, ( 4.8155, (10.4143, ( 4.4172, (10.4955, ( 7.7601, ( 8.4051, (11.7147, ( 9.5668, (10.6526, ( 8.6268, ( 8.9859, ( 9.2409, ( 7.1443, (10.7338, ( 6.6176, (11.7147, PI 10.8545) 11.4541) 13.9707) 12.5791) 16.0945) 16.3162) 11.3274) 9.4912) 15.0899) 9.0928) 15.1712) 12.4357) 13.0807) 16.0053) 14.2424) 15.3282) 13.3024) 13.6616) 13.9166) 11.8199) 15.4095) 11.2932) 16.0053) 75 75 24 25 26 27 9.1571 13.8600 7.6250 7.4504 0.651274 0.492317 0.651274 0.651274 ( 7.7381, 10.5761) (12.7873, 14.9327) ( 6.2060, 9.0440) ( 6.0314, 8.8694) ( 6.8193, 11.4949) (11.7147, 16.0053) ( 5.2872, 9.9628) ( 5.1126, 9.7882) [1] M Petersen, M.S Simmonds, Rosmarinic acid, Phytochemistry 62(2) (2003) 121-125 [2] M Shekarchi, H Hajimehdipoor, S Saeidnia, A.R Gohari, M.P Hamedani, Comparative study of rosmarinic acid content in some plants of Labiatae family, Pharmacognosy magazine 8(29) (2012) 37 [3] A Ghorbani, M Esmaeilizadeh, Pharmacological properties of Salvia officinalis and its components, Journal of traditional and complementary medicine 7(4) (2017) 433-440 ... ưu hóa quy trình sử dụng enzyme để tách chiết rosmarinic acid từ Xô thơm (Salvia officinalis) phương pháp đáp ứng bề mặt RSM 12 12 1.2 Mục đích nghiên cứu Đề tài: Tối ưu hóa quy trình sử dụng. .. dụng enzyme để tách chiết rosmarinic acid từ Xô thơm (Salvia officinalis) phương pháp đáp ứng bề mặt RSM với mục địch xác định điều kiện tối ưu nhằm tách chiết hàm lượng rosmarinic acid từ xơ thơm. .. lượng rosmarinic acid Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hàm lượng rosmarinic acid Tối ưu hóa điều kiện tách chiết phương pháp đáp ứng bề mặt RSM Khảo sát khả kháng oxi hóa dịch chiết phương pháp