Nghiên cứu này nhằm lựa chọn các điều kiện và môi trường lên men phù hợp cho sự sinh trưởng và tạo bào tử của chủng Bacillus S5 để ứng dụng trong sản xuất probiotic cho nuôi trồng thủy sản. Mật độ tế bào OD550nm trong dịch nuôi cấy là thông số được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện lên men. Tối ưu các điều kiện lên men được sử dụng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM).
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NUÔI CẤY THU NHẬN BÀO TỬ Bacillus S5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT (RSM) Võ Hồng Phượng1*, Đặng Ngọc Thùy1, Nguyễn Thị Lan Chi1, Nguyễn Thanh Trúc1, Chu Quang Trọng1, Phạm Thị Huyền Diệu2 TÓM TẮT Chủng vi khuẩn Bacillus S5 phân lập từ bùn ao ni tơm quảng canh có khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND - acute hepatapancreatic necrosis disease) điều kiện thí nghiệm Nghiên cứu nhằm lựa chọn điều kiện môi trường lên men phù hợp cho sinh trưởng tạo bào tử chủng Bacillus S5 để ứng dụng sản xuất probiotic cho nuôi trồng thủy sản Mật độ tế bào OD550nm dịch nuôi cấy thông số sử dụng để đánh giá ảnh hưởng điều kiện lên men Tối ưu điều kiện lên men sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối Bacillus S5 sau 48 lên men đạt giá trị OD550nm 11,36 tương ứng 4,3x109 CFU/mL là: bột đậu nành 34,9 g/L, cao nấm men 20 g/L, glucose 35 g/L tốc độ lắc 170 vịng/phút Ngồi ra, 0,5 g/L ion Ca2+ bổ sung sau 30 lên men kích thích 90% tế bào dinh dưỡng Bacillus S5 chuyển thành bào tử Từ khóa: Sinh khối Bacillus S5, bào tử Bacillus S5, tối ưu điều kiện nuôi cấy I ĐẶT VẤN ĐỀ Khả kháng kháng sinh tác nhân gây bệnh thúc đẩy phát triển nhiều cơng trình nghiên cứu giải pháp thay kháng sinh trị bệnh vi khuẩn gây (Gauri ctv., 2011) Các chủng Bacillus xem đối tượng hàng đầu nhiều nhà nghiên cứu khoa học quan tâm nhằm ứng dụng sản xuất probiotic với số đặc tính sản sinh số enzyme ngoại bào, tạo bào tử bền với nhiệt thuận lợi trình sản xuất, bảo quản sử dụng (Duc ctv., 2004) Lên men chìm xem phương pháp hữu hiệu ứng dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất probiotic nhờ khả kiểm sốt thơng số dễ dàng (Nguyễn Văn Thanh ctv., 2009) Bacillus subtilis vi khuẩn Gram dương, khả tạo bào tử chúng xem nghiên cứu quan trọng lĩnh vực công nghiệp (Harwood, 1992) Thể bào tử B subtilis kích thích mạnh mật độ tế bào vi khuẩn cao (Grossman Losick, 1988), thiếu hụt dinh dưỡng (Schaeffer ctv., 1965), thành phần muối khống cao, pH mơi trường ni cấy trung tính nhiệt độ môi trường nuôi phù hợp với loài vi khuẩn (Bernlohr Leitzmann, 1969) Bào tử Bacillus sp hình thành sau pha tăng trưởng (log phage) tế bào sinh dưỡng Trong điều kiện lý tưởng, hiệu chuyển thành bào tử vi khuẩn Bacillus sp mật độ 108 tế bào ml-1 khoảng 30-100% (Nicholson Setlow, 1990) Ngoài ra, muối đưa vào môi trường lên men tăng khả tạo bào tử nhóm Bacillus, với nồng độ ion kim loại nặng cao ảnh hưởng đáng kể đến trình tạo bào tử (Cho ctv., 2009) Sáu ion kim loại, Mn2+, Fe3+, Fe2+, Ca2+, Mg2+ Zn2+ xem yếu tố quan trọng kích thích bào tử (Kolodziej Slepecky, 1964, Granger ctv., 2011) Đến nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu báo cáo giá trị tối đa tạo bào tử B subtilis lên men chìm dao động 109 bào tử ml-1 đến 7,4 x109 bào tử ml-1(Monteiro ctv., 2005) Sự điều chỉnh số tạo bào tử trình lên men thường giám sát chặt Trung tâm Quan trắc Môi trường Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Trường Đại học Sư phạm, Tp HCM *Email: vohongphuong@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 45 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II chẽ nhằm kích thích tạo bào tử tốt (Rao ctv., 2007) Chủng Bacillus S5 phân lập từ mẫu bùn ao nuôi quảng canh Cà Mau, có khả tạo vịng kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh gan tụy cấp tính tơm (AHPND) với đường kính 15 mm điều kiện in vitro ổn định 24 khảo sát Bên cạnh đó, mật độ ban đầu Bacillus S5 giá trị 105 CFU/mL 106 CFU/mL có khả ức chế hồn toàn V parahaemolyticus (mật độ ban đầu tương ứng 104 105 CFU/mL) từ thời điểm 12 khảo sát Tỉ lệ bảo hộ (RPS) tôm sú tôm thẻ tương ứng đạt 61,8% 50,1% Kết định danh sinh hóa test kit API 50 CHB/E cho thấy chủng Bacillus S5 thuộc loài Bacillus subtilis (Võ Hồng Phượng ctv., 2018) Nhiều kỹ thuật sử dụng việc tối ưu yếu tố trình lên men nhằm tạo sinh khối tế bào cao nhất, phân tích yếu tố đơn, quy hoạch thực nghiệm (thống kê toán học) Thiết kế đơn yếu tố phương pháp cổ điển dễ sử dụng mơ hình thí nghiệm yếu tố khơng xét đến tương tác qua lại yếu tố lên sinh khối vi sinh vật lên men Để khắc phục vấn đề này, sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để tối ưu hóa giá trị yếu tố nghiên cứu Trong thiết kế thí nghiệm thiết kế thí nghiệm theo Plackett- Burman (PBD) (Plackett Burman, 1946) thiết kế cấu trúc tâm Central Composite Design (CCD), biết đến phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM), thiết kế hữu ích nhằm tối ưu điều kiện dinh dưỡng nuôi cấy trình lên men (Xiao ctv., 2007) Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon, nguồn nitơ, 46 ion khoáng khác đến khả hình thành tạo bào tử chủng Bacillus S5, xem chủng probiotic tiềm để ứng dụng công nghiệp nuôi trồng thủy sản nhằm giảm thiểu thiệt hại bệnh AHPND tôm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Chủng vi khuẩn Bacillus S5 phân lập từ bùn ao ni tơm quảng canh Cà Mau có khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND thuộc phạm vi đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm sú tôm thẻ chân trắng” Chủng Bacillus S5 làm giàu erlen 250 mL chứa 150 mL môi trường dinh dưỡng lỏng (Nutrient broth- NB) bổ sung 1,5% NaCl pH môi trường 7,2±0,2 thời gian 18-24 giờ, nhiệt độ ủ 300 C đến đạt mật độ 108 CFU/mL Sau đó, 2% chủng giống cấp vào erlen 100 ml chứa 50 mL nguồn dinh dưỡng cần khảo sát 2.2 Phương pháp sàng lọc đơn nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus S5 Sàng lọc sáu nguồn nitơ sáu nguồn carbon, thành phần môi trường lên men bao gồm 1,5% muối NaCl pH môi trường 7,2±0,2 Bảng thể nồng độ nguồn dinh dưỡng khảo sát Mỗi công thức môi trường lặp lại lần Giống vi khuẩn Bacillus S5 cung cấp với mật độ ban đầu 103 CFU/ mL Các erlen ủ lắc nhiệt độ 300C, 200 vòng/ phút, sau 48 xác định giá trị mật độ vi khuẩn thông qua số OD550nm (1 OD550nm tương đương 3,8x108 CFU/mL giá trị xây dựng đường chuẩn nghiên cứu này) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng Thành phần nồng độ nguồn dinh dưỡng khảo sát đơn lên men Bacillus S5 Nguồn Nitơ Cao nấm men Pepton Bột đậu nành Casein NaNO3 NH4Cl Nồng độ (g/L) Ghi 5-15 Glucose g/L 0,5 -2 Bổ sung Pepton g/L, Glucose g/L 2.3 Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến phát triển Bacillus S5 2.3.1 Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến việc tạo sinh khối Bacillus S5 ma trận Plackett- Burman (PB) Thiết kế Plackett- Burman (PBD) dựa mơ hình tuyến tính bậc Y = β0 +Σ βi Xi cách hiệu để sàng lọc thơng số lượng lớn yếu tố trình tối ưu (Plackett Burman, 1946) Trong Y hàm đáp ứng (mật độ vi khuẩn), β0 hệ số chặn βi hệ số tuyến tính Xi biến độc lập Sàng lọc 11 yếu tố với tổng số thí nghiệm thiết lập theo thiết kế 15 thí nghiệm Nguồn Carbon Glucose Xylose Dextrose Lactose Manitol Nồng độ (g/L) Ghi Pepton g/L 5-15 Furtose có thí nghiệm lặp lại tâm Mỗi yếu tố khảo sát ba mức giá trị mức cao (+1), mức thấp (-1) giá trị trung bình (0) Nguồn carbon nguồn nitơ lựa chọn thí nghiệm khảo sát yếu tố đơn Bên cạnh đó, số chất khống, điều kiện nuôi cấy tốc độ lắc, nhiệt độ xem yếu tố cần thiết đánh giá mức ảnh hưởng trình lên men vi sinh vật (Bảng 2) Thí nghiệm thiết kế erlen 100mL thể tích khảo sát 50 mL Sau thời gian 48 thu mẫu đo mật độ quang (OD) Kết mật độ quang (OD550nm) phân tích chương trình “Design Expert® 7.0” Stat-Ease, Inc., Minneapolis USA Bảng Các yếu tố mức ảnh hưởng thiết kế Plackett-Burman (PB) Bacillus S5 Yếu tố Pepton Bột đậu nành Cao nấm men Glucose Lactose Dextrose CaCl2 KH2PO4 MgSO4 Nhiệt độ ủ Đơn vị Ký hiệu Mức khảo sát Thấp (-1) 10 10 15 15 0,5 0,5 0,5 30 Cao (+1) 40 40 20 35 30 35 2 37 Trung tâm (0) 25 25 12,5 25 17,5 25 1,25 1,25 1,25 33,5 Mức ảnh hưởng Ảnh hưởng 0,01b 0,35a 0,87a 0,28a 0,41a 0,09b -0,18a -0,06b -0,27a -0,10b Prob>F g/L X1 0,762 g/L X2 0,007 g/L X3 0,001 g/L X4 0,011 g/L X5 0,005 g/L X6 0,083 g/L X7 0,026 g/L X8 0,177 g/L X9 0,012 C X10 0,075 vòng/ Tốc độ lắc X11 100 200 150 4,48a < 0,0001 phút Ghi chú: a khác biệt đáng kể α = 0,05; b không khác biệt đáng kể α = 0,05 -1, +1 mã hóa giá trị khảo sát tương ứng mức thấp, trung bình mức cao TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 47 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 2.3.2 Kiểm định yếu tố ảnh hưởng sau loại bỏ yếu tố không ảnh hưởng Sau trình sàng lọc 11 yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo sinh khối Bacillus S5, kết ghi nhận có yếu tố ảnh hưởng yếu tố không ảnh hưởng ảnh hưởng âm Thí nghiệm kiểm định nhằm đánh giá lại yếu tố có thật ảnh hưởng đến hàm mục tiêu (sinh khối Bacillus S5) sau loại bỏ yếu tố không ảnh hưởng Để tiết kiệm thời gian chi phí, kiểm định yếu tố thực qua thiết kế nhân tố phần (Fractional factorial designs) Thiết kế dựa vào chương trình “Design Expert® 7.0” Stat-Ease, Inc., Minneapolis USA (Bảng 5) Mỗi công thức thực lần lặp lại 2.4 Tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men phương pháp đáp ứng bề mặt với kiểu tâm phức hợp (RSM-CCD) Thí nghiệm PB sàng lọc yếu tố ảnh hưởng lớn đến sinh khối chủng khảo sát Sau đó, tiến hành thí nghiệm với ma trận thực nghiệm RSM-CCD tối ưu yếu tố với năm mức khảo sát (-α, -1, 0, +1, +α) α =2, số thí nghiệm tâm (0) thực lần lặp thiết kế 13 thí nghiệm dựa theo Castillo E Del (2007) Tính tốn, lập phương trình hồi quy, chọn điểm tối ưu yếu tố cho hàm đáp ứng mật độ OD550nm phần mềm Design expert 7.0® Atat-Ease Inc USA, từ áp dụng vào thực nghiệm Mỗi thí nghiệm ma trận bố trí lần lặp lại, thể tích mơi trường khảo sát 50 mL thời gian thu mẫu 48 Bảng Thiết kế thí nghiệm kết mật độ quang tối ưu kết hợp yếu tố khảo sát theo phương pháp thiết kế cấu trúc tâm (CCD) Các yếu tố tối ưu Thí nghiệm Bột đậu nành Cao nấm men Glucose (g/L) (g/L) (g/L) (X3) (X1) (X2) 28,5 [0]a 15 [0] 25 [0] a 45,5 [+α] 15 [0] 25 [0] 11,5 [-α] 15 [0] 25 [0] a a 20 [-1] 20 [+1] 15 [-1] 20 [-1] 20 [+1] 15 [-1] 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 20 [-1] 20 [+1] 35 [+1] 20 [-1] 20 [+1] 35 [+1] 28,5 [0] 25 [+α] 25 [0] 10 28,5 [0] [-α] 25 [0] 11 37 [+1] 10 [-1] 35 [+1] 12 37 [+1] 20 [+1] 35 [+1] 13 37 [+1] 20 [+1] 35 [+1] 14 37 [+1] 10 [-1] 15 [-1] 15 20 [-1] 10 [-1] 15 [-1] 16 20 [-1] 10 [-1] 35 [+1] 17 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 48 Tốc độ lắc (vòng/phút) (X4) 155 [-α]a 185 [0] 185 [0] 170 [-1] 200 [+1] 185 [0] 170 [-1] 200 [+1] 185 [0] 185 [0] 170 [-1] 200 [+1] 170 [-1] 170 [-1] 200 [+1] 200 [+1] 185 [0] Mật độ quang OD550nm 48 9,35 9,75 9,53 8,73 8,45 10,56 10,59 9,45 9,79 9,84 9,92 10,15 11,65 8,42 9,44 9,86 10,54 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 18 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,36 19 37 [+1] 20 [+1] 15 [-1] 170 [-1] 8,75 20 37 [+1] 10 [-1] 35 [+1] 200 [+1] 10,31 21 20 [-1] 10 [-1] 15 [-1] 170 [-1] 7,87 22 28,5 [0] 15 [0] 45 [+α] 185 [0] 9,93 23 37 [+1] 20 [+1] 15 [-1] 200 [+1] 8,52 24 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,65 25 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 215 [α] 9,66 26 28,5 [0] 15 [0] [-α] 185 [0] 7,15 27 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,68 28 20 [-1] 10 [-1] 35 [+1] 170 [-1] 9,70 29 37 [+1] 10 [-1] 15 [-1] 200 [+1] 9,55 30 28,5 [0] 15 [0] 25 [0] 185 [0] 10,56 a Ghi chú: số liệu mã hóa [+1], [-1], [0], [+α], [-α] tương ứng với mức cao, thấp, trung bình mức mở rộng biên cao thấp 2.5 Đánh giá khả lên men môi III KẾT QUẢ trường tối ưu môi trường dinh dưỡng 3.1 Sàng lọc đơn nguồn dinh dưỡng ảnh Thí nghiệm thực nhằm đánh giá phát triển Bacillus S5 môi trường tối ưu, môi trường Brain heart infusion broth (BHIB) and Nutrient broth (NB), Luria broth (LB) Một khuẩn lạc Bacillus S5 (sau 24 ủ đĩa thạch nutrient agar (NA) có bổ sung 1,5% NaCl) huyền phù vào erlen 250 ml có chứa 150 mL cơng thức mơi trường cần khảo sát Thí nghiệm lặp lại lần cho công thức môi trường thu dịch nuôi cấy đo OD550nm sáu kéo dài 48 khảo sát 2.6 Khảo sát thời điểm bổ sung khống kích thích tạo bào tử Dựa vào đường cong tăng trưởng Bacillus S5, bổ sung ion kim loại thời điểm khác nhau: đầu pha log, pha log, đầu pha ổn định pha ổn định (Vũ Thanh Thảo ctv., 2018) Các ion khảo sát bao gồm Fe2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+ bổ sung với nồng độ 0,5 g/L Số lượng bào tử S5 xác định theo phương pháp gia nhiệt mẫu đến 800C 15 phút trước làm mát trãi đĩa môi trường nutrient (NB) ủ 300C thời gian 48 hưởng đến sinh khối Bacillus S5 Chủng Bacillus S5 có khả tạo sinh khối cao đáng kể lên men nguồn cao nấm men (OD550nm thời điểm 48 tăng từ 7,0 đến 7,8 nồng độ cao nấm men tăng từ đến 15 g/L) Đối với pepton bột đậu nành mật độ S5 đạt giá trị OD550nm 7,0 pepton bột đậu nành nồng độ 15 g/L Trong đó, nguồn nitơ có nguồn gốc khác axit amin tổng hợp, nitơ vơ sinh khối S5 đạt giá trị thấp OD550nm nhỏ (Hình 1) Nguồn carbon khác ảnh hưởng đến mật độ trình lên men chủng S5 Trong số nguồn carbon trình bày Hình 1, lactose xem nguồn carbon hiệu cho trình lên men chủng Bacillus S5 Sinh khối S5 tăng cách đáng kể (p 0,05) ra, phânảnh tíchhưởng mức độ phùcông hợp thức mô Two sau khiứng loạivới bỏcác cácyếu yếutốtố hưởng Ngồi âm khơng đến mơi hìnhlevel) 0,0004 ảnhảnh hưởng hình thử nghiệm đạt p < 0,0001 giá trị (main effects), hưởng ảnhtrên hưởng củakhảo sát ba mức độ: mức độ thấp (-1), mức độ cao trường Mỗi yếu tố ảnh khơng tương thích (lack of fit) có p = 0,0509 yếu tố có ý nghĩa thống kê 0,05, nàynhiệt cho độ thấykhơng mơ hình quy phù (+1) mức độ trung tâm (0) thể Bảng> Nhưđiều vậy, ảnhhồi hưởng 3.2.2 Kiểm định yếu tố ảnh hưởng hợp giá trị vùng cực trị xa so với giá sàng lọc loại PBDbỏnên thí ảnh nghiệm chúng tơi trì nhiệt độ ủ mức 300C±20C, sau yếu tố không hưởng trị khảo sát Năm yếu dao tố kiểm định pH môi trường độngchọn tronglọc khoảng 7-7,5 lại thiết kế phần (Fractional factorial 50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng Kiểm định mức ảnh hưởng đến sinh khối Bacillus S5 yếu tố thiết kế phần (Fractional factorial Two level) Yếu tố Đơn vị Ký hiệu Mức khảo sát Thấp (-1) Ảnh hưởng Prob>F (p-value) Bột đậu nành g/L X2 10 40 25 0,51a Cao nấm men g/L X3 10 12,5 0,85a Glucose g/L X4 15 35 25 0,72a Lactose g/L X5 15 30 22,5 0,16b Tốc độ lắc vịng/phút X11 100 200 150 2,31a Mơ hình mẫu (significant) Sự khơng tương thích (not significant) R2 Ghi chú: a Có ý nghĩa độ tin cậy α=0,05; b Khơng có ý nghĩa độ tin cậy α=0,05 0,0003 < 0,0001 < 0,0001 0,1360 < 0,0001 < 0,0001 0,0509 0,982 3.3 Tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men phương pháp đáp ứng bề mặt với thiết kế cấu trúc tâm (RSM-CCD) Mật độ Bacillus S5 thiết kế thí nghiệm tối ưu dao động mức OD550nm từ 7,15 đến 11,65 sau loại bỏ yếu tố không ảnh hưởng Ngoài ra, qua đánh giá phù hợp có ý nghĩa mơ hình qua phân tích ANOVA (Bảng 5) cho thấy có ý nghĩa hệ số hồi quy kiểm định phân phối Fisher (F), với giá trị p < 0,05 cho biết hệ số hồi quy có ý nghĩa Như vậy, kết Bảng thể mơ hình bậc hồn tồn có ý nghĩa thống Cao (+1) Mức ảnh hưởng Trung tâm (0) kê với độ tin cậy 99,99% (pF 0,0018a < 0,0001a < 0,0001a < 0,0001a 0,0003a < 0,0001a < 0,0001a 0,0755b 51 Từ giá trị phân tích có ý nghĩa trên, giá trị hàm mong đợi phần mềm Expert Design 7.0 biểu diễn theo phương trình: Y (mật độ quang OD550nm) =10,56+0,15X 1+0,73X 3+0,1X 1X 3+0,18X 2X 30,40X2X4-0,27X3X4-0,21X12-0,17X22-0,49X320,25X42 Trong X1, X2, X3, X4 giá trị mã hóa hàm lượng bột đậu nành, cao nấm men, glucose, tốc độ lắc Mật độ quang OD 550nm VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 12 10 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 30h 36h 42h 48h Thời gian khảo sát Môi trường tối ưu LB BHI NB Từ kết kiểm tra thực nghiệm giá trị Hình Đường cong tăng trưởng Bacillus tối ưu cho biến khảo sát xácHình định2 Đường cong tăng trưởng Bacillus S5 môi trường nuôi cấy khác S5 môi trường nuôi cấy khác sau: bột đậu nành 34,9 g/L, cao nấm men 20 3.4.2 Khảo sát khả ảnh hưởng khống đến hình thành bào tử Bacillus S5 g/L, glucose 35 g/L tốc độ lắc 170 vòng/phút, 3.4.2 Khảo sát khả ảnh hưởng Theo9số liệu đường cong tăng Bacillus S5 bào tử môi trường tối ưu, m giá trị OD550nm 11,36 tương ướng 4,2x10 khống đếntrưởng hình thành CFU/mL S5chọn 12 giờ, 21 giờ, 30 giờ, 36 tương ứng với đầu pha tă thời điểm bổ sungBacillus khoáng 3.4 Khảo sát loại khoáng thời Theo số liệu đường cong tăng trưởng pha tăng trưởng, đầu pha ổn định pha ổn định điểm bổ sung khống kích thích tạotrưởng, bào tử Bacillus S5 mơi trường tối ưu, mốc Khả thời chuyển từ tếbổ bàosung dinh khoáng dưỡng sang bào chọn tử làchủng Bacillus S5 ảnh hưở điểm 12 giờ, 3.4.1 Đường cong tăng trưởng chủng 21 giờ, 30 giờ, 36 tương ứng với đầu pha Bacillus S5 môi trường tối ưu.đáng kể đến loại khoáng sử dụng thời điểm bổ sung loại khống Trong nghiệm thức Từ khuẩn lạc S5 ban đầu cho tăng trưởng, pha tăng trưởng, đầu pha ổn chứng (Bảng 6) cho thấy tỷ lệ tạo bào tử sau 48 nuôi cấy đạt giá trị thấp (33%) Trong vào môi trường khảo sát khác nhau, cho định pha ổn định 2+ từ Fe tế2+,bào dưỡng khả kích thích tạoKhả bào tửnăng cácchuyển ion kim loại Mn2+,dinh Ca2+, Mg có xu hướng tăng d thấy thời điểm 15 đầu nuôi cấy khác biệt mơi trường tối ưu sang bào tử chủng Bacillus S5 ảnh hưởng kích thích S5 giai đoạn từ pha tăng trưởng đến pha ổn định Tỷ lệ chuyển bào tử S5 môi trường thương mại LB, BHI, NB đáng kể đến loại khoáng sử dụng thời điểm nhấtđến (93,09%) có ýsung nghĩa loại khác khống biệt so vớiđó Trong ion kim nghiệm loại khác nghiệm thức đối thức đối chứng Tuy nhiên, sau thời điểm từ 15 48 bổ chứng (Bảng khảo sát mật độ S5 tăng dần sử dụngkhác ion Ca2+ bổ sung sau 30 giờ6)lêncho men.thấy tỷ lệ tạo bào tử sau biệt có ý nghĩa với ba mơi trường cịn lại 48 ni cấy đạt giá trị thấp (33%) Trong Tỷ lệ chuyển bào tửkhả củanăng chủng kích Bacillus S5 tạitạocácbào thời tử điểm khác đó, thích cácnhau bổ sung (p