Nghiên cứu sử dụng chitosan để thu nhận sinh khối vi tảo thalassiosira pseudonana và đánh giá khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu được

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- o0o --- HỒ THỊ KIM TRÂM NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHITOSAN ĐỂ THU NHẬN SINH KHỐI VI TẢO Thalassiosira pseudonana VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- o0o -

HỒ THỊ KIM TRÂM

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHITOSAN ĐỂ THU NHẬN

SINH KHỐI VI TẢO Thalassiosira pseudonana VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ

NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA SINH KHỐI VI TẢO THU ĐƯỢC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: TS NGUYỄN THẾ HÂN

KHÁNH HÒA -06/ 2015

Sau thời gian nghiên cứu tại phòng thí nghiệm trường Đại học Nha Trang, đến nay em đã hoàn thành công việc nghiên cứu của mình

Lòng biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi đến TS Nguyễn Thế Hân người đã tận

tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu

Em cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm, các thầy cô quản lí phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Lòng biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi đến gia đình đã nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập

Sau cùng em xin dành cho bạn bè lời cảm ơn vì đã chia sẻ, động viên và đã cùng đồng hành với em trong suốt thời gian học tại trường

Với kiến thức và tầm nhìn còn hạn chế cũng như bước đầu chưa có kinh nghiệm trong nghiên cứu, bài luận này không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong

sự chân thành góp ý và sửa chữa của thầy cô và toàn thể các bạn

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 6 năm 2015 Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Kim Trâm

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về vi tảo Thalassiosirapseudonana 6

1.1.1 Phân loại 6

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Thalassiosira pseudonana 6

1.1.3 Phân bố 7

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana 8

1.1.4.1 Protein 8

1.1.4.2 Lipit 8

1.1.4.3 Carbohydrate 9

1.1.4.4 Vitamin 9

1.1.4.5 Sắc tố 9

1.1.4.6 Chất chống oxy hóa 9

1.1.5 Ứng dụng của Thalassiosira pseudonana 10

1.1.5.1 Làm thức ăn cho động vật thủy sản 10

1.1.5.2 Dùng làm nhiên liệu sinh học 10

1.1.5.3 Làm dược phẩm 10

1.2 Tổng quan về chitosan 11

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan 11

1.2.1.1 Cấu trúc hóa học 11

1.2.1.2 Tính chất của chitosan 12

1.2.2 Ứng dụng của chitosan 13

1.2.3 Nguyên lí sử dụng chitosan thu sinh khối vi tảo và ứng dụng trong xử lý

nước thải 16

1.3 Một số phương pháp thu sinh khối vi tảo 17

1.3.1 Phương pháp lắng 17

1.3.2 Phương pháp ly tâm 17

1.3.3 Phương pháp lọc 18

1.3.4 Phương pháp keo tụ 18

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thu sinh khối vi tảo 20

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2.1 Vi tảo Thalassiosira pseudonana 22

2.2.2 Chitosan 22

2.3 Hóa chất 22

2.4 Dụng cụ và thiết bị 22

2.5 Phương pháp nghiên cứu 23

2.5.1 Xác định hàm lượng ẩm 23

2.5.2 Xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo 23

2.5.3 Xác định hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học 24

2.5.3.1 Chuẩn bị dịch chiết 24

2.5.3.2 Xác định hàm lượng carotenoid tổng số và chlorophyll 24

2.5.3.3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số 25

2.5.4 Xác định khả năng chống oxy hóa 25

2.5.4.1 Xác định khả năng khử gốc tự do DDPH 25

2.5.4.2 Xác định tổng năng lực khử 26

2.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

2.6.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 26

2.6.2 Xác định loại chitosan 27

2.6.3 Thí nghiệm xác định pH 28

2.6.4 Xác định nồng độ chitosan dùng để thu sinh khối vi tảo 29

2.6.5 Thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo 30

2.7 Phương pháp phân tích 31

2.7.1 Xác định hàm lượng ẩm trong tế bào vi tảo 31

2.7.2 Xác định hàm lượng carotenoid tổng số, hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b 31

2.7.3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số 33

2.7.4 Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH 34

2.7.5 Xác định tổng năng lực khử 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Kết quả xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana 37 3.1.1 Ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo 37

3.1.2 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo 40

3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối 44

3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian lắng đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo 48

3.2 Kết quả xác định hoạt tính sinh học của vi tảo Thalassiosira pseudonana 51 3.2.1 Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số, chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số 51

3.2.2 Khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu được bằng chitosan 52

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hàm lượng polyphenol tổng số, chlorophyll a, chlorophyll b và

carotenoid tổng số 52 Bảng 3.2 Giá trị EC50 của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan và vitamin C 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vi tảo Thalassiosira pseudonana 7

Hình 1.2 Cấu trúc của chitosan 11

Hình 2.1 Cách xác định chiều cao cột lắng 24

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại chitosan 27

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH 28

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chitosan 29

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo 30

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số 32

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số 33

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng khử gốc tự do DPPH 34

Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tổng năng lực khử 35

Hình 3.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi khi sử dụng 2 loại chitosan DD70 và DD85 38

Hình 3.2 Ảnh hưởng của loại chitosan đến Hiệu suất lắng và Hệ số lắng (A) và Tỉ lệ phần thể tích lắng (B) 39

Hình 3.3 Đánh giá hiệu suất thu hồi sinh khối ở những pH khác nhau 42

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến (A) Hiệu suất lắng và Hệ số lắng, (B) Tỉ lệ phần thể tích lắng 43

Hình 3.5 Hình ảnh sinh khối vi tảo thu bằng chitosan ở các nồng độ khác nhau 45

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất thu hồi vi tảo (A) Ảnh hưởng đến Hiệu suất lắng và Hệ số lắng, (B) Ảnh hưởng đến Tỉ lệ phần thể tích lắng 46

Hình 3.7 Đánh giá hiệu suất thu hồi sinh khối ở những thời gian khác nhau 49

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian lắng đến Hiệu suất lắng và Hệ số lắng (A) và Tỉ lệ phần thể tích lắng (B) 50

Hình 3.9 Khả năng chống oxy hóa (A) Tổng năng lực khử và (B) Khả năng khử gốc tự do DPPH của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan và vitamin C 55

PUFA : Các axit béo chưa no

EPA : Axit Eicosapentaenoic

ARA : Axit Arachidonic

DHA : Axit Docosahexaenoic

DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

PUFA : Polyunsaturated fatty acid

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vi tảo là loài sinh vật đơn bào, thường được tìm thấy ở vùng biển nước mặn

và nước ngọt với các kích thước khác nhau, từ vài đến vài trăm micromet Vi tảo có khả năng nuôi sinh khối lớn, dễ tiêu hóa và có hàm lượng dinh dưỡng cao Nhờ những tính chất này mà vi tảo được xem như một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho động vật nuôi Vi tảo được sử dụng là nguồn thức ăn quan trọng cho tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thân mềm 2 mảnh vỏ như: hầu, vẹm, điệp, sò, ngao Chúng còn là thức ăn cho ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá, ốc và động vật phù du Đến nay, có khoảng trên 40 loài tảo đã được phân lập, nuôi cấy và sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng các loài thủy sản Một số loài tảo được nuôi và sử dụng phổ biến trên thế giới

là: Thalasiossira pseudonana, Skeletonema, Chaaaetoceros calcitrans, Chaetoceros

mulleri, Nannochloropsis ocula, Chlorella minutissima, Tại Việt Nam, loài vi tảo Thalassiosira sp được nuôi để làm nguồn thức ăn cho tôm thẻ chân trắng

Bên cạnh làm thức ăn cho động vật thủy sản, vi tảo còn được xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng để chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học cần thiết cho sức khỏe con người Một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi tảo đã được chiết rút bao gồm: các axit béo không no (như EPA và DHA), chất màu (như chlorophyll và carotenoid), các chất có khả năng chống oxy hóa, các chất có khả năng kháng virus, các chất có khả năng kháng viêm,… (Raposo và cộng sự, 2013) Nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng từ vi tảo đã được thương mại hóa

Vi tảo còn được coi là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất dầu diesel sinh học, có thể hoàn toàn thay thế diesel hóa thạch trong tương lai, với sản lượng dầu cao hơn đến 10-20 lần so với các loài thực vật trên cạn (Kaewkannetra và cộng

sự, 2012)

Trong những năm gần đây, nghiên cứu sản xuất dầu diesel sinh học từ vi tảo được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Tảo sản xuất dầu ngay trong

tế bào khi quang hợp với thành phần dầu lên đến 80% khối lượng khô Dầu tảo có khả năng chuyển đổi thành dầu mỏ nhân tạo hoặc nhiên liệu sinh học sạch và tốt hơn hẳn các loại xăng dầu hiện có Theo tiêu chuẩn đánh giá của American Society for Testing Material (ASTM), dầu từ tảo có thuộc tính tương tự các loại dầu thô tiêu chuẩn, nhưng an toàn hơn nhờ nhiệt độ phát cháy cao hơn, ít độc hại, không gây hiệu ứng nhà kính, có thể sử dụng trực tiếp cho động cơ diesel hoặc pha trộn với các loại dầu có nguồn gốc khác theo tỷ lệ khác nhau Các nhà khoa học đã chứng minh, tảo giúp giảm đến 70-90% vấn đề ô nhiễm môi trường Quá trình chuyển hóa năng lượng trong tảo hấp thụ một lượng lớn CO2 Mỗi kg sinh khối tảo tiêu thụ 1,8 kg

CO2 trong quá trình quang hợp Có thể thấy, dầu tảo là khám phá có ý nghĩa vô cùng to lớn bởi thế giới vẫn đang nỗ lực tìm giải pháp thay thế cho các nguồn nhiên liệu hóa thạch (Minh Thảo, 2014)

Để sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản, sinh khối vi tảo cùng với môi trường nuôi cấy được cung cấp trực tiếp vào ao nuôi Điều này dẫn đến nhiều bất cập Thứ nhất, việc vận chuyển hoặc bơm trực tiếp môi trường nuôi chứa sinh khối

vi tảo đến ao nuôi làm tăng chi phí sản xuất, hiệu quả sử dụng thấp Thứ hai, trong môi trường nuôi, có thể chứa một số thành phần không có lợi cho sức khỏe của động vật thủy sản, đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng Để sản xuất nhiên liệu sinh học

từ vi tảo, hầu hết các phương pháp đòi hỏi phải thu sinh khối, sau đó sấy khô và ép/chiết Như vậy, sinh khối vi tảo cần được thu trước khi sử dụng vi tảo làm thức

ăn cho động vật thủy sản, thực phẩm cho con người, cũng như sản xuất nhiên liệu sinh học

Tuy nhiên việc tách sinh khối vi tảo ra khỏi môi trường nuôi là một thách thức lớn về công nghệ và kinh tế Phần lớn các loài vi tảo có kích thước tế bào nhỏ

từ 1-30 m và nồng độ sinh khối trong môi trường nước nuôi thấp từ 0,5-2,0 g/L tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy Hiện nay, một số phương pháp đã được sử dụng để tách sinh khối vi tảo như: lắng, lọc, ly tâm và sử dụng chất trợ lắng

Phương pháp ly tâm có thể sử dụng thể thu sinh khối của nhiều loài vi tảo khác nhau Tuy nhiên, phương pháp này có chi phí năng lượng cao, làm tăng chi phí sản xuất Norsker và cộng sự (2011) đã ước tính phương pháp ly tâm có chi phí năng lượng đầu vào tương đương với khoảng 50% chi phí năng lượng trong quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi tảo Chisti (2007) cũng ước tính rằng chi phí của quá trình thu sinh khối vi tảo để sản xuất dầu diesel chiếm khoảng 50% chi phí sản xuất Một nhược điểm khác của phương pháp ly tâm là đòi hỏi nhiều thời gian (Grima và cộng sự, 2003) Lắng, lọc cũng là phương pháp đã được sử dụng để thu sinh khối vi tảo Tuy nhiên, cũng giống như phương pháp ly tâm, phương pháp này có chi phí cao Ngoài ra, nhược điểm lớn nhất của phương pháp lắng lọc đó là nó chỉ thích hợp

để thu các loài vi tảo có kích thước lớn như Spirulina (de Godos và cộng sự, 2011)

Sử dụng các chất trợ lắng được cho là phương pháp có hiệu quả cao trong việc thu sinh khối vi tảo với chi phí vừa phải (de Godos và cộng sự, 2011) Dựa vào đặc tính hóa học, người ta chia các chất trợ lắng thành hai loại: chất trợ lắng vô cơ

và chất trợ lắng hữu cơ/đa điện phân (polyelectrolyte) Các muối kim loại như ferric chloride (FeCl3), aluminum sulfate (Al2(SO4)3) và ferric sulfate (Fe2(SO4)3) là những chất trợ lắng vô cơ được sử dụng phổ biến Tuy nhiên, các muối kim loại này có giá thành cao Khi sử dụng để thu vi tảo chúng tạo thành một lớp cặn trong môi trường nuôi cấy và sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình phát triển sinh khối vi tảo Môi trường nuôi muốn tái sử dụng phải loại bỏ những cation kim loại này Ngoài ra, các muối ion kim loại còn được chứng minh ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người và động vật sử dụng chúng (Huang và cộng sự, 2000) và làm giảm pH của môi trường đáng

kể

Chitosan là một polyme sinh học, thân thiện với môi trường, an toàn cho người sử dụng Chitosan có nhiều ứng dụng trong ngành dược phẩm và thực phẩm Gần đây, chitosan cũng được sử dụng để làm chất trợ lắng trong xử lý nước thải do

có khối lượng phân tử lớn và mật độ điện tích cao Chitosan có các nhóm mang điện tích dương (NH3

+

và NH2) có khả năng hấp thu những vi sinh vật tích điện âm, trong đó có vi tảo Với những đặc điểm này, chitosan được xem là chất trợ lắng

tiềm năng có thể sử dụng để thu sinh khối vi tảo, giúp giảm chi phí và nâng cao chất lượng của sinh khối thu được Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo: Xu và cộng sự (2012) đã dùng chitosan để thu sinh

khối Chlorella sorokiniana, Farid và cộng sự (2012) đã dùng nano-chitosan để thu sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp… Tuy nhiên cho tới nay chưa có bất cứ công

trình nghiên cứu nào công bố về việc sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo

Thlassiosira pseudonana T pseudonana là một loại vi tảo được nuôi nhiều tại Việt

Nam để dùng làm thức ăn cho tôm ở giai đoạn ấu trùng Hàm lượng một số chất dinh dưỡng cơ bản trong loài vi tảo này đã được công bố, tuy nhiên dữ liệu về các hoạt chất sinh học như các hợp chất polyphenol, chlorophyll, carotenoid và khả năng chống oxy hóa trong loài vi tảo này vẫn còn rất hạn chế

Xuất phát từ những lý do trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng

chitosan để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana và đánh giá khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu được”

(1) Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira

pseudonana bằng chitosan;

(2) Xác định hàm lượng polyphenol, carotenoid, chlorophyll và đánh giá hoạt

tính chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu

được bằng chitosan

3 Nội dung nghiên cứu

Ðể thực hiện các mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài thực hiện những nội dung sau đây:

Mục tiêu 1: Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận sinh khối vi tảo

Thalassiosira pseudonana bằng chitosan

1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối;

1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối;

1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan;

1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lắng

Mục tiêu 2: Xác định hàm lượng polyphenol, carotenoid, chlorophyll và đánh

giá hoạt tính chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana

thu được bằng chitosan

năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo sẽ giúp giảm chi phí và nâng cao chất lượng sinh khối, do đó đề tài thành công sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của cơ sở nuôi thủy sản sử dụng loài vi tảo này làm thức ăn, nâng cao giá trị kinh tế

cho loài vi tảo Thalassiosira pseudonana;

- Kết quả của đề tài cũng là cơ sở để sản xuất một số sản phẩm thực phẩm

chức năng (nước uống, viên nang) từ sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Vi tảo (microalgae) là tất cả các tảo có kích thước hiển vi, là thành phần chủ yếu tạo nên năng suất sơ cấp của thủy vực và giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự phát triển của hệ sinh thái nước (Dương Đức Tiến, 2006) Muốn quan sát chúng phải sử dụng tới kính hiển vi Trong số khoảng 50.000 loài tảo trên thế giới thì vi tảo chiếm đến khoảng 2/3

1.1 Tổng quan về vi tảo Thalassiosira pseudonana

Loài: Thalassiosira pseudonana

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Thalassiosira pseudonana

Thalassiosira pseudonana là một loại tảo khuê có dạng hình hộp, rất mỏng,

có kích thước trung bình từ 6-20 x 8-15 µm (vào mùa đông kích thước lớn hơn vào mùa hè) Mặt vỏ hình chữ nhật và đường kính dài hơn trục vỏ tế bào Đai vỏ không đều, mép đai có 2-28 mấu nhỏ, một mấu có dạng hình môi để liên kết với tế bào bên cạnh Thường thì chỉ có duy nhất một gai ở mép và ở trung tâm Gai ở mép có thể

dễ dàng nhìn thấy được khi quan sát trên kính hiển vi Bề mặt của màng tế bào tảo tròn nhiều vằn, sọc Các vằn, sọc này có thể thẳng hoặc ngoằn ngoèo, mật độ vằn

sọc khoảng 10-20 vằn sọc/10 µm Tế bào Thalassiosira pseudonana chỉ có một nhân, hình cầu Thalassiosira pseudonana thường sống đơn độc, đôi khi liên kết với

nhau thành tập đoàn (dạng bản) Có hai hình thức: các tế bào tập hợp với nhau thành từng nhóm hoặc mắt xích giữa các tế bào (dạng chuỗi) Nếu nó kết hợp với

nhau thành từng nhóm thì được liên kết với nhau bằng sợi kitin nhỏ, còn ở dạng chuỗi các tế bào xoắn chuỗi với nhau qua bề mặt màng tế bào Màu của tảo

Thalassiosira pseudonana thay đổi từ màu nâu đến màu xanh hoặc màu vàng tùy

thuộc vào số lượng của diệp lục Tuy nhiên, màu sắc này thay đổi không ảnh

hưởng đến chất lượng của tảo Thể sắc tố của tảo Thalassiosira pseudonana nhỏ,

nhiều và có hình hạt (Hình 1.1)

Thalassiosira pseudonana là loại tảo giàu dinh dưỡng, đặc biệt là các axit

béo không no, carbohydrate, protein… cộng với kích thước siêu vi của nó nên rất phù hợp với các trại sản xuất cá biển (làm thức ăn cho copepoda), các trại sản xuất nhuyễn thể (trong giai đoạn nhuyễn thể có kích thước 200 µm trở lên) và các trại sản xuất tôm giống từ giai đoạn mysis đến giai đoạn postlarvae Nó làm tăng tỷ lệ sống và khả năng tăng trưởng của các đối tượng trên

1.1.3 Phân bố

Hình 1.1 Vi tảo Thalassiosira pseudonana

Tảo silic phân bố rất rộng trong môi trường nước mặn, lợ, ngọt Cũng gặp trên đất đá, trong các thủy vực chúng có thể sống trôi nổi hoặc ở đáy Số lượng loài

ở đáy nhiều hơn nhưng số lượng cá thể và sinh khối lại ít hơn so với các loài sống trôi nổi Ở các biển lạnh tảo silic phân bố nhiều hơn biển ấm Trong những hồ nước ngọt trong suốt chúng có thể phân bố ở độ sâu 50-60m còn trong nước biển khoảng

100-350m Riêng tảo Thalassiosira pseudonana thường sống trong môi trường

nước mặn Chúng được nuôi để làm thức ăn cho nhiều ấu trùng động vật hải sản sống đáy như bào ngư, ốc hương

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana

Protein, lipit, carbohydrate là những thành phần chủ yếu cấu tạo nên tế bào vi tảo Những chất này chiếm 90-95% khối lượng khô tế bào, 5-10% khối lượng chất khô còn lại bao gồm các vitamin, sắc tố, các chất chống oxy hóa… Thành phần dinh

dưỡng của vi tảo Thalassiosira pseudonana biến đổi theo thời gian sinh trưởng và

điều kiện nuôi trồng

1.1.4.1 Protein

Hàm lượng protein trong mỗi tế bào vi tảo được coi là một trong những yếu tố quyết định giá trị dinh dưỡng của vi tảo Theo một nghiên cứu của Brown và cộng sự (1997), trong tảo đơn bào hàm lượng protein dao động từ 6-52%; carbohydrate từ 5- 23% và lipit từ 7-23% khối lượng chất khô Cũng theo Volkman và cộng sự (1989),

hàm lượng protein tổng số ở vi tảo Thalassiosira pseudonana là 17,8%

Vi tảo được coi là có giá trị dinh dưỡng tốt cho các đối tượng nuôi nếu hàm lượng PUFA (DHA, EPA) dao động từ 1-20 mg/ml tế bào (Thinh, 1999) Theo một nghiên cứu của Brown và cộng sự (1989), hàm lượng axit béo không no (EPA +

DHA) của Thalassiosira pseudonana là 7,2 mg/ml tế bào Tuy hàm lượng này thấp hơn so với Chaetoceros calcitrans (17,8 mg/ml tế bào) và Pavlova lutheri (10,1

mg/ml tế bào), nhưng Thalassiosira sp vẫn là nguồn thức ăn tự nhiên giàu dinh

dưỡng cho ngành nuôi trồng thủy sản

1.1.4.3 Carbohydrate

Theo Brown và cộng sự (1991), hàm lượng hydrocarbon của các loài tảo khá

cao, dao động 5-23% khối lượng khô tế bào Ở tảo Thalassiosira, hàm lượng

hydrocarbon chiếm 7,8% khối lượng chất khô Hydrocarbon ở tảo tồn tại chủ yếu ở các dạng đường glucose, galactose, mantose, ribose và các polysaccharide khác Trong đó, glucose chiếm hàm lượng cao nhất, dao động 21-87%, tiếp theo là galactose, mantose và ribose

1.1.4.4 Vitamin

Vi tảo là nguồn cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tượng thủy sản nuôi Vi tảo giàu nguồn vitamin và khoáng chất, điều này giúp chúng được ứng dụng như

một chất dinh dưỡng bổ sung vào thực phẩm Một số loài Chlorella chứa nhiều

vitamin hơn hầu hết các loài thực vật trên cạn (Blazencic, 2007) Những loại vitamin chính thường gặp trong tảo nuôi gồm: Thiamin (B1), Riboflavin (B2), Pyridoxin (B6), Cyanocobalamin (B12), axit Ascorbic (C), axit Nicotinic (B3), axit Pantothenic (B5), Tocopherol (E), Caroten (Provitamin A), Choline

1.1.4.5 Sắc tố

Chlorophyll xanh lục và carotenoid vàng, đỏ, cam là những chất màu chủ yếu trong các loài tảo Mỗi loài tảo có chứa từ 5-10 loại carotenoid khác nhau Chlorophyll a là thành phần sắc tố quang hợp chính trong các loài tảo, ngoài ra còn

có chlorophyll b và chlorophyll c Trong tế bào tảo, carotenoid đóng vai trò như sắc

tố bổ trợ quang hợp và là tác nhân bảo vệ tế bào tảo tránh khỏi tác hại của cường độ ánh sáng quá cao

1.1.4.6 Chất chống oxy hóa

Nhiều hợp chất chống oxy hóa được tìm thấy trong các loài vi tảo như các hợp chất polyphenol, các phycobiliprotein và các vitamin (Plaza và cộng sự, 2008) Phenolics, flavonoids, astaxanthin, anthocyanins, carotenoids, chlorophyll, vitamin

E, vitamin C… là những hợp chất chống oxy hóa được tìm thấy trong vi tảo Với

thành phần chất chống oxy hóa đa dạng, nhiều loại vi tảo đã được ứng dụng trong thực phẩm chức năng, mỹ phẩm để ngăn ngừa sự lão hóa

1.1.5 Ứng dụng của Thalassiosira pseudonana

1.1.5.1 Làm thức ăn cho động vật thủy sản

Vi tảo đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản để làm thức

ăn cho nhiều loài thủy sản như nhuyễn thể 2 mảnh vỏ, các loài cá, tôm, mực ở giai đoạn ấu trùng (Brown, 2002) Mặc dù có hàng trăm loài tảo được nghiên cứu để ứng dụng làm thức ăn nhưng chỉ có rất ít loài được sử dụng cho ngành nuôi trồng, trong đó

có loài Thalassiosira (Brown và cộng sự, 1996; Spolaore và cộng sự, 2006)

Với những đặc tính ưu việt không gây ô nhiễm môi trường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt chứa rất nhiều loại axit béo không no,

tảo Thalassiosira pseudonana nói riêng và tảo đơn đơn bào nói chung ngày càng

được ứng dụng rộng rãi để làm thức ăn trong ngành nuôi trồng thủy sản

1.1.5.2 Dùng làm nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học là một nguồn năng lượng sạch và thân thiện với môi trường Việc sử dụng nhiên liệu sinh học sẽ hạn chế được hiện tượng hiệu ứng nhà kính và sự nóng lên của Trái đất Hiện nay, sử dụng nhiên liệu sinh học thay thế cho các loại nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng được quan tâm và ứng dụng, đặc biệt

là ở những nước có nền kinh tế phát triển

Nhiên liệu sinh học được sản xuất bằng phản ứng chuyển hóa este từ dầu của nhiều loại cây trồng như hướng dương, đậu nành, cọ và tảo Vi tảo đã được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất nhiên liệu nhờ vào khả năng quang hợp cao, sinh khối lớn, khả năng phát triển nhanh (Miao và cộng sự, 2004) và đặc biệt vi tảo cho sản lượng dầu cao hơn 10-20 lần so với các loài thực vật trên cạn (Kaewkannetra và cộng sự, 2012) Lipit trong vi tảo có khả năng được chuyển đổi thành dầu diesel sinh học, carbohydrate được chuyển thành ethanol và H2, protein được biến đổi thành dạng nguyên liệu thô cho công nghệ phân bón sinh học (Raja và cộng sự, 2013)

1.1.5.3 Làm dược phẩm

Vi tảo giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học nên có thể được dùng để phát triển dược phẩm và thực phẩm chức năng Tảo silic đã được ứng dụng trong thuốc kháng viêm (Dolatabadi và de la Guardia, 2011; Gordon và cộng sự, 2009; Losic và cộng sự, 2010; Nassif and Livage, 2011)

1.2 Tổng quan về chitosan

Chitin/chitosan là một polyme sinh học được chiết rút từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau: phế liệu thủy sản, vi nấm, vi khuẩn Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin/chitosan là từ phế liệu thủy sản: tôm cua, nang mực… mỗi nguồn nguyên liệu khác nhau sẽ cho hàm lượng chitin cũng như tính chất của chitosan khác nhau Hình 1.3 mô tả quy trình tổng quát quá trình sản xuất chitosan

Hình 1.2 Cấu trúc của chitosan

Công thức phân tử: (C6H11O4N)n

Trong đó: n nằm trong khoảng 700 ÷ 4.500 (đôi khi đến 6.000)

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Do chitosan được điều chế từ quá trình khử acetyl hóa chitin nên khối lượng biểu kiến của nó tùy thuộc vào giá trị của n, phần trăm nhóm acetyl và cả điều kiện

Hình 1.3 Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất chitin, chitosan từ phế liệu

thủy sản 1.2.1.2 Tính chất của chitosan

Chitosan là một polymer hữu cơ, có nhiều trong vỏ các loại giáp xác Ðây là polyme hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được ước tính 100 tỉ tấn/năm Chitosan đã được nghiên cứu và ứng dụng khá nhiều, nhất là vào khoảng thời gian

từ 1975-1985 Nó có những đặc tính ưu việt mà các polyme tổng hợp khác không có như: khả năng phân huỷ, dễ tương thích, không độc hại và các đặc tính lý học, sinh

Tẩy màu

Chitin

học như: khả năng tạo gel, liên kết với các chất màu, lipit, protein và khả năng kháng khuẩn (Knorr, 1983; Hirano,1996; Ng 2000)

Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các axit hữu cơ thông thường như axit formic, axit acetic, axit citric, axit lacic Khi hòa tan chitosan trong môi trường axit loãng chitosan tồn tại ở dạng điện tích (+) nên có những đặc tính khác biệt với các polysaccharide khác thường vốn ở dạng trung tính hoặc ở điện tích âm Chitosan dương tính có khả năng kết hợp với các chất rắn hữu cơ hay bề mặt tế bào, là những chất có ion âm Ðây là cơ sở để ứng dụng chitosan trong việc kết hợp với các chất béo để chế tạo sản phẩm làm giảm cân, băng dán mỹ phẩm vào da hay tóc và kết hợp với kim loại nặng và hoá chất màu

Các tính chất của chitosan như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, khả năng tạo màng… phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa Chitosan có độ deacetyl cao thì

có khả năng hấp phụ chất màu, kim loại cũng như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, tạo màng cao hơn so với các mẫu chitosan có độ deacetyl thấp hơn Ngoài các tính chất trên thì chitosan còn có khả năng chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan Chitosan có độ nhớt thấp thì khả năng chống oxy hóa cao

Ứng dụng tạo màng của chitosan trong bảo quản rau, quả

Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt Màng chitosan là một màng bán thấm, do đó nó có khả năng làm thay đổi thành phần các chất khí trong môi trường

bảo quản Với một nồng độ phù hợp, màng chitosan sẽ tạo ra rào cản, ngăn không cho oxy tiếp xúc với bề mặt rau quả nên sẽ hạn chế được quá trình biến nâu của

giúp hạn chế quá trình tổn thất chất khô Hơn nữa, do màng chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm nên sẽ giảm hiện tượng hư hỏng do vi sinh vật, kéo dài thời gian bảo quản của rau quả

Ứng dụng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan trong quá trình chế biến, bảo quản thịt, cá

Thịt và các sản phẩm từ thịt rất giàu protein và lipit nên rất dễ bị hư hỏng do

vi sinh vật và quá trình oxy hóa lipit trong quá trình bảo quản Chitosan có tính kháng khuẩn và hạn chế quá trình oxy hóa lipit nên được dùng để bảo quản thịt nhằm hạn chế quá trình hư hỏng của thịt (Kamil và cộng sự, 2002; No và cộng sự, 2002)

Với khả năng chống oxy hóa, tạo màng, kháng khuẩn, chitosan được sử dụng trong quá trình chế biến và bảo quản các loại cá có chứa nhiều mỡ như cá tra, cá trích… đặc biệt là các sản phẩm ở dạng fillet Khả năng chống oxy hóa lipit nhờ vào khả năng tạo phức với sắt trong thịt cá và khả năng ngăn cản oxy tiếp xúc với bề mặt cá Jeon và cộng sự (2002) cho rằng cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể

là do hoạt tính tạo phức với các ion kim loại hoặc do chitosan kết hợp với lipit

Ứng dụng chitosan trong công nghiệp sản xuất nước quả trong

Trong công nghiệp sản xuất nước quả trong, làm trong là công đoạn quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng của thành phẩm Chitosan với đặc tính là một keo dương trong dung dịch axit loãng, sẽ thể hiện khả năng keo tụ, tạo bông khi kết hợp với các hợp chất phenol, chất keo và các chất lơ lửng còn lại trong nước quả, làm độ trong của nước quả tăng lên Chitosan có ái lực tốt đối với các hợp chất polyphenol như catechin, proanthocyanidin, axit cinnamic, và các dẫn xuất của chúng (Perlata

và cộng sự, 1989) Ngoài ra, khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan cũng được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả để ức chế hoạt động gây hư hỏng của nấm men, nấm mốc Chitosan sử dụng ở nồng độ 0,3 g/L nước quả có khả

năng ức chế hoàn toàn nấm mốc trong nước táo sau 13 ngày bảo quản (Roller và Covill, 1999; Rhoaades và Roller, 2000)

Ứng dụng khả năng tạo gel của chitosan trong chế biến thực phẩm

Nhờ vào đặc tính kháng khuẩn và tạo gel mà chitosan được ứng dụng trong quá trình sản xuất đậu phụ để tăng độ bền gel và kéo dài thời gian bảo quản Bổ sung 2% chitosan đã làm tăng độ bền gel của đậu phụ (No và Mayers, 2004) Đậu phụ sử dụng chitosan có thể kéo dài thời gian sử dụng hơn 3 ngày so với đậu phụ sử

dai cho thực phẩm thay thế cho hàn the

Ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để tăng cường sự hoạt động của các vi sinh vật trong đất, bọc các hạt giống nhằm ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất và tăng khả năng nảy mầm của hạt, kích thích hệ miễn dịch, kích thích sinh trưởng và tăng năng suất thu hoạch

Mục đích sử dụng chitosan bọc hạt giống để chống nấm và kích thích nảy mầm đã được thử nghiệm với lúa, đậu nành và nhiều loại hạt giống khác (Agarwal

và Sinclair, 1997; Goulart và cộng sự, 2002) Sau 6 tháng bảo quản, tỉ lệ nảy mầm của các hạt được bọc chitosan cao nhất, đạt 74% so với tỉ lệ nảy mầm của các hạt lúc ban đầu là 90-92% (Sawatwanich và cộng sự, 2007)

Chitosan cũng được nghiên cứu thử nghiệm phun lên rau cải (Brassica

campestris spp.) cho năng suất thu hoạch cải tăng lên (Wongroung và cộng sự,

2002) Ðồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên

tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lý-sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp, kết quả cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục tổng số và hàm lượng nitơ, đồng thời các enzyme như amylase, catalase, peroxidase cũng tăng lên và chitosan còn góp phần cải tạo đất khô cằn, bạc màu, giữ ẩm cho cây trồng

Trong thủy sản

Chitosan được nghiên cứu ứng dụng nhiều nhiều trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Chitin và chitosan được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá để kích thích sinh trưởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trường ao nuôi (Anderson và Siwicki, 1994; Wanichpongpan và Chandrkrachang, 2002) Ngoài ra, chitosan cũng được ứng dụng làm màng bao, chất kết dính để tăng độ ổn định của thức ăn tôm trong ao nuôi (Trung và Phượng, 2005; Phượng và cộng sự, 2008) Việc nghiên cứu

sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo làm thức ăn cho ngành nuôi trồng thủy sản cũng được nghiên cứu và ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới

Trong y học

Chitosan đã được ứng dụng trong y học như: chỉ khâu tự tiêu, chất đông máu, làm lành vết thương, da nhân tạo và một số ứng dụng còn đang nghiên cứu như: tác động kích thích miễn dịch chống sự phát triển khối u, đặc tính làm giảm cholesterol, hay nghiên cứu làm thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng… Ngoài

ra chitosan còn được dùng để cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae để lên men,

được bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy, thay hồ tinh bột để hồ vải giúp sợi bền mịn, bóng đẹp, cố định hình in, kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm

Trong công nghiệp xử lý nước thải

Chitosan được ứng dụng để loại bỏ các ion kim loại nặng trong nước thải như đồng, chì, thủy ngân, crôm nhờ các nhóm amin của chitosan có ái lực mạnh và

có khả năng tạo phức với các ion kim loại nặng (Knorr, 1983; Kurita và cộng sự, 1986; Kim và cộng sự, 1997; Varma và cộng sự, 2004)

Trong ngành chế biến thủy sản, xử lí nước thải là một vấn đề cấp thiết Tận dụng khả năng tạo kết tủa, tạo bông tốt của chitosan để tận thu protein từ dịch thải máu cá, nước rửa surimi… nhằm sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng và giảm bớt chi phí xử lí nước thải Ngoài ra, chitosan còn được sử dụng để xử lý chất màu của nước thải từ các nhà máy dệt may nhờ vào khả năng hấp thụ chất màu

1.2.3 Nguyên lý sử dụng chitosan thu sinh khối vi tảo và ứng dụng trong xử

lý nước thải

Các chất hữu cơ trong nước thải cũng như tế bào vi tảo trong môi trường nuôi thường tồn tại ở dạng keo và bền Chitosan là một polyme dương tự nhiên, trên

+

Các chất hữu cơ nói chung và vi tảo là những phần tử mang điện âm Ứng dụng chitosan trong công nghiệp xử lí nước thải và thu sinh khối vi tảo dựa vào lực tương tác tĩnh điện giữa phân tử chitosan và các hợp chất hữu cơ mang điện âm Khi chitosan tiếp xúc với các chất hữu cơ tích điện âm sẽ tạo thành những khối có kích thước lớn hơn và lắng xuống nhờ trọng lực

1.3 Một số phương pháp thu sinh khối vi tảo

Hiện nay sinh khối vi tảo có thể được thu hoạch bằng một số phương pháp như: lắng, ly tâm, lọc và sử dụng chất keo tụ (trợ lắng), hoặc kết hợp của những phương pháp này

1.3.1 Phương pháp lắng

Trong phương pháp lắng, lực hấp dẫn khiến các hạt chất lỏng hoặc rắn tách

từ chất lỏng có mật độ khác nhau, nhưng quá trình này có thể rất chậm, nhất là khi

sự khác biệt mật độ hoặc kích thước hạt nhỏ (Heaven, 2013) Việc làm lắng đọng vi tảo là khác nhau giữa các loài, nhưng cũng có thể biến đổi trong cùng một loài Mức lắng đọng có thể phụ thuộc vào cường độ ánh sáng (Waite và cộng sự, 1992) Theo Bienfang (1981), sự thiếu hụt về dinh dưỡng có thể làm giảm tỷ lệ lắng tụ Quá trình lắng còn ảnh hưởng bởi độ tuổi của tế bào, tỉ lệ tế bào lắng sẽ tăng lên đối với các tế bào già đặc biệt là tế bào lão hóa (Smayda, 1970) Tốc độ lắng của vi tảo có kích thước nhỏ trong khoảng 4-5 m trong là không đáng kể (Waite và cộng sự, 1992) Mặc dù có một số ưu điểm, nhưng tới nay phương pháp lắng chưa được sử dụng rộng rãi để thu vi tảo (Uduman và cộng sự, 2010)

1.3.2 Phương pháp ly tâm

Phương pháp ly tâm có thể sử dụng để thu hầu hết các loài vi tảo (Mohn, 1988) Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là có chi phí cao Gudin và Thepenier (1986) ước tính rằng chi phí của quá trình phục hồi có thể chiếm từ 20-30% tổng chi phí sản xuất sinh khối Chisti (2007) báo cáo rằng chi phí của quá trình thu sinh khối vi tảo chiếm tới 50% chi phí cuối cùng của sản xuất dầu

diesel Hơn nữa, Norsker và cộng sự (2011) tính toán rằng phương pháp ly tâm đòi hỏi một năng lượng đầu vào tương đương với khoảng 50% năng lượng có sẵn trong sinh khối vi tảo thu được Ngoài ra, quá trình ly tâm có thể gây vỡ tế bào làm ảnh hưởng đến chất lượng của sinh khối vi tảo thu được

1.3.3 Phương pháp lọc

Nhiều loại bộ lọc đã được sử dụng để thu hoạch tảo và phương pháp lọc đã được phát hiện thỏa đáng việc khôi phục tế bào tảo tương đối lớn (Molina Grima và cộng sự, 2003); nhưng cũng có thể bị cản trở bởi băng thông thấp và tắc nghẽn nhanh chóng (Mohn, 1988; Oswald, 1988) Mặc dù có một loạt các thiết kế bộ lọc,

bộ lọc màng có thể được chỉ đơn giản là phân loại theo các lỗ hoặc lớp màng kích thước; lọc vĩ mô > 10 m, vi lọc 0,1-10,0 m, siêu lọc 0,02-0,20 m và thẩm thấu ngược < 0,001 m Và do đó áp lực để buộc chất lỏng thông qua một lớp màng, năng lượng hoạt động cần thiết, thường sẽ tăng lên cùng với việc giảm kích thước lỗ màng, vì phạm vi kích thước của vi tảo thường là giữa 2 và 30 m (Brennan và Owende, 2010; Molina Grima và cộng sự, 2003) Phương pháp siêu lọc là một lựa chọn tốt cho sự phục hồi, đặc biệt là các tế bào rất mỏng manh, nhưng vẫn chưa được sử dụng đối với vi tảo (Mata và cộng sự 2010; Molina Grima và cộng sự, 2003), chi phí vận hành và phí bảo trì rất cao (Mata và cộng sự, 2010) Chất hữu cơ ngoại bào được ghi nhận là dẫn đến tắc nghẽn nhanh chóng của các màng siêu lọc

trong phương pháp lọc của Spirulina (Rossi và cộng sự, 2004)

1.3.4 Phương pháp keo tụ

Phương pháp keo tụ thường được sử dụng cùng với các phương pháp thu hoạch khác (Brennan và Owende, 2010) Trong phương pháp này, các tế bào tảo kết hợp với nhau làm tăng kích thước, qua đó giúp tăng tỉ lệ lắng đọng hoặc tuyển nổi (Mata

và cộng sự, 2010) Phương pháp keo tụ được xem là một phương pháp ưu việt hơn các phương pháp khác vì phạm vi áp dụng rộng rãi, nó có thể sử dụng để thu các vi tảo có kích thước khác nhau (Uduman và cộng sự, 2010) Phương pháp này cũng được chứng minh là phương pháp có chi phí phù hợp để thu vi tảo (Benemann và cộng sự, 1980) Quá trình keo tụ có thể xảy ra một cách tự nhiên ở một số vi tảo,

được gọi quá trình tự động tạo bông, vi tảo có thể tập hợp thành từng cục để đáp ứng với áp lực môi trường thay đổi về nitơ, pH và oxy hòa tan (Schenk và cộng sự, 2008; Uduman và cộng sự, 2010) Tuy nhiên, phương pháp keo tụ thường sử dụng các hóa chất có khả năng trợ lắng Các chất trợ lắng phổ biến nhất được sử dụng trong thu hoạch vi tảo là sắt clorua (FeCl3), nhôm sunfat (Al2(SO4)3) và sắt sunfat (Fe2(SO4)3) (Brennan và Owende, 2010) Ngoài ra, vôi (calcium hydroxide, CaCO3) cũng được sử dụng để loại bỏ chất rắn lơ lửng và vi tảo từ nước thải từ những năm

1920 (Oswald, 1988) Muối kim loại đa hoá trị, sắt clorua, sắt sulfat và nhôm clorua (phèn) thường được sử dụng trong xử lý nước thải để loại bỏ tảo đã cho thấy hiệu

quả trong việc làm kết bông cả Chlorella và Scenedesmus (Molina Grima và cộng

sự, 2003) Ở điều kiện kết lắng tối ưu về hàm lượng, độ pH và chất lượng nước sau

xử lý bùn, muối sắt cho hiệu quả kết lắng thấp hơn so với phèn trong sự kết bông vi tảo (Shelef và cộng sự, 1984) Chất kết bông vô cơ được chứng mình là có thể có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vi tảo thu được về khả màu sắc, khả năng sinh trưởng (Molina Grima và cộng sự 2003; Papazi và cộng sự 2010; Schenk và cộng sự, 2008) Chitosan, một polyme hữu cơ cation, có nguồn gốc từ vỏ giáp xác đã được sử dụng trong xử lý nước thải đối với ngành công nghiệp thực phẩm (Harith và cộng sự, 2009) Chitosan đã được chứng minh là có hiệu quả trên một loạt các vi tảo nước ngọt (Harith

- Sử dụng các muối kim loại nặng: các kim loại nặng tồn tại trong sinh khối sau khi thu hoạch sẽ khó ứng dụng làm thức ăn cho động vật, do đó khả năng ứng dụng bị hạn chế

Do đó, việc sử dụng chitosan-một polyme sinh học an toàn, thân thiện với môi trường để thu sinh khối là điều rất cần thiết

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thu sinh khối vi tảo

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, chitosan đã được nghiên cứu trong lĩnh vực xử lý nước thải, nhưng những thông tin liên quan đến việc ứng dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo,

trong đó có loài Thalassiosira pseudonana, còn rất hạn chế

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Harith và cộng sự (2009) đã nghiên cứu sử dụng các chất trợ keo tụ khác nhau bao gồm chitosan và hệ chất đa điện phân (polyelectrolytes) thương mại

Magnafloc (LT 25 và LT 27), trong việc thu sinh khối vi tảo Chaetoceros calcitrans

Kết quả cho thấy hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo phụ thuộc vào pH của môi trường

và đạt hiệu suất cao nhất ở pH 8,0 (đối với chitosan) và pH 10,2 (đối với LT 25 và LT 27)

Xu và cộng sự (2013) đã sử dụng chitosan như chất trợ keo tụ tự nhiên để thu

sinh khối của vi tảo xanh Chlorella sorokiniana Kết quả cho thấy trên 99% sinh

khối của vi tảo được kết lắng ở nồng độ chitosan 2 mg/L và pH nhỏ hơn 7 Sơ bộ

đánh giá chi phí tác giả cho rằng sinh khối vi tảo Chlorella sorokiniana thu theo

phương pháp sử dụng chitosan thấp hơn so với phương pháp ly tâm và lọc Tác giả ước tính để thu một tấn sinh khối vi tảo bằng chitosan thì chi phí khoảng 200 USD

Granados và cộng sự (2012) nghiên cứu sử dụng chitosan, một số muối kim loại và hệ chất đa điện phân để thu sinh khối của một số loài vi tảo nước ngọt

(Chlorella vulgaris, C fusca, Scenedesmus sp và S subspicatus) Tác giả kết luận

rằng hiệu quả thu hồi sinh khối của vi tảo phụ thuộc vào chất trợ keo tụ và nồng độ

sử dụng của chúng

Salim và cộng sự (2011) lần đầu tiên sử dụng sinh khối của các loài vi tảo có khả năng trợ keo tụ để keo tụ sinh khối của các loài vi tảo khác Trong phương pháp này không cần sử dụng các chất trợ keo tụ hóa học Theo đó, một số loài vi tảo có khả

năng sử dụng như một chất trợ keo tụ bao gồm Tetraselmis suecica, S obliquus và

Ankistrodemus falcatus để thu sinh khối của hai loài vi tảo Neocholoris oleobundans

và C vulgaris Cả ba loài vi tảo sử dụng đều có thể sử dụng như là chất trợ keo tụ

Trong phương pháp này không cần sử dụng các chất trợ keo tụ hóa học

So sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo Nannochloropsis sp bằng nanochitosan

với chitosan được thực hiện bởi Farid và cộng sự (2013) Theo tác giả, nanochitosan cho hiệu quả thu sinh khối vi tảo cao hơn chitosan khoảng 9% Như vậy, kích thước của chất trợ keo tụ có thể là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trợ lắng

vi tảo

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là điều kiện thu sinh khối vi tảo

Thalassiosira pseudonana bằng chitosan và hoạt tính sinh học của sinh khối vi tảo

thu được

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vi tảo Thalassiosira pseudonana

Vi tảo Thalassiosira pseudonana ở cuối pha tăng trưởng của chu kỳ sinh

trưởng được nuôi trồng tại Công ty Uni President-Ninh Phước, Ninh Thuận

Vi tảo Thalassiosira pseudonana được nuôi trong môi trường dinh dưỡng

AGP 10%, độ mặn 30‰ Trong quá trình nuôi sục khí 24/24h, nhiệt độ duy trì ở 26-

nuôi có bổ sung 1 số chất đạm

2.2.2 Chitosan

DD85) được sản xuất từ đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei tại công ty Longshin-khu công nghiệp Suối Dầu-Cam Lâm-Khánh Hòa

2.3 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất đạt hạng phân tích bao gồm: axit acetic, NaOH, HCl, chitosan (DD70, DD85), nước cất, ethanol, 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Na2CO3, thuốc thử Folin-Ciocalteu, axit gallic, giấy quỳ, K3(Fe[CN]6), FeCl3, axit trichloracetic (TCA) và vitamin C

2.5.2 Xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo

Điều kiện thu sinh khối được xác định thông qua việc đánh giá hiệu suất kết bông

tế bào vi tảo (Flocculation efficiency, FE), hệ số tập trung nồng độ (Concentration factor, CF), tỉ lệ theo thể tích phần chất rắn lắng được (Settleable solid volume fraction, SSVF) (Sirin, 2013) (Hình 2.1)

Hiệu suất lắng của vi tảo được xác định bằng cách đo mật độ quang học tế bào tảo trước khi keo tụ và mật độ quang học của phần chất lỏng sau khi keo tụ Mật độ quang học (Optical desity OD) được đọc bằng máy quang phổ theo phương pháp của Lee và cộng sự (1998)

Mật độ quang học của vi tảo Thalassiosira pseudonana được đo bằng máy

quang phổ ở bước sóng 450 nm

Hiệu suất lắng được tính bằng công thức:

Hiệu suất lắng (%) = (ODđ – ODs)/ODđ x100

ODđ : mật độ quang học của dung dịch tảo trước khi keo tụ

Hệ số tập trung nồng độ (CF) được tính bằng công thức:

Hệ số tập trung nồng độ (CF) = (h0/hf) x hiệu suất lắng (Lee và cộng sự, 2009)

Tỉ lệ theo thể phần chất rắn lắng được (SSVF) được tính bằng công thức:

Tỉ lệ theo thể phần chất rắn lắng được (SSVF) = (hf/h0) (Graves và cộng sự, 1979)

Hình 2.1 Cách xác định chiều cao cột lắng 2.5.3 Xác định hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học

2.5.3.1 Chuẩn bị dịch chiết

2 g vi tảo tươi (đã tách bớt nước) được chiết bằng 30 ml dung dịch ethanol 95% và được đồng hóa Hỗn hợp được đem đi ly tâm lạnh với tốc độ 10.000 vòng, trong 10 phút ở 4oC để chuẩn bị cho các test thử

2.5.3.2 Xác định hàm lượng carotenoid tổng số và chlorophyll

Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong tế bào vi tảo Thalassiosira

pseudonana như chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoid tổng số được xác định

theo phương pháp của Nayek Sumanta và cộng sự (2014) Phần trong của dịch chiết thu được sau ly tâm lạnh được đem đi đo độ hấp thụ ở các bước sóng 470, 649, 664

nm bằng máy quang phổ kế Hàm lượng carotenoid tổng số, chlorophyll a và chlorophyll b được xác định theo công thức sau:

Cx+c: Carotenoid tổng số Kết quả trình bày bởi µg/g nguyên liệu khô

2.5.3.3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ Lấy chính xác 0,1 ml dịch chiết trộn với 0,9 ml nước cất Sau đó cho thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và 2,5 ml

Na2CO3 7,5% Lắc đều hỗn hợp bằng máy Vortex Hỗn hợp được trong điều kiện tối và nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút trước khi đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia) Kết quả được báo cáo bởi mg axit gallic/g nguyên liệu khô

Kết quả được báo cáo bởi mg axit gallic/g nguyên liệu khô

2.5.4 Xác định khả năng chống oxy hóa

Khả năng chống oxy hóa của vi tảo được xác định bằng cách xác định khả năng khử gốc tự do DDPH và năng lực khử của dịch chiết tế bào

2.5.4.1 Xác định khả năng khử gốc tự do DDPH

Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi

để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau (Lee và cộng sự, 2003)

Phương pháp bắt gốc tự do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) được phát

thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng (hình 1.2) Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa

2.5.4.2 Xác định tổng năng lực khử

Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia vào phản ứng oxi hóa khử Khi xác định năng lực khử ta cũng xác định được năng lực kháng oxy hóa của một chất Tổng năng lực khử được xác định theophương pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hoá trong việc khử phức K3Fe(CN)6 thành phức K4Fe(CN)6, phức này tác dụng với FeCl3 thành KFe[Fe(CN)6] (xanh Pruss)

có trong nguyên liệu Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 700 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch axit ascorbic

2.6.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Vi tảo

Bố trí thí nghiệm xác định các điềukiện thu sinh khối vi tảo (pH, nồng

độ chitosan, thời gian thu, loạichitosan)

Bố trí thí nghiệm xác định hàmlượng ẩm, hàm lượng chlorophyll a,chlorophyll b, carotenoid tổng số,polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của vi tảo

Kếtquảvàthảoluận

Thu sinh khối

bằng chitosan

Sinh khối vi tảo

Đo độ đục của hỗn hợp trên

Thuyết minh sơ đồ:

Thí nghiệm được thực hiện trên vi tảo Thalassiosira pseudonana đang ở cuối

pha tăng trưởng của chu kì sinh trưởng của công ty UNI-President-Ninh Thuận Thực nghiệm nhằm xác định điều kiện thu cho hiệu suất thu sinh khối vi tảo cao nhất và đánh giá hoạt tính sinh học của sinh khối thu được

Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong 250 ml rồi tiến hành thử nghiệm xác định điều kiện thu sinh khối

Từ sinh khối vi tảo thu được tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học thông qua xác định hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học, khả năng chống oxy hóa 2 g sinh khối vi tảo tươi được chiết bằng 30 ml ethanol 95%, sau đó hỗn hợp dịch chiết được đưa đi ly tâm lạnh với tốc độ 10.000 vòng trong 10 phút ở 4o

C Phần dịch trong được thu lại và đưa đi test

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại chitosan

Hỗn hợp môi trường nuôi và

sinh khối vi tảo

Nhóm 1: Chitosan có độ deacetyl 70

Đo độ đục của hỗn hợp trên

Kết quả và thảo luận

Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành trên ống đong 250 ml Hỗn

hợp gồm môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong Sau

đó hỗn hợp được xử lý bằng 2 loại dung dịch chitosan có độ deacetyl khác nhau (70

và 85) ở pH môi trường nuôi, nồng độ chitosan 10 mg/L (theo thể tích hỗn hợp tảo

và môi trường nuôi) để thu sinh khối vi tảo Hỗn hợp sau đó được khuấy mạnh trong 30 giây và để ổn định trong 10 phút rồi tiến hành đo độ đục ở bước sóng 450

nm (bước sóng hấp thụ tối đa của hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo

Hỗn hợp môi trường nuôi và

sinh khối vi tảo

Thu sinh khối vi tảo bằng dung dịch chitosan có độ deacetyl 70 tại các pH khác nhau

Đo độ đục của hỗn hợp trên

Kết quả và thảo luận

Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành trên ống đong 250 ml Hỗn

hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong Dung dịch NaOH 0,1 M và HCl 0,1 M được sử dụng để điều chỉnh pH của môi trường Sau đó cho dung dịch chitosan có độ deacetyl thích hợp với nồng độ 10 mg/L vào hỗn hợp ở các pH khác nhau từ 4 đến 9 Hỗn hợp được khuấy mạnh trong 30 giây

và để ổn định trong 10 phút Độ đục của hỗn hợp được đo ở bước sóng 450 nm (bước sóng hấp thụ tối đa của hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo

Thalassiosira pseudonana)

2.6.4 Xác định nồng độ chitosan dùng để thu sinh khối vi tảo

Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ chitosan thích hợp để thu sinh khối

vi tảo

Sơ đồ thí nghiệm:

0,8 mg/L

1,6 mg/L

2,4 mg/L

3,2 mg/L

4,0 mg/L

5,2 mg/L

6,0 mg/L

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chitosan

Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối

vi tảo

Thu sinh khối vi tảo bằng dung dịch chitosan có độ deacetyl thích hợp với các nồng độ khác nhau tại pH 6

Đo độ đục của hỗn hợp trên

Kết quả và thảo luận

Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành trên ống đong 250 ml Hỗn

hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong Dung dịch NaOH 0,1 M và HCl 0,1 M được sử dụng để điều chỉnh pH của môi trường sau

đó được xử lý bằng dung dịch chitosan có độ deacetyl thích hợp với các nồng độ khác nhau tại pH thích hợp Hỗn hợp sau đó được khuấy mạnh trong 30 giây và để

ổn định trong 10 phút Độ đục của hỗn hợp được đo ở bước sóng 450 nm (bước

sóng hấp thụ tối đa của hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo Thalassiosira

pseudonana)

2.6.5 Thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo

Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối vi tảo

Sơ đồ thí nghiệm:

1

phút

1,5 phút

2,5 phút

5 phút

10 phút

15 phút

20 phút

40 phút

60 phút

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo

Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi

Thu sinh khối vi tảo bằng chitosan DD70

với nồng độ 4 mg/L, tại pH 6 ở các khoảng thời gian khác nhau

Đo độ đục của hỗn hợp trên

Kết quả và thảo luận

Thuyết minh sơ đồ: Thí nghiệm được tiến hành trên ống đong 250 ml Hỗn

hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (250 ml) được cho vào ống đong Dung dịch NaOH 0,1 M và HCl 0,1 M được sử dụng để điều chỉnh pH của môi trường Sau đó hỗn hợp được xử lý bằng dung dịch chitosan với nồng độ 4 mg/L, tại pH 6 trong các khoảng thời gian khác nhau từ 0 đến 60 phút Hỗn hợp được khuấy mạnh trong 30 giây và tiến hành đo độ đục sau các khoảng thời gian khác nhau ở bước sóng 450 nm (bước sóng hấp thụ tối đa của hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi

tảo Thalassiosira pseudonana)

2.7 Phương pháp phân tích

2.7.1 Xác định hàm lượng ẩm trong tế bào vi tảo

Mục đích thí nghiệm: Xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng chất khô trong

vi tảo

Cốc sấy được sấy đến khối lượng không đổi (khối lượng giữa hai lần liên tiếp sai khác không quá 5x10-4 g) Cân chính xác 2 g tảo tươi cho vào cốc sấy Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 60C trong 2 giờ Sau đó, nâng nhiệt độ lên 105C, sấy liên tục trong 2 giờ Mang cốc đi cân lại khối lượng Hàm lượng ẩm được tính theo công thức:

W (%) = [(m1 + mt) – m2]/[(m1 + mt) – m1] x100

Trong đó:

W: hàm lượng ẩm (%)

m1: khốilượng cốc sấy sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)

mt: khối lượng tế bào vi tảo (g)

m2: khối lượng cốc sấy + khối lượng vi tảo sau khi sấy ở 105oC (g)

2.7.2 Xác định hàm lượng carotenoid tổng số, hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b

Mục đích thí nghiệm: Xác định hàm lượng carotenoid tổng số, hàm lượng

chlorophyll a, chlorophyll b trong tế bào vi tảo