Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo (thalassiosira pseudonana)

Mục đích của nghiên cứu hiện tại đánh giá tiềm năng sử dụng chitosan để thu sinh khôi vi tảo Thalassiosira peseudonana và xác định một số chất có hoạt tính sinh học của sinh khối thu đư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ KHÁNH HUYỀN

Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng

chống oxy hóa của sinh khối vi tảo

(Thalassiosira pseudonana)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ KHÁNH HUYỀN

Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng chống oxy hóa

của sinh khối vi tảo (Thalassiosira pseudonana)

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Trang Sĩ Trung

2 TS Nguyễn Thế Hân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu thu nhận và đánh giá

khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo (Thalassiosira pseudonana)” là công

trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Khánh Huyền

Em cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm, các thầy cô quản lí phòng thí nghiệm và anh/chị phòng kỹ thuật công ty Uni President (Ninh Hải, Ninh Thuận) đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp Lời cảm ơn chân thành xin gửi đến thầy Nguyễn Công Minh (Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường), cô Trần Thị Lê Trang (Viện Nuôi trồng Thủy sản) và anh Nguyễn Đức Cảnh (Công ty Uni President) đã cung cấp mẫu nghiên cứu và hướng dẫn các kỹ thuật liên quan đến nuôi sinh khối

Và cuối cùng em bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình đã nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập Xin gửi đến bạn bè lời cảm ơn

vì đã chia sẻ, động viên và đã cùng đồng hành với tôi trong suốt thời gian học tập cũng như trong cuộc sống thường ngày

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 23 tháng 12 năm 2015

Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Khánh Huyền

PAC : Poly aluminum clorua

PUFA : Các acid béo chưa no

EPA : Acid eicosapentaenoic

ARA : Acid arachidonic

DHA : Acid docosahexaenoic

DPPH : 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

DD : Độ deacetyl

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT III

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 3

3 Nội dung nghiên cứu 4

4 Những đóng góp của đề tài 4

4.1 Ý nghĩa khoa học 4

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về vi tảo Thalassiosira pseudonana 5

1.1.1 Phân loại 5

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Thalassiosira pseudonana 5

1.1.3 Phân bố 6

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana 6

1.1.5 Ứng dụng của Thalassiosira pseudonana 8

1.2 Tổng quan về chitosan 9

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan 9

1.2.2 Ứng dụng của chitosan 12

1.2.3 Cơ sở khoa học và giả thuyết khoa học sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo 17

1.3 Một số phương pháp thu sinh khối vi tảo 19

1.3.1 Phương pháp lắng 19

1.3.2 Phương pháp ly tâm 19

1.3.3 Phương pháp lọc 19

1.3.4 Phương pháp keo tụ 20

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp thu nhận và các chất có hoạt tính sinh học của sinh khối vi tảo 21

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu nghiên cứu 25

2.2.1 Vi tảo Thalassiosira pseudonana 25

2.2.2 Chitosan 25

2.3 Hóa chất 26

2.4 Dụng cụ và thiết bị 26

2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 26

2.5.2 Xác định loại chitosan 27

2.5.3 Thí nghiệm xác định pH 28

2.5.4 Xác định nồng độ chitosan dùng để thu sinh khối vi tảo 29

2.5.5 Thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo 30

2.5.6 Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến sinh khối vi tảo sau khi thu hoạch bằng chitosan 31

2.5.7 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sinh khối vi tảo sau khi thu hoạch bằng chitosan 32

2.5.8 So sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo bằng chitosan với phương pháp ly tâm và một số muối kim loại nặng 33

2.6 Phương pháp phân tích 34

2.6.1 Xác định hàm lượng ẩm 34

2.6.2 Xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo 34

Vận tốc lắng được xác định tại mốc thời gian 2 phút 30s Vận tốc lắng được xác định theo phương pháp của Sirin (2013) bằng công thức: 35

2.6.3 Xác định hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học 35

2.6.4 Xác định khả năng chống oxy hóa 36

2.7 Phương pháp xử lí số liệu 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Xác định điều kiện thích hợp thu sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana 38

3.1.1 Ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo 38

3.1.2 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo 40

3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo 45

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian lắng đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo 48

3.1.5 Kết quả hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo khi thu bằng chitosan với một số muối kim loại 50

3.2 Đánh giá tính chất/ chất lượng của sinh khối vi tảo 54

3.2.1 Hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b, polyphenol và carotenoid tổng số 54

3.2.2 Khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu được bằng chitosan và ly tâm 56

3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gan bảo quản đến sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

Kết luận: 63

Kiến nghị: 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tính chất của 2 loại chitosan (DD70, DD85) 25 Vận tốc lắng được xác định tại mốc thời gian 2 phút 30s Vận tốc lắng được xác định theo phương pháp của Sirin (2013) bằng công thức: 35

PAC ở các pH khác nhau 52

Al2(SO4)3 và PAC ở các pH khác nhau 53

và PAC ở các pH khác nhau 53 Bảng 3.4 Hàm lượng chlorophyll a và b, polyphenol và carotenoid tổng số của sinh khối vi tảo tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan và phương pháp ly tâm 56 Bảng 3.5 So sánh khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan với phương pháp ly tâm 57 Bảng 3.6.Khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana theo thời gian bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau 59 Bảng 3.7 Khả năng phục hồi của tế bào vi tảo 62

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.Vi tảo Thalassiosira pseudonana 6

Hình 1.2 Cấu trúc của chitosan 10

Hình 1.3 Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất chitin, chitosan từ phế liệu thủy sản 11

Hình 1.4 Tổng quan về cơ chế keo tụ khác nhau (a) trung hòa điện tích (b) cơ chế lắng tĩnh điện (c) tạo cầu nối (d) kết bông quét (Vandamme, 2013) 18

Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26

Hình 2.2.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại chitosan 27

Hình 2.3.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH 28

Hình 2.4.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chitosan 29

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thu sinh khối vi tảo 30

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thời gian bảo quản sinh khối vi tảo 31

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sinh khối vi tảo thu bằng chitosan 32

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo bằng chitosan với phương pháp ly tâm 33

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo bằng chitosan với muối kim loại và PAC 34

Vận tốc lắng được xác định tại mốc thời gian 2 phút 30s Vận tốc lắng được xác định theo phương pháp của Sirin (2013) bằng công thức: 35

Hình 2.7 Cách xác định chiều cao cột lắng 35

Hình 3.1 Sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan DD70 và DD85 39

Hình 3.2 Ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất lắng, hệ số lắng (A) và tỉ lệ phần thể tích lắng (B) 40

Hình 3.3 Sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan ở các pH khác nhau 43

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất lắng, hệ số lắng (A) và tỉ lệ phần thể tích lắng (B) (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 44

Hình 3.5 Sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan ở các nồng độ khác nhau 47

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến hiệu suất lắng, hệ số lắng (A) vàtỉ lệ phần thể tích lắng (B) (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 48 Hình 3.7 Sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan ở các khoảng thời gian khác nhau 50 Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian lắng đến hiệu suất lắng, hệ số lắng (A) và tỉ lệ phần thể tích lắng (B) (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p

< 0,05) 50 Hình 3.9 Hình ảnh sinh khối vi tảo thu bằng chitosan (A) và thu bằng ly tâm (B) chụp bằng kính hiển vi quang học 55 Hình 3.10.Sự thay đổi hàm lượng chlorophyl a (A), chlorophyl b (B), carotenoid (C)

và polyphenol tổng số (D) trong sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana theo thời gian bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau 61 Hình 3.11 Hình ảnh khả năng phục hồi của vi tảo thu bằng chitosan sau thời gian bảo quản 1 tuần ở các mức nhiệt độ -20C, 4C và nhiệt độ phòng (A), 4°C; (B), nhiệt độ phòng; (C), -20°C 62

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng chống oxy hóa của sinh

khối vi tảo (Thalassiosira pseudonana)

Nguyễn Thị Khánh Huyền, Nguyễn Thế Hân và Trang Sĩ Trung Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang

Giới thiệu về đề tài và mục tiêu nghiên cứu:

Vi tảo có khả năng nuôi sinh khối lớn, có hàm lượng dinh dưỡng cao và dễ tiêu hóa Nhờ những tính chất này mà vi tảo được sử dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản Để

sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản, sinh khối vi tảo cùng với môi trường nuôi cấy được cung cấp trực tiếp vào bể nuôi Như vậy, sinh khối cùng môi trường phải vận chuyển đến cơ sở nuôi, việc này làm tăng chi phí sản xuất và hiệu quả sử dụng sinh khối thấp Ngoài

ra, trong môi trường nuôi, có thể chứa một số thành phần không có lợi cho sức khỏe của động vật thủy sản, đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng

Việc tách sinh khối vi tảo ra khỏi môi trường nuôi là một thách thức lớn về công nghệ

và kinh tế Phần lớn các loài vi tảo có kích thước tế bào rất nhỏ chỉ từ 1-30 μm và nồng độ sinh khối trong môi trường nước nuôi thấp chỉ từ 0,5-2,0 g/l tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy Hiện nay, một số phương pháp đã được sử dụng để thu nhận sinh khối vi tảo bao gồm: lắng, lọc, ly tâm và sử dụng chất keo tụ Các phương pháp này tương đối hiệu quả tuy nhiên chi phí sử dụng cao và một số phương pháp làm giảm chất lượng sinh khối vi tảo sau khi thu cũng như ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của đối tượng sử dụng sinh khối này Chitosan là một polyme sinh học, đã được chứng minh là thân thiện với môi trường và an toàn cho người sử dụng Chitosan có các nhóm mang điện tích dương có khả năng hấp thu những vi sinh vật tích điện âm, trong đó có vi tảo Với những đặc điểm này, chitosan được xem là chất trợ lắng tiềm năng để thu sinh khối vi tảo, giúp giảm chi phí và nâng cao chất lượng của sinh khối thu được

Ở Việt Nam, vi tảo vi tảo Thalassiosira pseudonana được sử dụng rất phổ biến để làm

thức ăn cho tôm ở giai đoạn Zoea Những nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào việc nuôi sinh khối Dữ liệu khoa học về phương pháp thu cũng như hàm lượng một số chất có hoạt tính sinh học của sinh khối loài vi tảo này còn rất hạn chế Mục đích của nghiên cứu

hiện tại đánh giá tiềm năng sử dụng chitosan để thu sinh khôi vi tảo Thalassiosira

peseudonana và xác định một số chất có hoạt tính sinh học của sinh khối thu được Mục tiêu

cụ thể của đề tài: (1) tìm được điều kiện thích hợp để thu nhận sinh khối vi tảo Thalassiosira

pseudonana bằng chitosan và (2) xác định hàm lượng một số chất có hoạt tính sinh học và

hoạt tính chống oxy hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan

Phương pháp nghiên cứu:

Thí nghiệm sử dụng vi tảo Thalassiosira pseudonana ở cuối pha tăng trưởng của chu

kì sinh trưởng, cung cấp bởi công ty UNI-President (Ninh Phước, Ninh Thuận) Thí nghiệm thứ nhất xác định điều kiện thích hợp (loại chitosan, pH, nồng độ chitosan và thời gian) để thu nhận sinh khối vi tảo Hiệu quả thu sinh khối vi tảo của chitosan và chất lượng sinh khối thu được, được so sánh với phương pháp ly tâm và sử dụng một số muối vô cơ Hiệu quả thu nhận sinh khối vi tảo được đánh giá thông qua các chỉ số: hiệu quả kết bông tế bào vi tảo (flocculation efficiency, FE), hệ số tập trung nồng độ (concentration factor, CF) và tỉ lệ theo thể tích phần chất rắn lắng được (Settleable solid volume fraction, SSVF) Chất lượng của sinh khối vi tảo được xác định dựa vào hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa

Để đánh giá sự thay đổi chất lượng của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan trong quá trình bảo quản, sinh khối được bảo quản ở 3 mức nhiệt độ khác nhau: -20C, 4C và nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 0 - 2 tuần Sau các khoảng thời gian bảo quản, mẫu sinh khối

vi tảo được xác định chất lượng dựa trên khả năng phục hồi, hàm lượng một số chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa

Hiệu quả kết bông tế bào vi tảo, hệ số tập trung nồng độ và tỉ lệ theo thể tích phần chất rắn lắng được được xác định bằng phương pháp của Sirin (2013) Hàm lượng polyphenol tổng

số xác định bằng phương pháp so màu dùng thuốc thử Folin-Ciocalteau, theo theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) Hàm lượng carotenoid tổng số và chlorophyll a, b được xác định bằng phương pháp so màu, kế thừa phương pháp của Sumanta và cộng sự (2014) Khả năng chống oxy hóa được đánh giá bằng 2 phép thử là khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử, sử dụng phương pháp so màu, kế thừa những nghiên cứu trước đây (Fu và cộng sự, 2002; Yen và Duh, 1993) Khả năng phục hồi của tế bào vi tảo được thực hiện bằng cách đếm lượng tế bào trên kính hiển vi

Kết quả nghiên cứu chính và kết luận:

Kết quả nghiên cứu đã xác định được điều kiện thích hợp để thu sinh khối vi tảo: chitosan có độ deacetyl 85%, pH 6, nồng độ chitosan là 4 mg/L và thời gian kết lắng là 10 phút So sánh với một số chất vô cơ bao gồm sắt clorua (FeCl3), nhôm sunfat (Al2 (SO4)3) và Polyaluminium chloride (PAC), cho thấy hiệu quả kết lắng của chitosan cao hơn những chất này tới 50 Sinh khối vi tảo thu bằng chitosan có hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học cao hơn đáng kể so với phương pháp ly tâm Hàm lượng chlorophyl a, chlorophyl b, carotenoid và polyphenol tổng số của sinh khối thu bằng chitosan lần lượt là 8,10; 39,63; 133,29; 7530 µg/g nguyên liệu khô, trong khi đó hàm lượng các chất này thu bằng phương pháp ly tâm lần

lượt là 7,29; 31,68; 114,31; 4730 µg/g nguyên liệu khô Tỷ lệ sống của tế bào vi tảo

Thalassiosira peseudonana sau khi thu bằng chitosan đạt trên 90% Khoảng 50% tế bào vi tảo

thu bằng chitosan có thể phát triển trở lại khi được bảo quản ở nhiệt độ -20°C sau 2 tuần

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hàm lượng của các chất có hoạt tính sinh học trong sinh khối giảm đáng kể sau 2 tuần bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau, bảo quản ở nhiệt độ càng thấp thì mức độ ổn định hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của sinh khối vi tảo càng cao Kết quả của nghiên cứu này bước đầu cho phép kết luận sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo cho hiệu quả thu hồi sinh khối cao ở giá thành phù hợp

Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp theo cần: (1) đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố khác như tính chất của chitosan (độ nhớt, khối lượng phân tử, độ tinh sạch,…), nồng độ sinh khối và tốc độ khuấy đảo đến hiệu quả thu sinh khối và (2) thử nghiệm sử dụng chitosan để thu các loài vi tảo khác nhau (nước mặn và nước ngọt) Đồng thời đánh giá khả năng sử dụng sinh khối vi tảo sau khi thu bằng chitosan của động vật thủy sản

Từ khóa: Chitosan, thu sinh khối, vi tảo Thalassiosira peseudonana, khả năng chống oxy hóa

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vi tảo là loài sinh vật đơn bào, được tìm thấy ở cả vùng biển nước mặn và nước ngọt với các kích thước khác nhau, từ vài đến vài trăm micromet Vi tảo có khả năng nuôi sinh khối lớn, có hàm lượng dinh dưỡng cao và dễ tiêu hóa Sinh khối vi tảo

Thalassiosira pseudonana tại Việt Nam cũng như trên thế giới có vai trò quan trọng

đối với nghề nuôi trồng thuỷ sản Theo Brown (2002) vi tảo Thalassiosira pseudonana

được sử dụng phổ biến cho nuôi động vật thân mềm hai mảnh vỏ và ấu trùng tôm

Thalassiosira pseudonana là loại tảo giàu dinh dưỡng, đặc biệt là các acid béo không

no, cacbohydrat, protei, khoáng Với kích thước 4- 6 μm rất phù hợp với các trại sản xuất giống động vật thân mềm (trong giai đoạn động vật thân mềm có kích thước 200

μm trở lên) có nhu cầu cao về thành phần silic để hình thành vỏ và các trại sản xuất tôm giống từ giai đoạn Mysis đến giai đoạn Post larvae Nó làm tăng tỷ lệ sống và khả

năng tăng trưởng của các đối tượng trên Trong chuỗi thức ăn của tôm he, vi tảo là mắt

xích đầu tiên cho giai đoạn ấu trùng chính vì thế ngay từ cuối giai đoạn Nauplius vi tảo

đã được thêm vào bể nuôi Các loài vi tảo có kích thước từ 4-20 μm thường được dùng

trong nuôi tôm he đó là Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros gracilis, Thalassiosira

pseudonana, Skeletonema costatum, Tetraselmis chui Do thức ăn của ấu trùng tôm

chuyển từ thực vật sang động vật ở giai đoạn Mysis nên lượng tảo cho ăn giảm dần, tuy nhiên một lượng tảo cần thiết vẫn được thêm vào bể nuôi ấu trùng để nhằm mục đích ổn định môi trường nuôi Đến nay, trên thế giới có khoảng trên 40 vi loài tảo đã được phân lập, nuôi cấy và sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng các loài thủy sản Một số

loài tảo được nuôi và sử dụng phổ biến là: Thalasiossira pseudonana, Skeletonema,

Chaaaetoceros calcitrans, Chaetoceros mulleri, Nannochloropsis ocula, Chlorella minutissima, Tại Việt Nam, loài vi tảo Thalasiossira pseudonana được nuôi để làm

nguồn thức ăn cho tôm thẻ chân trắng Bên cạnh làm thức ăn cho động vật thủy sản, vi tảo còn được xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng để chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học cần thiết cho sức khỏe con người Một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi tảo đã được chiết rút bao gồm: các acid béo không no (như EPA và DHA), chất màu (chlorophyll và carotenoid), các chất có khả năng chống oxy hóa, các chất có khả năng kháng virus và các chất có khả năng kháng viêm (Raposo và cộng sự, 2013) Nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng từ vi tảo đã được thương mại hóa Vi tảo còn được coi

là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất dầu diesel sinh học, có thể hoàn toàn thay thế diesel hóa thạch trong tương lai, với sản lượng dầu cao hơn 10-20 lần so với các

loài thực vật trên cạn (Kaewkannetra và cộng sự, 2011)

Để sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản, sinh khối vi tảo cùng với môi trường nuôi cấy được cung cấp trực tiếp vào ao nuôi Điều này dẫn đến phải vận chuyển hoặc bơm trực tiếp môi trường nuôi chứa sinh khối vi tảo đến ao nuôi và làm tăng chi phí sản xuất, hiệu quả sử dụng thấp Ngoài ra, trong môi trường nuôi, có thể chứa một số thành phần không có lợi cho sức khỏe của động vật thủy sản, đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng Để sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi tảo, hầu hết các phương pháp đòi hỏi phải thu sinh khối, sau đó sấy khô và ép/chiết Trước khi sản xuất các sản phẩm thực phẩm hoặc chiết xuất các chế phẩm có hoạt tính sinh học, sinh khối cần được thu nhận từ môi trường nuôi Như vậy, để đạt hiệu khi sử dụng sinh khôi vi tảo cho các mục đích khác nhau, chúng cần được thu nhận từ môi trường nuôi

Việc tách sinh khối vi tảo ra khỏi môi trường nuôi là một thách thức lớn về công nghệ và kinh tế Phần lớn các loài vi tảo có kích thước tế bào rất nhỏ chỉ từ 1-30

μm và nồng độ sinh khối trong môi trường nước nuôi thấp từ 0,5-2,0 g/L tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy Hiện nay, một số phương pháp đã được sử dụng để thu nhận sinh khối vi tảo bao gồm: lắng, lọc, ly tâm và keo tụ Phương pháp ly tâm đã được sử dụng để thu sinh khối của nhiều loài vi tảo khác nhau Tuy nhiên, phương pháp này có chi phí năng lượng cao, làm tăng chi phí sản xuất Norsker và cộng sự (2011) đã ước tính phương pháp ly tâm có chi phí năng lượng đầu vào tương đương với khoảng 50% chi phí năng lượng trong quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi tảo Chisti (2007)

đã ước tính rằng chi phí của quá trình thu sinh khối vi tảo để sản xuất dầu diesel chiếm khoảng 50% chi phí sản xuất Ngoài ra, một nhược điểm khác của phương pháp ly tâm

là làm vỡ cấu trúc của tế bào từ đó dẫn đến làm giảm hàm lượng dinh dưỡng của sinh khối vi tảo (Grima và cộng sự, 2003) Lắng, lọc cũng là phương pháp đã được sử dụng

để thu sinh khối vi tảo Tuy nhiên, phương pháp này cũng có chi phí cao Ngoài ra, nhược điểm lớn nhất của phương pháp lắng lọc đó là nó chỉ thích hợp để thu các loài

vi tảo có kích thước lớn như Spirulina (Godos và cộng sự, 2011)

Sử dụng các chất trợ lắng được cho là phương pháp có hiệu quả cao trong thu vi tảo với chi phí vừa phải (Godos và cộng sự, 2011) Người ta chia các chất trợ lắng thành hai loại: chất trợ lắng vô cơ và chất trợ lắng hữu cơ/đa điện phân

(polyelectrolyte) Các muối kim loại như ferric chloride (FeCl3), aluminum sulfate (Al2(SO4)3) và ferric sulfate (Fe2(SO4)3) là những chất trợ lắng vô cơ đã được sử dụng phổ biến trong thu sinh khối vi tảo Khi sử dụng để thu sinh khối vi tảo chúng tạo thành một lớp cặn trong môi trường nuôi cấy và làm thay đổi pH của môi trường nuôi Điều này làm ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng của sinh khối vi tảo sau khi thu Môi trường nuôi muốn tái sử dụng phải loại bỏ những kim loại này Ngoài ra, các muối ion kim loại khi tồn tại trong sinh khối vi tảo còn ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người và động vật sử dụng (Huang và cộng sự, 2000)

Chitosan là một polyme sinh học, đã được chứng minh là thân thiện với môi trường và an toàn cho người sử dụng Gần đây, chitosan cũng được sử dụng để làm chất trợ lắng trong xử lý nước thải do có khối lượng phân tử lớn và mật độ điện tích

+

, có khả năng hấp thu những vi sinh vật trong đó có vi tảo tích điện âm Với những đặc điểm này, chitosan được xem là chất trợ lắng tiềm năng có thể sử dụng để thu sinh khối vi tảo, giúp giảm chi phí và

nâng cao chất lượng của sinh khối thu được Thalasiossira pseudonana là loài vi tảo

được nuôi nhiều tại Việt Nam để dùng làm thức ăn cho tôm ở giai đoạn ấu trùng Hiện nay, trước khi sử dụng để làm thức ăn cho tôm sinh khối vi tảo cùng với môi trường nuôi được bơm trực tiếp vào bể nuôi Điều này dẫn đến nhiều bất cập như đã trình bày

ở trên Hàm lượng một số chất dinh dưỡng cơ bản như protein và lipid trong loài vi tảo này đã được công bố, tuy nhiên dữ liệu về các chất có hoạt tính sinh học như polyphenol, chlorophyll, carotenoid và khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo này còn rất hạn chế Những dữ liệu khoa học là cơ sở quan trọng để hiểu thêm về tính năng của sinh khối đối với sự sinh trưởng và phát triển của động vật nuôi, cũng như sản xuất các sản phẩm nâng cao cho sức khỏe của con người Để nâng cao hiệu quả sử

dụng sinh khối, thì việc tìm ra phương pháp thu nhận sinh khối vi tảo Thalasiossira

pseudonana chi phí thấp, giữ được chất lượng sinh khối sau khi thu là cần thiết

Xuất phát từ những vấn đề trên đây, đề tài “Nghiên cứu thu nhận và đánh giá

khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo (Thalassiosira pseudonana)” được

thực hiện

Đề tài được thực hiện nhằm đạt được những mục tiêu chính sau đây:

1) Xác định điều kiện thích hợp để thu nhậnsinh khối vi tảo Thalassiosira

pseudonana bằng chitosan;

hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan

3 Nội dung nghiên cứu

Ðể thực hiện các mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài thực hiện những nội dung sau đây:

chitosan và thời gian đến hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo;

li tâm và sử dụng một số chất tổng hợp;

chlorophyll và carotenoid) và khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo thu bằng chitosan và phương pháp li tâm;

năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo bảo quản ở các điều kiện khác nhau

4 Những đóng góp của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đềtài cung cấp dữ liệu khoa học về tiềm năng sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo Kết quả cũng cung cấp dữ liệu khoa học về thành phần, hàm lượng một số chất có hoạt tính sinh học quan trọng và khả năng chống oxy

hóa của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy chitosan có thể sử dụng để thu sinh khối

vi tảo Thalassiosira pseudonana ở nồng độ rất thấp Kết quả này mở ra một hướng

mới trong thu sinh khối vi tảo có chất lượng tốt và giá thành phù hợp sử dụng trong nuôi trồng thủy sản và các mục đích khác nhau

Kết quả của đề tài cũng là cơ sở để sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức

năng từ sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana

1.1 Tổng quan về vi tảo Thalassiosira pseudonana

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Thalassiosira pseudonana

Thalassiosira pseudonana là một loại tảo khuê có dạng hình hộp, rất mỏng, có

kích thước trung bình từ 6-20 x 8-15 µm (vào mùa đông kích thước lớn hơn vào mùa hè) Mặt vỏ hình chữ nhật và đường kính dài hơn trục vỏ tế bào Đai vỏ không đều, mép đai có 2-28 mấu nhỏ, một mấu có dạng hình môi để liên kết với tế bào bên cạnh Thường thì chỉ có duy nhất một gai ở mép và ở trung tâm Gai ở mép có thể dễ dàng nhìn thấy được khi quan sát trên kính hiển vi Bề mặt của màng tế bào tảo tròn nhiều vằn, sọc Các vằn, sọc này có thể thẳng hoặc ngoằn ngoèo, mật độ vằn sọc khoảng 10-

20 vằn sọc/10 µm Tế bào Thalassiosira pseudonana chỉ có một nhân, hình cầu

Thalassiosira pseudonana thường sống đơn độc, đôi khi liên kết với nhau thành tập

đoàn (dạng bản) Có hai hình thức: các tế bào tập hợp với nhau thành từng nhóm hoặc mắt xích giữa các tế bào (dạng chuỗi) Nếu nó kết hợp với nhau thành từng nhóm thì được liên kết với nhau bằng sợi kitin nhỏ, còn ở dạng chuỗi các tế bào xoắn

chuỗi với nhau qua bề mặt màng tế bào Màu của tảo Thalassiosira pseudonana

thay đổi từ màu nâu đến màu xanh hoặc màu vàng tùy thuộc vào số lượng của diệp

lục Tuy nhiên, màu sắc này thay đổi không ảnh hưởng đến chất lượng của tảo Thể

sắc tố của tảo Thalassiosira pseudonana nhỏ, nhiều và có hình hạt (Hình 1.1)

Thalassiosira pseudonana là loại tảo giàu dinh dưỡng, đặc biệt là các acid béo

không no, carbohydrate, protein… cộng với kích thước siêu vi của nó nên rất phù hợp với các trại sản xuất cá biển (làm thức ăn cho copepoda), các trại sản xuất nhuyễn thể (trong giai đoạn nhuyễn thể có kích thước 200 µm trở lên) và các trại sản xuất tôm giống từ giai đoạn mysis đến giai đoạn postlarvae Nó làm tăng tỷ lệ sống và khả năng tăng trưởng của các đối tượng trên (Trương Ngọc An, 1993)

Hình 1.1.Vi tảo Thalassiosira pseudonana

1.1.3 Phân bố

Tảo silic phân bố rất rộng trong môi trường nước mặn, lợ, ngọt Cũng gặp trên đất đá, trong các thủy vực chúng có thể sống trôi nổi hoặc ở đáy Số lượng loài ở đáy nhiều hơn nhưng số lượng cá thể và sinh khối lại ít hơn so với các loài sống trôi nổi Ở các biển lạnh tảo silic phân bố nhiều hơn biển ấm Trong những hồ nước ngọt trong suốt chúng có thể phân bố ở độ sâu 50-60m còn trong nước biển khoảng 100-350m

Riêng tảo Thalassiosira pseudonana thường sống trong môi trường nước mặn Chúng

được nuôi để làm thức ăn cho nhiều ấu trùng động vật hải sản sống đáy như bào ngư,

ốc hương

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana

Protein, lipid, carbohydrate là những thành phần chủ yếu cấu tạo nên tế bào vi tảo Những chất này chiếm 90-95% khối lượng khô tế bào, 5-10% khối lượng chất khô còn lại bao gồm các vitamin, sắc tố, các chất chống oxy hóa… Thành phần dinh dưỡng

của vi tảo Thalassiosira pseudonana biến đổi theo thời gian sinh trưởng và điều kiện

nuôi trồng (Phan Văn Xuân, 2010)

1.1.4.1 Protein

Hàm lượng protein trong mỗi tế bào vi tảo được coi là một trong những yếu tố quyết định giá trị dinh dưỡng của vi tảo Theo một nghiên cứu của Brown và cộng sự (1997), trong tảo đơn bào hàm lượng protein dao động từ 6-52%; carbohydrate từ 5-23%

và lipid từ 7-23% khối lượng chất khô Cũng theo Volkman và cộng sự (1989), hàm

lượng protein tổng số ở vi tảo Thalassiosira pseudonana là 17,8%

Vi tảo được coi là có giá trị dinh dưỡng tốt cho các đối tượng nuôi nếu hàm lượng PUFA (DHA, EPA) dao động từ 1-20 mg/ml tế bào Theo một nghiên cứu của Brown và cộng sự (1989), hàm lượng acid béo không no (EPA + DHA) của

Thalassiosira pseudonana là 7,2 mg/ml tế bào Tuy hàm lượng này thấp hơn so với Chaetoceros calcitrans (17,8 mg/ml tế bào) và Pavlova lutheri (10,1 mg/ml tế bào),

nhưng Thalasiossira pseudonana vẫn là nguồn thức ăn tự nhiên giàu dinh dưỡng cho

ngành nuôi trồng thủy sản

1.1.4.3 Carbohydrate

Theo Brown và cộng sự (1996), hàm lượng hydrocarbon của các loài tảo khá

cao, dao động 5-23% khối lượng khô tế bào Ở tảo Thalasiossira pseudonana hàm

lượng hydrocarbon chiếm 7,8% khối lượng chất khô Hydrocarbon ở tảo tồn tại chủ yếu ở các dạng đường glucose, galactose, mantose, ribose và các polysaccharide khác Trong đó, glucose chiếm hàm lượng cao nhất, dao động 21-87%, tiếp theo là galactose, mantose và ribose

1.1.4.4 Vitamin

Vi tảo là nguồn cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tượng thủy sản nuôi Vi tảo giàu nguồn vitamin và khoáng chất, điều này giúp chúng được ứng dụng như một chất

dinh dưỡng bổ sung vào thực phẩm Một số loài Chlorella chứa nhiều vitamin hơn hầu

hết các loài thực vật trên cạn (Blazencic, 2007) Những loại vitamin chính thường gặp trong tảo nuôi gồm: Thiamin (B1), Riboflavin (B2), Pyridoxin (B6), Cyanocobalamin (B12), acid Ascorbic (C), acid Nicotinic (B3), acid Pantothenic (B5), Tocopherol (E), Caroten (Provitamin A), Choline

1.1.4.5 Sắc tố

Chlorophyll xanh lục và carotenoid vàng, đỏ, cam là những chất màu chủ yếu trong các loài tảo Mỗi loài tảo có chứa từ 5-10 loại carotenoid khác nhau Chlorophyll

a là thành phần sắc tố quang hợp chính trong các loài tảo, ngoài ra còn có chlorophyll

b và chlorophyll c Trong tế bào tảo, carotenoid đóng vai trò như sắc tố bổ trợ quang hợp và là tác nhân bảo vệ tế bào tảo tránh khỏi tác hại của cường độ ánh sáng quá cao

1.1.4.6 Chất chống oxy hóa

Nhiều hợp chất chống oxy hóa được tìm thấy trong các loài vi tảo như các hợp chất polyphenol, các phycobiliprotein và các vitamin (Plaza và cộng sự, 2008) Phenolics, flavonoids, astaxanthin, anthocyanins, carotenoids, chlorophyll, vitamin E, vitamin C… là những hợp chất chống oxy hóa được tìm thấy trong vi tảo Với thành phần chất chống oxy hóa đa dạng, nhiều loại vi tảo đã được ứng dụng trong thực phẩm chức năng, mỹ phẩm để ngăn ngừa sự lão hóa

1.1.5 Ứng dụng của Thalassiosira pseudonana

1.1.5.1 Làm thức ăn cho động vật thủy sản

Vi tảo đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản để làm thức ăn cho nhiều loài thủy sản như nhuyễn thể 2 mảnh vỏ, các loài cá, tôm, mực ở giai đoạn ấu trùng Mặc dù có hàng trăm loài tảo được nghiên cứu để ứng dụng làm thức ăn nhưng chỉ

có rất ít loài được sử dụng cho ngành nuôi trồng, trong đó có loài Thalassiosira (Brown và

cộng sự, 1996)

Với những đặc tính ưu việt không gây ô nhiễm môi trường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt chứa rất nhiều loại acid béo không no, tảo

Thalassiosira pseudonana nói riêng và tảo đơn đơn bào nói chung ngày càng được ứng

dụng rộng rãi để làm thức ăn trong ngành nuôi trồng thủy sản

1.1.5.2 Dùng làm nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học là một nguồn năng lượng sạch và thân thiện với môi trường Việc sử dụng nhiên liệu sinh học sẽ hạn chế được hiện tượng hiệu ứng nhà kính và sự nóng lên của Trái đất Hiện nay, sử dụng nhiên liệu sinh học thay thế cho các loại nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng được quan tâm và ứng dụng, đặc biệt là ở những nước có nền kinh tế phát triển

Nhiên liệu sinh học được sản xuất bằng phản ứng chuyển hóa este từ dầu của nhiều loại cây trồng như hướng dương, đậu nành, cọ và tảo Vi tảo đã được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất nhiên liệu nhờ vào khả năng quang hợp cao, sinh khối lớn, khả năng phát triển nhanh và đặc biệt vi tảo cho sản lượng dầu cao hơn 10-20 lần so với các loài thực vật trên cạn (Kaewkannetra và cộng sự, 2012) Lipid trong vi tảo có khả năng được chuyển đổi thành dầu diesel sinh học, carbohydrate được chuyển thành

nghiệp sản xuất phân bón sinh học (Raja và cộng sự, 2012)

1.1.5.3 Làm dược phẩm

Vi tảo giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học nên có thể được dùng để phát triển dược phẩm và thực phẩm chức năng Tảo silic đã được ứng dụng trong thuốc kháng viêm (Gordon và cộng sự, 2009)

1.2 Tổng quan về chitosan

Chitin/chitosan là một polyme sinh học được chiết rút từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau: phế liệu thủy sản, vi nấm, vi khuẩn Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin/chitosan là từ phế liệu thủy sản: tôm cua, nang mực… mỗi nguồn nguyên liệu khác nhau sẽ cho hàm lượng chitin cũng như tính chất của chitosan khác nhau Hình 1.3 mô tả quy trình tổng quát quá trình sản xuất chitosan từ phế liệu thủy sản

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan

Chitosan một polysaccharide mạch thẳng, là dẫn xuất đề acetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (–COCH3) ở vị trí C(2) Chitosan được cấu tạo

từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là poly b-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly b-(1-4)-D- glucozamin (cấu trúc III) (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc của chitosan

Công thức phân tử: (C6H11O4N)n

Trong đó: n nằm trong khoảng 700 ÷ 4.500 (đôi khi đến 6.000)

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Do chitosan được điều chế từ quá trình khử acetyl hóa chitin nên khối lượng biểu kiến của nó tùy thuộc vào giá trị của n, phần trăm nhóm acetyl và cả điều kiện điều chế của nó Cấu trúc của chitosan là một tập hợp các phân tử liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức Chitin, chitosan là polysaccharide có đạm, không độc hại, có khối lượng phân tử lớn Các tính chất của chitosan như khả năng kết dính, khả năng tạo màng, tạo gel, hấp phụ chất màu, kim loại, khả năng kháng vi sinh vật được quyết định bởi cấu trúc hóa học của chitosan như phân tử lượng, độ deacetyl

Phân tử lượng của chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, nó quyết định tính chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì có

độ nhớt càng cao Thông thường, phân tử lượng của chitosan nằm trong khoảng từ 100.000 dalton đến 1.200.000 dalton Phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin và điều kiện deacetyl và thường thì rất khó kiểm soát Tuy nhiên, chitosan có phân tử lượng thấp thì thường có hoạt tính sinh học cao hơn, thường có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học Chitosan có phân tử lượng lớn

có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng Chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 30-200 cps và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3000-4000 cps Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, cường

Hình 1.3 Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất chitin, chitosan từ phế liệu thủy sản

Chitosan là một polymer hữu cơ, có nhiều trong vỏ các loại giáp xác Ðây là polyme hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được ước tính 100 tỉ tấn/năm Chitosan đã được nghiên cứu và ứng dụng khá nhiều, nhất là vào khoảng thời gian từ 1975-1985 Nó có những đặc tính ưu việt mà các polyme tổng hợp khác không có như: khả năng phân huỷ, dễ tương thích, không độc hại và các đặc tính lý học, sinh học như: khả năng tạo gel, liên kết với các chất màu, lipid, protein và khả năng kháng khuẩn (Knorr, 1983; Hirano,1996; Ng 2000)

Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid citric, acid lacic Khi hòa tan chitosan trong môi trường acid loãng chitosan tồn tại ở dạng điện tích dương (+) nên có những đặc tính khác biệt với các polysaccharide khác thường vốn ở dạng trung tính hoặc ở điện tích âm (-) Chitosan dương tính có khả năng kết hợp với các chất rắn hữu cơ hay bề mặt tế bào, là những chất có ion âm Ðây là cơ sở để ứng dụng chitosan trong việc kết hợp với các chất béo để chế tạo sản phẩm làm giảm cân, băng dán mỹ phẩm vào da hay tóc và kết hợp với kim loại nặng và hoá chất màu

ChitosanDeacetyl

Các tính chất của chitosan như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, khả năng tạo màng… phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, kim loại cũng như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, tạo màng cao hơn so với các mẫu chitosan có độ deacetyl thấp hơn Ngoài các tính chất trên thì chitosan còn có khả năng chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan Chitosan

có độ nhớt thấp thì khả năng chống oxy hóa cao

và bảo quản thực phẩm

Nhiều kết quả nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về khả năng kéo dài thời gian bảo quản của nhiều đối tượng rau quả tươi, thịt, nước quả… của chitosan và các dẫn xuất của nó (Roller và Covill, 1999; Sagoo và cộng sự, 2002; Shahidi và cộng sự, 1999; Synowiecki và Ali-Khateeb, 2003) Chitosan cũng được sử dụng để bảo quản quả tươi (đào, lê, kiwi, dưa chuột, ớt chuông, dâu tây, cà chua, quả vải, xoài, nho ) Ở Việt Nam, chitosan cũng đã được sử dụng trong sản xuất chả giò, bảo quản xúc xích (Nguyễn Thị Ngọc Tú, Nguyễn Hồng Khánh, 2003; Trần Thị Luyến, Nguyễn Thị Hiên, 2006)

Ứng dụng tạo màng của chitosan trong bảo quản rau, quả

Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt Màng chitosan là một màng bán thấm,

do đó nó có khả năng làm thay đổi thành phần các chất khí trong môi trường bảo quản.Với một nồng độ phù hợp, màng chitosan sẽ tạo ra rào cản, ngăn không cho oxy tiếp xúc với bề mặt rau quả nên sẽ hạn chế được quá trình biến nâu của quả; đồng thời

trình tổn thất chất khô Hơn nữa, do màng chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm nên sẽ giảm hiện tượng hư hỏng do vi sinh vật, kéo dài thời gian bảo quản của rau quả

Chitosan không những có hiệu quả khi bảo quản nguyên quả tươi mà còn có hiệu quả khi bảo quản quả cắt lát như thanh long, chuối, xoài, cà rốt cắt lát vì các loại quả cắt lát rất dễ hư hỏng, thời gian bảo quản ngắn Thanh long cắt lát có thể bảo quản

chế sự mất nước và làm chậm sự biến đổi về màu sắc và mùi vị, làm tăng hàm lượng chất rắn hòa tan và hàm lượng vitamin C và vì vậy, có thể kéo dài thời gian bảo quản của xoài cắt lát lên 7 ngày (Chien và cộng sự, 2006) Ngoài ra, chitosan thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật rất tốt, Durango và cộng sự (2005) dùng chitosan 1,5% (MW = 48,5 kDa, DD = 88,76%) để đánh giá lượng vi sinh vật trên cà

chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn lactic và coliforms tổng số - các vi khuẩn có liên quan đến sự hư hỏng của cà rốt sau thu hoạch

Ứng dụng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan trong quá trình chế biến, bảo quản thịt, cá

Thịt và các sản phẩm từ thịt rất giàu protein và lipid nên rất dễ bị hư hỏng do vi sinh vật và quá trình oxy hóa lipid trong quá trình bảo quản Chitosan có tính kháng khuẩn và hạn chế quá trình oxy hóa lipid nên được dùng để bảo quản thịt nhằm hạn chế quá trình hư hỏng của thịt (Kamil và cộng sự)

Với khả năng chống oxy hóa, tạo màng, kháng khuẩn, chitosan được sử dụng trong quá trình chế biến và bảo quản các loại cá có chứa nhiều mỡ như cá tra, cá trích… đặc biệt là các sản phẩm ở dạng fillet Khả năng chống oxy hóa lipid nhờ vào khả năng tạo phức với sắt trong thịt cá và khả năng ngăn cản oxy tiếp xúc với bề mặt

cá Jeon và cộng sự (2002) cho rằng cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể là do hoạt tính tạo phức với các ion kim loại hoặc do chitosan kết hợp với lipid

trong bảo quản xúc xích gà surimi Kết quả cho thấy có thể dùng oligoglucosamin 0,4% làm chất bảo quản xúc xích gà surimi, sau 4 tuần thì chất lượng xúc xích vẫn đạt loại khá Trạng thái xúc xích thẳng, tròn, bề mặt khá láng và mịn, có mùi và màu vàng đặc trưng của thịt gà, chỉ tiêu vi sinh vật đạt yêu cầu Kết quả thử nghiệm cho thấy có

bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng (Trần Thị Luyến và Nguyễn Thị Hiên, 2006)

Quá trình cấp đông chậm sẽ làm tăng hao hụt trọng lượng của sản phẩm thủy sản Để khắc phục hiện tượng này chitosan được sử dụng làm màng bao Cá đã xử lý (lấy ruột, mang, để nguyên con hay phi-lê) được nhúng vào dung dịch chitosan 2,5%

và tiến hành cấp đông Tỷ lệ hao hụt trọng lượng của cá có bao chitosan ở mức 1,46%, thấp hơn nhiều so với mẫu không bọc chitosan với 3,69% Mùi vị cá có màng chitosan không thay đổi sau cấp đông (Bùi Văn Miên, Nguyễn Anh Trinh, 2003)

Ứng dụng chitosan trong công nghiệp sản xuất nước quả trong

Trong công nghiệp sản xuất nước quả trong, làm trong là công đoạn quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng của thành phẩm Chitosan với đặc tính là một keo dương trong dung dịch acid loãng, sẽ thể hiện khả năng keo tụ, tạo bông khi kết hợp với các hợp chất phenol, chất keo và các chất lơ lửng còn lại trong nước quả, làm độ trong của nước quả tăng lên Chitosan có ái lực tốt đối với các hợp chất polyphenol như catechin, proanthocyanidin, acid cinnamic, và các dẫn xuất của chúng (Perlata và cộng

sự, 1989) Ngoài ra, khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan cũng được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả để ức chế hoạt động gây hư hỏng của nấm men, nấm mốc Chitosan sử dụng ở nồng độ 0,3 g/L nước quả có khả năng ức chế hoàn toàn nấm mốc trong nước táo sau 13 ngày bảo quản (Roller và Covill, 1999)

Ứng dụng khả năng tạo gel của chitosan trong chế biến thực phẩm

Nhờ vào đặc tính kháng khuẩn và tạo gel mà chitosan được ứng dụng trong quá trình sản xuất đậu phụ để tăng độ bền gel và kéo dài thời gian bảo quản Bổ sung 2% chitosan đã làm tăng độ bền gel của đậu phụ (No và Mayers, 2004) Đậu phụ sử dụng

Ngoài ra, chitosan cũng được sử dụng như một chất tạo cấu trúc dẻo, dai cho thực phẩm thay thế cho hàn the

Ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để tăng cường sự hoạt động của các

vi sinh vật trong đất, bọc các hạt giống nhằm ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất

và tăng khả năng nảy mầm của hạt, kích thích hệ miễn dịch, kích thích sinh trưởng và tăng năng suất thu hoạch

Mục đích sử dụng chitosan bọc hạt giống để chống nấm và kích thích nảy mầm

đã được thử nghiệm với lúa, đậu nành và nhiều loại hạt giống khác (Agarwal và Sinclair, 1997; Goulart và cộng sự, 2002) Sau 6 tháng bảo quản, tỉ lệ nảy mầm của các hạt được bọc chitosan cao nhất, đạt 74% so với tỉ lệ nảy mầm của các hạt lúc ban đầu là 90-92% (Sawatwanich và cộng sự, 2007)

Chitosan cũng được nghiên cứu thử nghiệm phun lên rau cải (Brassica

campestris spp.) cho năng suất thu hoạch cải tăng lên (Wongroung và cộng sự, 2002)

Ðồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lý-sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp, kết quả cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục tổng số và hàm lượng nitơ, đồng thời các enzyme như amylase, catalase, peroxidase cũng tăng lên và chitosan còn góp phần cải tạo đất khô cằn, bạc màu, giữ ẩm cho cây trồng

Trong thủy sản

Chitosan được nghiên cứu ứng dụng nhiều nhiều trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Chitin và chitosan được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá để kích thích sinh trưởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trường ao nuôi Ngoài ra, chitosan cũng được ứng dụng làm màng bao, chất kết dính để tăng độ ổn định của thức ăn tôm trong

ao nuôi ( Trang Sĩ Trung; Phạm Thị Đan Phượng và cộng sự, 2008) Việc nghiên cứu

sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo làm thức ăn cho ngành nuôi trồng thủy sản cũng được nghiên cứu và ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới Chitin, chitosan bổ sung vào thức ăn ở tỷ lệ 1% (1g chitin + 1g chitosan trên 100g thức ăn) làm tăng miễn

dịch của cá chép chống lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Gopalakannan và Arul,

2006) Bên cạnh đó, thức ăn có bổ sung chitin và chitosan có khả năng làm tăng sự phát triển và tỷ lệ sống của cá so với cá cho ăn thức ăn bình thường

Trong y học

Chitin, chitosan và dẫn xuất có các tính chất quan trọng như: tương thích sinh học cao, tự phân hủy sinh học, khả năng tạo màng, không độc, có khả năng làm lành vết thương, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng vi rút nên chúng được nghiên cứu và triển khai ứng dụng nhiều trong y học Hiện nay, chitin và chitosan đã được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực kiểm soát quá trình giải phóng thuốc (dug release control), vận chuyển làm chất mang DNA trong liệu pháp gene, thuốc giảm béo, thuốc chữa khớp, trị bỏng, da, chỉ nhân tạo, kháng viêm…vv (Hirano, 1996; Dodane và Vilivalam, 1998; Kumar, 2000; Rinaudo, 2006) Tương tự, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, chitin, chitosan và dẫn xuất được ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào động thực vật, cố định enzyme, cố định tế bào, làm chất mang cho DNA

Chitosan cũng được nghiên cứu ứng dụng trong việc điều trị viêm loét dạ dày

do có tác dụng kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn Helicobacter pylori với kết quả

khả quan (Dodane và Vilivalam, 1998; Nguyễn Hữu Đức, Hồ Thị Tú Anh, 2005) Ngoài ra, chitosan được ứng dụng trong kỹ thuật bao phim thuốc (Hoàng Minh Châu, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Kim Hùng, 1998) Một trong những thành công quan trọng của chitosan là sử dụng chitosan để chuyển insulin vào cơ thể qua đường miệng Đây

là một phương pháp rất thuận lợi cho các bệnh nhân bị bệnh tiểu đường (Portero và cộng sự, 2002)

Trong công nghiệp xử lý nước thải

Chitin đã được nghiên cứu trong việc làm chất hấp phụ, tạo phức với kim loại nặng từ thế kỷ trước Chitin có thể tạo phức với nhiều kim loại nặng như đồng, chì, crôm, Tương tự, chitosan cũng hấp phụ rất nhiều ion kim loại nặng như đồng, chì, thủy ngân, crom nhờ các nhóm amin của chitosan có ái lực mạnh và có thể hình thành phức với các ion kim loại nặng (Kim và cộng sự, 1997; Varma và cộng sự, 2004) Tính chất của chitin và chitosan ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo phức với kim loại đặc biệt là độ deacetyl Khi độ deacetyl tăng thì khả năng tạo phức với kim loại tăng lên, do đó để tăng khả năng tạo phức với kim loại nặng thì cần sử dụng loại chitin

có độ deacetyl cao (chitosan) Tuy nhiên, chitosan có hạn chế là bị hòa tan trong môi trường pH thấp, vì vậy, việc lựa chọn loại chitin, chitosan đóng vai trò rất quan trọng Ngoài ra, pH của môi trường cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp phụ kim loại của

pH của dung dịch Với pH của dịch nước thải từ 5,0 - 5,5 thì khả năng hấp phụ Pb2+ và

Chitosan được xem như là tác nhân thu hồi protein từ nước thải của ngành công nghệ thực phẩm (Pinotti và cộng sự, 1997; Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2008) Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm sử dụng chitosan để thu hôi protein từ nước rửa surimi, dịch thải máu cá, nước thải trong quá trình chế biến cá, chế biến sữa Cơ chế thu hồi protein bằng chitosan dựa trên các tương tác tĩnh điện, kẹp giữ cơ học (mechanical entrapment) của các nhóm amino trên chitosan với các nhóm anion trên các phân tử protein và khả năng hấp phụ của chitosan Thêm vào đó, khi ở trong dung dịch, các nhóm amino trên mạch chitosan tích điện dương, do đó chitosan có thể hấp phụ được với nhiều polyme tích điện âm như alginate, carrageenan và pectin nhờ

sự thay đổi trạng thái của hạt, đông tụ và kết lắng (Hình 1.4a); (2) Cơ chế lắng tĩnh điện (electrostatic patch) là hiện tượng trong đó một polymer tích điện liên kết với một hạt mang điện tích ngược dấu Các polymer lân cận đảo chiều điện tích của bề mặt hạt, dẫn đến các mảnh vá của điện tích trái dấu trên bề mặt hạt Sau đó hạt kết nối với nhau thông qua các mảnh vá của điện tích trái dấu, và quá trình kết bông xảy ra (Hình 1.4b); (3) Tạo cầu nối (bridging) là hiện tượng trong đó polyme hoặc chất keo tích điện đồng thời liên kết với bề mặt của hai hạt khác nhau để tạo thành một cầu nối giữa chúng Cầu nối này gắn kết các hạt với nhau và gây kết bông (Hình 1.4c); (4) Kết bông quét (Sweeping flocculation) là quá trình trong đó các hạt bị “bẫy” trong một khối kết tủa lớn (thường có bản chất khoáng) và tạo kết bông (Hình 1.4d)

Hình 1.4 Tổng quan về cơ chế keo tụ khác nhau (a) trung hòa điện tích (b) cơ chế

lắng tĩnh điện (c) tạo cầu nối (d) kết bông quét (Vandamme, 2013)

Chitosan là một polymer sinh học, mang điện tích dương trong môi trường acid loãng, đặc biệt tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng Bề mặt của tế bào vi tảo thường mang điện tích âm vì có chứa các nhóm carboxylic, phosphoryl và amine/hydroxyl; trong đó quan trọng nhất là nhóm carboxylic, nhóm này có trong điều kiện môi trường pH lớn hơn 3 - 4 sẽ xảy ra quá trình tách proton (deprotonation) và làm cho bề mặt tế bào vi tảo tích điện âm; trong khi đó các nhóm phosphoryl và amine/hydroxyl bị tách proton ở pH lớn hơn 7 Như vậy, cơ sở khoa học sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo là quá trình trung hòa điện tích Chitosan tích điện tích dương sẽ tương tác tĩnh điện với tế bào sinh khối vi tảo tích điện âm Tương tác tĩnh điện này sẽ làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các tế bào vi tảo và tạo thành khối có kích thước và khối lượng lớn có thể lắng xuống nhờ trọng lực (Renault và cộng sự, 2009) Hiệu quả thu sinh khối vi tảo của chitosan ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm: pH của môi trường, mật độ sinh khối, môi trường nuôi sinh khối, đặc điểm của sinh khối

vi tảo, tính chất của chitosan (độ deacetyl, khối lượng phân tử, kích thước phân tử, độ tinh sạch), thời gian thu và nồng độ chitosan sử dụng (Chen và cộng sự, 2014) Như vậy, giả thuyết khoa học đặt ra là có thể sử dụng chitosan để thu nhận sinh khối vi tảo

Thalassiosira pseudonana Hiệu quả của quá trình thu sẽ ảnh hưởng bởi pH, thời gian

thu và nồng độ chitosan sử dụng

1.3 Một số phương pháp thu sinh khối vi tảo

Hiện nay sinh khối vi tảo có thể được thu hoạch bằng một số phương pháp như: lắng, ly tâm, lọc và sử dụng chất keo tụ (trợ lắng), hoặc kết hợp của những phương pháp này

1.3.1 Phương pháp lắng

Trong phương pháp lắng, lực hấp dẫn khiến các hạt chất lỏng hoặc rắn tách từ chất lỏng có mật độ khác nhau, nhưng quá trình này có thể rất chậm, nhất là khi sự khác biệt mật độ hoặc kích thước hạt nhỏ (Heaven, 2013) Việc làm lắng đọng vi tảo là khác nhau giữa các loài, nhưng cũng có thể biến đổi trong cùng một loài Mức lắng đọng có thể phụ thuộc vào cường độ ánh sáng (Waite và cộng sự, 1992) Theo Bienfang (1981), sự thiếu hụt về dinh dưỡng có thể làm giảm tỷ lệ lắng tụ Quá trình lắng còn ảnh hưởng bởi độ tuổi của tế bào, tỉ lệ tế bào lắng sẽ tăng lên đối với các tế bào già đặc biệt là tế bào lão hóa (Smayda, 1970) Tốc độ lắng của vi tảo có kích thước nhỏ trong khoảng 4-5 m trong là không đáng kể (Waite và cộng sự, 1992) Mặc dù có một số ưu điểm, nhưng tới nay phương pháp lắng chưa được sử dụng rộng rãi để thu vi tảo (Uduman và cộng sự, 2010)

1.3.2 Phương pháp ly tâm

Phương pháp ly tâm có thể sử dụng để thu hầu hết các loài vi tảo (Mohn, 1988) Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là có chi phí cao Gudin và Thepenier (1986) ước tính rằng chi phí của quá trình phục hồi có thể chiếm từ 20-30% tổng chi phí sản xuất sinh khối Chisti (2007) báo cáo rằng chi phí của quá trình thu sinh khối vi tảo chiếm tới 50% chi phí cuối cùng của sản xuất dầu diesel Hơn nữa, Norsker và cộng sự (2011) tính toán rằng phương pháp ly tâm đòi hỏi một năng lượng đầu vào tương đương với khoảng 50% năng lượng có sẵn trong sinh khối vi tảo thu được Ngoài ra, quá trình ly tâm có thể gây vỡ tế bào làm ảnh hưởng đến chất lượng của sinh khối vi tảo thu được

1.3.3 Phương pháp lọc

Nhiều loại bộ lọc đã được sử dụng để thu hoạch tảo và phương pháp lọc đã được phát hiện thỏa đáng việc khôi phục tế bào tảo tương đối lớn (Molina Grima và cộng sự, 2003); nhưng cũng có thể bị cản trở bởi băng thông thấp và tắc nghẽn nhanh

chóng (Mohn, 1988) Mặc dù có một loạt các thiết kế bộ lọc, bộ lọc màng có thể được chỉ đơn giản là phân loại theo các lỗ hoặc lớp màng kích thước; lọc vĩ mô > 10 m, vi lọc 0,1-10,0 m, siêu lọc 0,02-0,20 m và thẩm thấu ngược < 0,001 m Và do đó áp lực để buộc chất lỏng thông qua một lớp màng, năng lượng hoạt động cần thiết, thường sẽ tăng lên cùng với việc giảm kích thước lỗ màng, vì phạm vi kích thước của

vi tảo thường là giữa 2 và 30 m (Brennan và Owende, 2010; Molina Grima và cộng

sự, 2003) Phương pháp siêu lọc là một lựa chọn tốt cho sự phục hồi, đặc biệt là các tế bào rất mỏng manh, nhưng vẫn chưa được sử dụng đối với vi tảo (Mata và cộng sự 2010; Molina Grima và cộng sự, 2003), chi phí vận hành và phí bảo trì rất cao (Mata

và cộng sự, 2010) Chất hữu cơ ngoại bào được ghi nhận là dẫn đến tắc nghẽn nhanh

chóng của các màng siêu lọc trong phương pháp lọc của Spirulina (Rossi và cộng sự,

2004)

1.3.4 Phương pháp keo tụ

Phương pháp keo tụ thường được sử dụng cùng với các phương pháp thu hoạch khác (Brennan và Owende, 2010) Trong phương pháp này, các tế bào tảo kết hợp với nhau làm tăng kích thước, qua đó giúp tăng tỉ lệ lắng đọng hoặc tuyển nổi (Mata và cộng sự, 2010) Phương pháp keo tụ được xem là một phương pháp ưu việt hơn các phương pháp khác vì phạm vi áp dụng rộng rãi, nó có thể sử dụng để thu các vi tảo có kích thước khác nhau (Uduman và cộng sự, 2010) Phương pháp này cũng được chứng minh là phương pháp có chi phí phù hợp để thu vi tảo (Benemann và cộng sự, 1980) Quá trình keo tụ có thể xảy ra một cách tự nhiên ở một số vi tảo, được gọi quá trình tự động tạo bông, vi tảo có thể tập hợp thành từng cục để đáp ứng với áp lực môi trường thay đổi về nitơ, pH và oxy hòa tan (Schenk và cộng sự, 2008; Uduman và cộng sự, 2010) Tuy nhiên, phương pháp keo tụ thường sử dụng các hóa chất có khả năng trợ lắng Các chất trợ lắng phổ biến nhất được sử dụng trong thu hoạch vi tảo là sắt clorua (FeCl3), nhôm sunfat (Al2(SO4)3) và sắt sunfat (Fe2(SO4)3) (Brennan và Owende,

rắn lơ lửng và vi tảo từ nước thải từ những năm 1920 (Oswald, 1988) Muối kim loại

đa hoá trị, sắt clorua, sắt sulfat và nhôm clorua (phèn) thường được sử dụng trong xử

lý nước thải để loại bỏ tảo đã cho thấy hiệu quả trong việc làm kết bông cả Chlorella

và Scenedesmus (Molina Grima và cộng sự, 2003) Ở điều kiện kết lắng tối ưu về hàm

lượng, độ pH và chất lượng nước sau xử lý bùn, muối sắt cho hiệu quả kết lắng thấp

hơn so với phèn trong sự kết bông vi tảo (Shelef và cộng sự, 1984) Chất kết bông vô

cơ được chứng mình là có thể có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vi tảo thu được về khả màu sắc, khả năng sinh trưởng (Molina Grima và cộng sự 2003; Papazi và cộng sự 2010; Schenk và cộng sự, 2008) Chitosan, một polyme hữu cơ cation, có nguồn gốc từ vỏ giáp xác đã được sử dụng trong xử lý nước thải đối với ngành công nghiệp thực phẩm (Harith

và cộng sự, 2009) Chitosan đã được chứng minh là có hiệu quả trên một loạt các vi tảo nước ngọt (Harith và cộng sự, 2009; Molina Grima và cộng sự, 2003)

Hiện nay các phương pháp trên đều có thể được sử dụng để thu sinh khối vi tảo, tuy nhiên mỗi phương pháp đều có những hạn chế nhất định:

- Phương pháp lọc, ly tâm đòi hỏi chi phí đầu tư cao, mặt khác còn ảnh hưởng đến chất lượng sinh khối vi tảo thu được (các chất dinh dưỡng, chất có hoạt tính sinh học bị thất thoát do quá trình ly tâm làm phá vỡ tế bào)

- Sử dụng các muối kim loại nặng: các kim loại nặng tồn tại trong sinh khối sau khi thu hoạch sẽ khó ứng dụng làm thức ăn cho động vật, do đó khả năng ứng dụng bị hạn chế

Do những hạn chế trên đây mà việc sử dụng một chất trợ lắng như chitosan, một polyme sinh học an toàn, thân thiện với môi trường để thu sinh khối là cần thiết

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp thu nhận và các chất có hoạt tính sinh học của sinh khối vi tảo

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, nhiều loài vi tảo đã được sử dụng làm thức ăn cho động vật thủy sản đặc biệt cho đối tượng giống và ương ấu trùng động vật hai mảnh vỏ và giáp xác

Chaetoceros gracilis, Tetraselmis suecica, Thalassiosira pseudonana và

Nannochloropsis sp là những loài vi tảo được sử dụng phổ biến hiện nay Hầu hết các

công trình nghiên cứu về vi tảo hiện nay tập trung vào việc nuôi sinh khối vi tảo Để

sử dụng sinh khối vi tảo làm thức ăn cho thủy sản, người ta thường thường bơm trực tiếp sinh khối và môi trường nuôi sinh khối vào bể nuôi Để nâng cao hiệu quả sử dụng sinh khối làm thức ăn nuôi và bảo quản sinh khối nhằm chủ động được nguồn thức ăn, thì việc thu sinh khối vi tảo là một việc làm cần thiết Phương pháp thu phổ biến hiện nay ở các cơ sở nuôi vi tảo là li tâm hoặc lọc Phương pháp li tâm có chi phí cao và làm giảm chất lượng của sinh khối vi tảo, trong khi đó phương pháp lọc không phù

hợp để thu sinh khối của vi tảo có kích thước nhỏ như Thalasiossira pseudonana

Phương pháp keo tụ được xem như một giải pháp hữu hiệu để khắc phục những hạn chế của phương pháp li tâm và lọc Cho đến nay, tại Việt Nam những công bố khoa học cũng như ứng dụng thực tế của phương pháp keo tụ trong thu hồi sinh khối vi tảo làm thức ăn cho thủy sản còn rất hạn chế Lý Bích Thủy và Ngô Thị Thu Thảo (2013)

thu được thử nghiệm để làm thức ăn cho nghêu giống (Meretix lyrata) Tác giả đánh

giá hiệu quả thu sinh khối vi tảo dựa trên sự sinh trưởng và tỷ lệ sống của nghêu giống Tuy nhiên, hiệu quả thu hồi sinh khối của phương pháp chưa được đánh giá Kết quả

nghêu sống cao nhất Tuy nhiên, tỷ lệ sống của nghêu sử dụng sinh khối này rất thấp chỉ đạt 15,63% Nguyên nhân của kết quả này có thể là do sự ảnh hưởng xấu đến sức khỏe nghêu giống của dư lượng kim loại nặng trong sinh khối vi tảo Hồ Quốc Phong

và cộng sự (2014) đã nghiên cứu sử dụng phương pháp li tâm để thu sinh khối vi tảo

Chlorellasp định hướng sử dụng sản xuất diesel sinh học Hàm lượng lipid và lượng

sinh khối được xác định Tuy nhiên, trong nghiên cứu này tác giả không đánh giá hiệu quả thu sinh khối của phương pháp li tâm so với các phương pháp thu sinh khối vi tảo khác

Phần lớn các nghiên cứu gần đây về sinh khối vi tảo tập trung vào đánh giá hàm lượng một số chất dinh dưỡng như protein, lipid, carbohydrate và khoáng Trần Thị Lê Trang (2013) đã đánh giá sự ảnh hưởng của các mức nitơ trong môi trường nuôi đến

hàm lượng protein và lipid của vi tảo Spirulina platensis Kết quả cho thấy hàm hàm

lượng nitơ trong sinh khối vi tảo thu được tỷ lệ thuận với lượng nitơ trong môi trường nuôi Tuy nhiên, hàm lượng lipid lại có xu hương ngược lại Hàm lượng protein và lipid đạt giá trị cao nhất lần lượt là 69,64 và 13,48% khối lượng khô Theo Hoàng Thị

Minh Hiền và cộng sự (2013), sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium

mangrovei PQ6 phân lập tại Phú Quốc, tỉnh Kiên Giangcó hàm lượng axít béo

omega-3 và omega-6 chiếm đến 60,9omega-37% so với tổng số axít béo có trong thành phần axít béo

tự do, trong đó, hàm lượng DHA và EPA đạt 22,438% và 14,304% so với tổng số axít béo Với kết quả này tác giả đã kết luận rằng hỗn hợp axít béo tự do thu được từ sinh

khối vi tảo Schizochytrium mangrovei là nguyên liệu tốt cho sản xuất dầu sinh học

giàu axít béo omega-3 và omega-6 để làm thực phẩm chức năng cho người cũng như

động vật nuôi Những nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học của sinh khối vi tảo nuôi trồng tại Việt Nam đến nay còn rất hạn chế

Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất thành công chitosan từ nguyên liệu còn lại trong quá trình chế biến tôm và mực Chitosan đã được nghiên cứu trong lĩnh vực xử

lý nước thải, trong y dược, làm thức ăn cho gia động vật nuôi và phân bón cho cây trồng Tuy nhiên, cho đến nay những công bố liên quan đến việc sử dụng chitosan để thu sinh khối của vi tảo còn rất hạn chế Xuất phát từ thực tế này, nghiên cứu hiện tại

đánh giá hiệu quả thu sinh khối vi tảo Thalasiossira pseudonana bằng chitosan, so

sánh với phương pháp li tâm và sử dụng kim loại nặng Nghiên cứu cũng xác định hàm lượng một số chất có hoạt tính sinh học, khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo

Thalasiossira pseudonana, so sánh với phương pháp thu bằng li tâm Hoạt tính chống

oxy hóa của sinh khối vi tảo này cũng được so sánh với những chất chống oxy hóa thương mại

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Thu sinh khối vi tảo được xem là một công việc quan trọng nhất để sử dụng vào các mục đích khác nhau Các phương pháp thu sinh khối vi tảo cần đạt được đồng thời hai tiêu chí đó là có giá thành rẻ và sinh khối vi tảo thu phải đáp ứng tiêu chuẩn sử dụng cho động vật nuôi và con người Do vậy, các phương pháp thu sinh khối vi tảo bằng phương pháp keo tụ sử dụng các chất vô cơ chỉ có thể sử dụng trong việc thu sinh khối vi tảo làm sạch môi trường Sinh khối vi tảo thu bằng các chất keo tụ này không thể sử dụng để làm thức ăn cho động vật thủy sản cũng như con người bởi những ảnh hưởng xấu đến sức khỏe Nhìn chung, các phương pháp và kỹ thuật thu sinh khối đều hướng tới giảm chi phí và bảo tồn được chất lượng của sinh khối vi tảo

Harith và cộng sự (2009) đã nghiên cứu sử dụng các chất trợ keo tụ khác nhau bao gồm chitosan và hệ chất đa điện phân (polyelectrolytes) thương mại Magnafloc

(LT 25 và LT 27), trong việc thu sinh khối vi tảo Chaetoceros calcitrans Kết quả cho

thấy hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo phụ thuộc vào pH của môi trường và đạt hiệu suất cao nhất ở pH 8,0 (đối với chitosan) và pH 10,2 (đối với LT 25 và LT 27) Xu và cộng sự (2013) đã sử dụng chitosan như chất trợ keo tụ tự nhiên để thu sinh khối của

vi tảo xanh Chlorella sorokiniana Kết quả cho thấy trên 99% sinh khối của vi tảo

được kết lắng ở nồng độ chitosan 2 mg/L và pH nhỏ hơn 7 Sơ bộ đánh giá chi phí tác

giả cho rằng sinh khối vi tảo Chlorella sorokiniana thu theo phương pháp sử dụng

chitosan thấp hơn so với phương pháp ly tâm và lọc Tác giả ước tính để thu một tấn sinh khối vi tảo bằng chitosan thì chi phí khoảng 200 USD Granados và cộng sự (2012) nghiên cứu sử dụng chitosan, một số muối kim loại và hệ chất đa điện phân để

thu sinh khối của một số loài vi tảo nước ngọt (Chlorella vulgaris, C fusca,

Scenedesmus sp và S subspicatus) Tác giả kết luận rằng hiệu quả thu hồi sinh khối

của vi tảo phụ thuộc vào chất trợ keo tụ và nồng độ sử dụng của chúng Ahmad và

cộng sự (2011) báo cáo rằng 99 % vi tảo Chlorella sp đã được kết lắng ở nồng độ

chitosan 10 ppm, hiệu suất kết bông đạt 95-100%, khi sử dụng nồng độ chitosan 20

ppm để thu hồi sinh khối vi tảo Chlorella và 2ppm đối với loài S costatum (Morales

và cộng sự 1985) Trong nghiên cứu của Sirin (2011) hiệu suất thu hồi vi tảo

Phaeodactylum tricornutum đạt 90% ở pH 9.9 khi sử dụng chitosan với nồng độ 20

ppm

Ngoài việc sử dụng chitosan thông thường thì một số tác giả đã thử nghiệm sử dụng chitosan có kích thước nano và một số dẫn xuất từ chitosan Hiệu quả thu sinh

khối vi tảo Nannochloropsis sp bằng nanochitosan với chitosan được thực hiện bởi

Farid và cộng sự (2013) Theo đó, nanochitosan cho hiệu quả thu sinh khối vi tảo cao hơn chitosan khoảng 9% Như vậy, kích thước của chất trợ keo tụ có thể là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trợ lắng vi tảo

Nhìn chung, sử dụng chitosan để thu sinh khối vi tảo là phương pháp có nhiều tiềm năng vì hầu hết những nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm đều chỉ ra rằng sinh khối thu được có chất lượng tốt so với các phương pháp khác Ngoài ra, chitosan là polymer sinh học nên khi nó có trong sinh khối vi tảo không ảnh hưởng đến sức khỏe của động vật nuôi hay người sử dụng sinh khối vi tảo Mặc dù tới nay, nghiên cứu sử dụng chitosan đã được thực hiện trên nhiều loài sinh khối vi tảo khác nhau trên thế giới Tuy nhiên, những nghiên cứu về lĩnh vực này còn rất hạn chế ở Việt Nam Do vậy, nghiên cứu thực hiện trên đối tượng vi tảo nuôi ở Việt Nam cần được thực hiện để có cơ

sở ứng dụng vào thực tế sản xuất

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là vi tảo Thalassiosira pseudonana được nuôi

cấy tại công ty UNI-President (Ninh Phước, Ninh Thuận)

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vi tảo Thalassiosira pseudonana

Vi tảo Thalassiosira pseudonana ở cuối pha tăng trưởng của chu kì sinh trưởng của công ty UNI-President (Ninh Phước, Ninh Thuận) Vi tảo Thalassiosira

pseudonana được nuôi trong môi trường F2, độ mặn 20 - 25‰ Sục khí liên tục trong

được khống chế trong khoảng 8,0

2.2.2 Chitosan

Hai loại chitosan sử dụng trong nghiên cứu có độ deacetyl khác nhau là 70

vannamei được sản xuất theo phương pháp của Trần Thị Luyến và cộng sự (2004) (có

một số thay đổi) Tính chất của 2 loại chitosan (DD70, DD85), được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Tính chất của 2 loại chitosan (DD 70 , DD 85 )

Độ nhớt biểu kiến (cP) (dung dịch

2.3 Hóa chất

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và thuốc thử Folin-Ciocalteu được mua

từ công ty Simga-Aldrich (St Louis, MO, Hoa Kỳ); acid sscorbic và acid gallic được mua từ công ty hóa chất Wako (Osaka, Nhật Bản) Các hóa chất khác đạt hạng phân

2.4 Dụng cụ và thiết bị

Một số thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Máy ly tâm lạnh Mega 17R (Labkorea, Hàn Quốc)

- Máy quang phổ UV-VIS Carry 50 (Varian, Hoa Kỳ)

- Tủ sấy mẫu UNB 400 (Memmert, Đức)

- Máy đồng hóa mẫu Utra-Turax T 18 Basic (IKA, Trung Quốc)

Các dụng cụ và vật liệu thí nghiệm khác bao gồm: cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, ống nghiệm, ống đong, cân phân tích, giấy quỳ,…

2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Thí nghiệm được thực hiện trên vi tảo Thalassiosira pseudonana đang ở cuối

pha tăng trưởng của chu kì sinh trưởng của công ty UNI-President (Ninh Phước, Ninh Thuận) Nghiên cứu thứ nhất tập trung vào xác định điều kiện thích hợp (loại chitosan,

Kết quả

và thảo luận

Vi tảo

Thu sinh khối bằng

chitosan

Sinh khối vi tảo

Nghiên cứu điều kiện thu sinh khối vi tảo (loại chitosan, pH, nồng độ chitosan và thời gian thu)

Xác định hàm lượng chlorophyll a,

polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo, bảo quản sinh khối