Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ eucheuma denticulatum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGÔ ĐỨC DUY NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ RONG ĐỎ Eucheuma denticulatum LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGÔ ĐỨC DUY NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ RONG ĐỎ Eucheuma denticulatum LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60 54 01 04 Quyết định giao đề tài: 675/QĐ - ĐHNT ngày 07/06/2013 Quyết định thành lập HĐ: 1037/QĐ - ĐHNT ngày 06/11/2015 Ngày bảo vệ: 12/12/2015 Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ ĐÌNH HÙNG Chủ tịch Hội đồng: TS VŨ NGỌC BỘI Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu thu nhận Lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum” công trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu hoàn toàn trung thực tác giả thu thập phân tích, nội dung trích dẫn ghi rõ nguồn gốc kết nghiên cứu Luận văn chưa công bố tài liệu Khánh Hòa, ngày … tháng … năm 2015 Tác giả luận văn Ngô Đức Duy iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận giúp đỡ quý phòng ban Trường đại học Nha Trang, thầy cô khoa Công nghệ Thực phẩm tạo điều kiện tốt cho hoàn thành đề tài Đặc biệt hướng dẫn tận tình TS Lê Đình Hùng giúp hoàn thiện tốt đề tài Qua đây, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giúp đỡ Xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo cán làm việc Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày … tháng… năm 2015 Tác giả luận văn Ngô Đức Duy iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG .ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1 Tổng quan rong biển 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển .4 1.1.2 Phân loại rong biển 1.1.3 Giới thiệu chung rong đỏ Eucheuma denticulatum 1.2 Tổng quan lectin .13 1.2.1 Khái niệm lectin 1.2.2 Lịch sử nghiên cứu lectin 1.2.3 Phân bố lectin sinh giới .10 1.2.4 Tính chất lectin .12 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lectin 14 1.2.6 Ứng dụng lectin 15 1.3 Lectin nguồn gốc từ rong biển 17 1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển nước nước 17 1.3.2 Cấu tạo lectin nguồn gốc từ rong biển .21 1.4 Thu nhận lectin từ rong biển 25 1.4.1 Các kỹ thuật chiết tách lectin 25 1.4.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 26 v CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 28 2.1.1 Nguyên vật liệu 28 2.1.2 Hóa chất .28 2.1.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Xác định hoạt độ lectin phương pháp ngưng kết hồng cầu 29 2.2.2 Xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry (1951) 31 2.2.3 Quy trình tổng quát dự kiến chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum 32 2.2.4 Xác định điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum .34 2.2.5 Khảo sát tác nhân tủa nồng độ thích hợp để thu chế phẩm lectin kỹ thuật rong đỏ E denticulatum 39 2.2.6 Tinh lectin phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-75 41 2.2.7 Kiểm tra độ tinh xác định khối lượng phân tử lectin từ rong đỏ E denticulatum phương pháp điện di SDS-PAGE 43 2.2.8 Phương pháp khảo sát khả liên kết carbohydrate lectin .47 2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 48 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49 3.1 Nghiên cứu điều kiện để chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum 49 3.1.1 Tỷ lệ dung môi chiết 49 3.1.2 Loại dung môi chiết 51 3.1.3 Nồng độ ethanol chiết 53 3.1.4 Thời gian chiết 54 3.1.5 Nhiệt độ chiết 56 3.2 Tinh chế lectin 58 3.2.1 Khảo sát tác nhân kết tủa để thu chế phẩm lectin kỹ thuật 58 vi 3.2.2 Tinh lectin sắc ký lọc gel Sephadex G -75 62 3.2.3 Kiểm tra độ tinh xác định khối lượng phân tử lectin phương pháp điện di SDS-PAGE .63 3.2.4 Kết tổng hợp trình tinh lectin từ rong đỏ E denticulatum 65 3.3 Kết xác định đặc tính lý, hóa sinh học lectin từ rong đỏ E denticulatum 67 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu lectin 67 3.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin 68 3.3.3 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt độ NKHC lectin .70 3.3.4 Khả liên kết carbohydrate lectin 70 3.3.5 Khả ngưng kết loại hồng cầu khác lectin từ rong đỏ E denticulatum 73 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO .77 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPKT : Chế phẩm kỹ thuật DC : Dịch chiết DCT : Dịch chiết thô HĐR : Hoạt độ riêng HĐTS : Hoạt độ tổng số NKHC : Ngưng kết hồng cầu OD : Độ hấp thu quang học viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Nguồn lectin từ rong biển có khả diệt côn trùng 16 Bảng 1.2 Trình tự xếp axit amin đầu tận N chuỗi α số loài rong thuộc chi Eucheuma Kappaphycus 23 Bảng 2.3 Khảo sát khả liên kết lectin với số loại đường glycoprotein 47 Bảng 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS HĐR lectin 49 Bảng 3.2 Ảnh hưởng loại dung môi chiết đến HĐTS HĐR lectin 51 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến HĐTS HĐR lectin 53 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian chiết đến HĐTS HĐR lectin 55 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến HĐTS HĐR lectin 56 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ % bão hòa (NH4)2SO4 đến HĐTS, HĐR hiệu suất thu hồi lectin 59 Bảng 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ dịch chiết/ethanol đến HĐTS, HĐR hiệu suất thu hồi lectin 60 Bảng 3.8 Ảnh hưởng tác nhân tủa đến HĐTS, HĐR hiệu suất thu hồi lectin 60 Bảng 3.10 Trọng lượng phân tử protein từ rong đỏ E denticulatum 64 Bảng 3.11 Kết tinh lectin từ rong đỏ E denticulatum 65 Bảng 3.14 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum 70 Bảng 3.15 Nồng độ đường glycoprotein nhỏ có khả ức chế hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum .71 Bảng 3.16 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu dịch chiết từ rong đỏ E denticulatum 73 Bảng 2.1 Giá trị OD750nm tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) A Bảng 2.2 Giá trị Rf lg M protein thang chuẩn A Bảng 3.9 Kết đo OD280nm hoạt độ NKHC phân đoạn sau sắc lọc gel cột nhựa Sephadex-75 B Bảng 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum B Bảng 3.13 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum C ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Rong đỏ Eucheuma denticulatum Hình 1.2 Cấu trúc không gian phân tử lectin 13 Hình 1.3 Nguyên tắc kỹ thuật tinh chế sắc ký lọc gel 26 Hình 2.1 Hình ảnh tượng ngưng kết hồng cầu .30 Hình 2.2 Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 32 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tổng quát chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum .33 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình khảo sát tỷ lệ dung môi chiết .35 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình khảo sát loại dung môi .36 Hình 2.6 Sơ đồ quy trình khảo sát nồng độ dung môi chiết .37 Hình 2.7 Sơ đồ quy trình khảo sát thời gian chiết 38 Hình 2.8 Sơ đồ quy trình khảo sát nhiệt độ chiết 39 Hình 2.9 Sơ đồ nghiên cứu kết tủa dịch chiết ethanol .40 Hình 2.10 Sơ đồ nghiên cứu kết tủa dịch chiết (NH4)2SO4 bão hòa 40 Hình 2.11 Hệ thống cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 43 Hình 2.12 Đồ thị tương quan lgM Rf protein thang chuẩn .46 Hình 2.13 Hệ thống chạy điện di 47 Hình 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS lectin 49 Hình 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi chiết đến HĐR lectin 50 Hình 3.3 Ảnh hưởng loại dung môi chiết đến HĐTS lectin .51 Hình 3.4 Ảnh hưởng loại dung môi chiết đến HĐR lectin .52 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến HĐTS lectin .53 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến HĐR lectin 54 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian chiết đến HĐTS lectin 55 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian chiết đến HĐR lectin 55 x khoảng pH từ 6,5 đến 8, khoảng pH từ đến hay từ 8-10 khả NKHC lectin giảm mạnh hoàn toàn [1] 3.3.3 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt độ NKHC lectin Tiến hành lấy 1mL dịch lectin cho tương tác với muối ion kim loại như: Ca2+, Mg2+ EDTA nồng độ 50mM Sau giờ, mẫu thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC so sánh với mẫu đối chứng (không tương tác với cation hóa trị II EDTA) Xác định hoạt độ NKHC tương đối (%) để đánh giá ảnh hưởng cation hóa trị II EDTA đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum Bảng 3.14 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum Mẫu Hoạt độ NKHC (HU/ml) Hoạt độ NKHC Mẫu không kim loại 29 100 Ca2+ 29 100 Mg2+ 29 100 EDTA 29 100 tương đối (%) Mặc dù nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng ion kim loại Ca2+, Mg2+và EDTA đến hoạt độ NKHC lectin từ dịch chiết rong E denticulatum, kết bước đầu Bảng 3.14 cho thấy tác nhân không làm thay đổi khả gây ngưng kết tế bào hồng cầu lectin Đây tính chất thường gặp hầu hết lectin từ rong biển, có mặt ion kim loại không làm ảnh hưởng đến hoạt độ NKHC lectin Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng lectin lĩnh vực khác có nhiều thuận lợi [28] Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu cho thấy có số loài rong mà hoạt độ NKHC chúng lại bị ảnh hưởng ion kim loại như: rong đỏ Enantiocladia duperreyi [10] hay rong xanh Ulva lactuca [40] 3.3.4 Khả liên kết carbohydrate lectin Khảo sát khả liên kết carbohydrate lectin với số loại đường glycoprotein cách cho lectin tương tác với đường glycoprotein với nồng độ khác vòng 60 phút Sau đó, tiến hành bổ sung hồng cầu thỏ xử lý 70 trypsin vào hỗn hợp để đánh giá khả gây ức chế hoạt độ NKHC lectin Từ đó, tìm giá trị nồng độ nhỏ đường glycoprotein mà lectin liên kết Bảng 3.15 Nồng độ đường glycoprotein nhỏ có khả ức chế hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum Mẫu HI Đường: D-glucose, D-mannose, D-galactose, Lfucose, D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D-galactoside, pnitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-Dmannoside (100mM) Cmin (mM), (µg/mL) - - Transferrin - - Fetuin 25 62,5 Pocine thyroglobulin 210 1,953 Asialo-pocine thyroglobulin 210 1,953 Bovine thyroglobulin 28 7,812 Asialo-bovine thyroglobulin 28 7,812 Yeast mannan 29 3,906 Bovine submaxillary mucin 26 31,25 Asialo-bovine submaxillary mucin 26 31,25 Porcine stomach mucin - - Glycoprotein (2.000μg/mL) “-“: Đường 100mM hay glycoprotein 2.000µg/mL khả gây ức chế hoạt độ NKHC lectin “HI”: khả gây ức chế hoạt độ NKHC “Cmin”: nồng độ nhỏ đường (mM) glycoprotein (µg/mL) có khả gây ức chế hoạt độ NKHC Phân tích thực mô tả thí nghiệm Những giá trị nồng độ thấp đường (mM) glycoprotein (μg/mL) ức chế hoàn toàn ngưng kết hồng cầu Kết từ bảng cho thấy hoạt độ NKHC lectin từ rong E 71 denticulatum không bị ức chế có mặt tất loại đường khảo sát Nghĩa lectin khả liên kết với loại đường Kết cho thấy tương đồng với nghiên cứu Hori cộng năm 1990 [19] hay kết tác giả Leite Marques năm 2000 nghiên cứu loài rong đỏ Gracilaria ornata [28] Trong đó, khảo sát khả liên kết lectin với glycoprotein cho thấy 2/10 loại glycoprotein mà lectin liên kết là: Transferrin Porcine stomach mucin Trong đó, 8/10 loại glycoprotein lại liên kết với lectin nồng độ khác Đặc biệt, glycoprotein như: Yeast mannan, Porcine thyroglobulin Asialo-porcine thyroglobulin có khả làm ức chế hoàn toàn hoạt độ NKHC lectin với nồng độ thấp, với nồng độ tương ứng 3,906; 1,953; 1,953 (µg/mL) Kết có tương đồng cao với loại rong khác dòng rong đỏ Eucheuma serra [26] Eucheuma amakusaensis [27] Theo kết nghiên cứu Hori cộng năm 1990 [19] hầu hết lectin từ rong biển không tương tác với đường đơn đường đa mà tương tác với glycoprotein Trong đó, lectin thu nhận từ thực vật bậc cao lại có khả tương tác mạnh với loại đường đơn [23] Tìm hiểu cấu trúc glycoprotein tương tác mạnh với lectin thí nghiệm cho thấy loại glycoprotein: Yeast mannan, Porcine thyroglobulin Asialo-porcine có cấu trúc lõi oligo-saccharide N-glycan dạng high-mannose Từ thấy lectin từ dòng rong có tính đặc hiệu cao glycoprotein Nglycan dạng high-mannose Đây dạng glycoprotein xuất nhiều lớp vỏ hầu hết virus gây bệnh, đặc biệt HIV HBV [23] Mặt khác, thời gian gần số lectin có tính đặc hiệu cao glycoprotein N-glycan dạng high-mannose như: lectin từ rong E serra hay rong K alvarezii nghiên cứu, ứng dụng để ngăn chặn phát triển loài virus gây bệnh truyền nhiễm người [37, 43] Chính vậy, việc nghiên cứu sâu cấu trúc lectin từ rong E denticulatum khả tương tác chúng với glycoprotein dạng highmannose mang lại kết khả quan việc phòng chống ngăn chặn bệnh nan y Qua kết nghiên cứu cho thấy tính chất lý, hóa sinh học lectin từ rong E denticulatum có nhiều điểm tương đồng với lectin từ rong Kappaphycus 72 alvarezii [23,37], Eucheuma amakusaensis [27], Eucheuma serra [26] như: Khối lượng phân tử thấp, khoảng 29 kDa, tồn dạng monomer, khả chịu nhiệt tốt, pH hoạt động giới hạn rộng, có tính đặc hiệu cao với glycoprotein dạng highmannose Trong đó, lectin từ loài rong nghiên cứu, ứng dụng thành công lĩnh vực y sinh như: Chữa trị số bệnh ung thư, bệnh virus hay vi khuẩn gây ra,…[37, 43] Đây tiền đề quan trọng thuận lợi bước đầu để tiếp tục nghiên cứu ứng dụng lectin từ rong E denticulatum cho lĩnh vực nêu 3.3.5 Khả ngưng kết loại hồng cầu khác lectin từ rong đỏ E denticulatum Các loại hồng cầu sử dụng thí nghiệm gồm có: hồng cầu thỏ, cừu, ngựa, gà hồng cầu người nhóm máu A, B, O Các loại hồng cầu sử dụng dạng: hồng cầu tự nhiên, hồng cầu xử lý trypsin hồng cầu xử lý papain Tiến hành khảo sát khả ngưng kết loại hồng cầu lectin Kết khảo sát khả gây ngưng kết loại hồng cầu khác lectin từ dịch chiết rong đỏ E denticulatum trình bày Bảng 3.16 Bảng 3.16 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu dịch chiết từ rong đỏ E denticulatum Thỏ Na Tb Cừu Pc -d 512 1.024 N T Gà P 1.024 1.024 Ngựa Người (A,B,O) N T P N T P N T P - - - - - - - - - a Hồng cầu dạng tự nhiên b Hồng cầu xử lý enzyme trypsin c Hồng cầu xử lý enzyme papain d Không có hoạt tính kết hồng cầu Kết từ Bảng 3.16 cho thấy lectin từ rong đỏ E denticulatum có khả gây ngưng kết tế bào hồng cầu thỏ hồng cầu cừu dạng tự nhiên, xử lý enzyme trypsin papain Nhưng lại khả gây ngưng kết với tất loại hồng 73 cầu lại như: hồng cầu ngựa, gà người Trong đó, hồng cầu thỏ cừu xử lý enzyme trypsin papain hoạt độ NKHC lectin cao nhiều so với khả gây ngưng kết hồng cầu tự nhiên Sở dĩ có tượng xử lý hồng cầu với enzyme (trypsin papain) enzyme thủy phân giới hạn số protein bề mặt tế bào hồng cầu, làm bộc lộ nhóm đường Vì vậy, lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, gây nên tượng ngưng kết tế bào làm cho hoạt độ lectin tăng lên Kết khảo sát khả gây ngưng kết loại hồng cầu khác 42 loài rong vùng biển Ninh Thuận tác giả Lê Đình Hùng cộng năm 2012 [22] cho thấy hầu hết loài rong có khả gây ngưng kết với hồng cầu thỏ cừu, khả gây ngưng kết loại hồng cầu lại như: ngựa, gà người cho tỷ lệ thấp, đặc biệt hồng cầu người Kết nghiên cứu cho thấy hoạt độ NKHC lectin tăng lên rõ rệt hồng cầu xử lý enzyme Không Việt Nam, kết nghiên cứu số nước giới Đài Loan, Nhật hay Brazil cho kết tương đồng với nghiên cứu [17, 19] Không có khả gây ngưng kết nhóm máu người đặc hiệu Vì vậy, lectin từ rong đỏ E denticulatum công cụ xác định nhóm máu giống số lectin từ rong khác như: Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B hay Codium fragile ngưng kết với hồng cầu máu A xử lý papain [34] Tuy nhiên, việc không gây ngưng kết tế bào hồng cầu người đồng nghĩa với việc lectin không gây độc với người Vì vậy, nghiên cứu sử dụng chúng để bổ sung vào thực phẩm hay dược phẩm cho người cần thiết 74 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ  KẾT LUẬN Từ kết thu qua thí nghiệm đề tài, tác giả xin rút kết luận cho quy trình tách chiết, tinh khảo sát số tính chất lectin từ rong đỏ E denticulatum sau: Thứ điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum bao gồm: - Dung môi chiết: ethanol 20% - Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v): 1:8 - Thời gian chiết: - Nhiệt độ chiết: 4oC Thứ hai tinh lectin phương pháp kết tủa với ethanol, tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) 1:4, nhiệt độ 0oC, thời gian Sắc ký lọc gel Sephadex G75 thu chế phẩm có hoạt độ tổng 510,7x103 HU, HTR đạt 15,4x103 HU/mg hiệu suất thu hồi 59% Thứ ba khối lượng phân tử lectin chiết tách từ rong đỏ E denticulatum khoảng 29 kDa Thứ tư bước đầu nghiên cứu xác định số tính chất đặc trưng lectin từ rong đỏ E denticulatum sau: • Lectin bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động rộng từ 20 đến 50oC • Hoạt tính NKHC không thay đổi từ vùng pH đến 10 • Không bị hoạt tính có mặt cation kim loại như: Ca2+, Mg2+ EDTA với nồng độ 50mM • Lectin khả ngưng kết với loại hồng cầu ngựa, gà người Tuy nhiên, lectin lại có khả gây ngưng kết với hồng cầu thỏ cừu • Lectin khả liên kết với tất loại đường thí nghiệm mà liên kết với 8/10 loại glycoprotein nồng độ khác là: Fetuin, Yeast mannan, Porcine thyroglobulin, Asialo-porcine thyroglobulin, Bovine thyroglobulin, Asialobovine thyroglobulin, Bovine submaxillary mucin, Asialo-bovine submaxillary mucin 75  KHUYẾN NGHỊ Để hoàn thiện trình tinh nghiên cứu cách toàn diện yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận ứng dụng lectin từ rong đỏ E denticulatum tác giả có khuyến nghị sau đây: Tiếp tục nghiên cứu thêm yếu tố khác nhằm nâng cao hiệu trình tinh lectin từ rong đỏ E denticulatum Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm sau tinh Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm lectin từ rong đỏ E denticulatum lĩnh vực y học, nông nghiệp số lĩnh vực khác 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt Trương Văn Châu Một số tính chất hóa sinh Lectin mít na Tạp chí khoa học-ĐHSP Hà Nội; 2004 p 83-87 Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh Tách tinh chế số tính chất Lectin từ hạt chay A tonkinensis Tạp chí khoa học; 1991 p 20-27 Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa Chế biến rong biển Giáo trình Đại học Nha Trang; 2004 Lê Thanh Mai cộng Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men Hà Nội: Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật; 2006 Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú, Đỗ Hoa Viên Cơ sở công nghệ sinh học Đà Nẵng: NXB Giáo dục Việt Nam; 2009 (Công nghệ hóa sinh; tập 2)  Tài liệu tiếng Anh Allen, N K and Brillantine L A survey of hemagglutinins in various seeds J Immunol 1969; 102:1295-99 Austin B and Zhang H Vibrio harveyi: a significant path gen of marine vertebrates and invertebrates Letters in applied Microbiology 2006; 43(2):119-214 Barondes S.H., Cooper D.N., Gitt M.A., Leffler H Galectin: Structure and function of a large family of animal lectin J Biol Chem 1994; 269:208-10 Bartolomeu Warlene S de Souza et al A survey of Antarctic algae for agglutinins Oecol Bras 2007; 11(1):122-130 10 Benevides N M B., Holanda M L., Melo F R., Freitas A L P and Sampaio A H Purification and Partial Characterisation of the Lectin from the Marine red alga Enantiocladia duperreyi (C Agardh) Falkenberg”, Botanica Marina 1998; vol 41:521-525 11 Boyd W.C., Almodavar L.R., Boyld L.G Agglutinins in marine algae for human erythrocytes Transfusion (Philadelphia) 1966; 6:82-83 12 Calvete J J., Costa F H F., Saker S S., Murciano M P M., Nagano C S., Cavada B S., Grangeiro T B., Ramos M V., Bloch C., Freitas B T and Sampaio A H The amino acid sequence of the agglutinin isolated from the red marine alga Bryothamnion triquetrum defines a novel lectin structure CMLS Cell Mol Life Sci 2000; 57:343-350 77 13 Charles Santhanaraju Vairappan, and Mikio, Kawasaki Nutritional properties, antioxidant potential and antibacterial activity of two edible seaweeds, Kappaphycus alvarezii and Eucheuma denticulatum (Gigartinales, Rhodophyta) Malaysian Journal of Science, 2008, 27 (2), 53-65 14 Esipov, Sergei E., Shapiro, J A Kinetic model of Proteus mirabilis swarm colony development Journal of Mathematical Biology 1998; 36 (3):249 15 Fabio R.M., Norma M.B.B., Maria G.P., Marjory L.H., Francisca N P.M., Stelio R M.O., Ana L.P.F and Luana M.C.M.S Purification and partial characterization of a lectin from the red marine alga Vidalia obtusiloba C Agardh Revista Brasil Bol 2004; 27(2):263-269 16 Fabregas J et al A comparative study of seafish erythrocytes and agglutinins from seaweeds Comp Biochem Physiol 1992; Vol 103A, No 2:307-313 17 Freitas A L P., Teixeira D I A., Costa F H F., Farias W R L., Lobato A S C., Sampaio A H and Benevides N M B A new survey of Brazilian marine algae for agglutinins Journal of Applied Phycology 1997; 9:495-501 18 Goldstein I J., Hughes R C., Monsigny M., Osawa T and Sharon N What should be call a letin? Nature (London) 1980; 285:66 19 Hori K., Keisuke M & Keiji I Some common properties of lectins from marine algae Hydrobiologia 1990; 204/205:561-566 20 Hori K., Oiwa C., Miyazawa K and Ito K Evidence for wide distribution of Agglutinins in Marine Algae Botanica Marina, 1988; 31:133-38 21 Hung L.D, Hori K., Nang H.Q Screening and preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese marine algae J Appl Phycol 2009a; 21:89–97 22 Hung L.D, Ly B.M, Trang V.T.D., Ngoc N.T.D., Hoa L.T.H., Trinh P.T.H A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae J Appl Phycol 2012; 24:227-235 23 Hung L.D, Trang V.T.D., Ngoc N.T.D High-manose type N-glycan specific lectins from red marine algae, carragenophytes Biotechnology 2011; 9(1):87-98 24 Jong Won Han, Kang Sup Yoon, Tatyana A Klochkova, Mi-Sook Hwang, Gwang Hoon Kim Purification and characterization of a lectin, BLP-3, from the marine green alga Bryopsis plumosa J Appl Phycol 2011; 23:745-753 78 25 Judd, W.J The role of lectin in blood group serology CRC Crit Rew.Clin.Lab.Sci 1980; 12:171-214 26 Kawakubo A., Makino H., Hirohara H., Hori K The marine red alga Eucheuma serra J Agardh, a high yielding source of two isolectins J appl Phycol, 1997; 9:331-338 27 Kawakubo A., Makino H., Ohnishi J., Hirohara H & Hori K Occurrence of highly yielded lectins homologous within the genus Eucheuma Journal of Applied Phycology 1999;11:149-156 28 Leite Marques Y F M., Silva Melo L M C., Amorim Neves R C., Freire E A., Jorge D M., Grangeiro T B., Benevides N M B Purification of a lectin fro the marine red alga Gracilaria ornata and its effect on the development of the cowpea weevil Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) Biochimica et Biophysica Acta 2005; p 137-145 29 Liao W.R., Lin J.Y & Huang R Antibiotic activity of Lectins from marine algae against marine vibrios Microbiol Biotechnol 2003; 30:433-439 30 Lis H., Sharon N Lectins as molecules and as tools Annu Rev Biochem, 1986; 55:35-67 31 Neish, I.C and SuriaLink.com The ABC of Eucheuma Seaplant Production: Agronomy, Biology and Crop - handling of Betaphycus, Eucheuma and Kappaphycus Marine Botanicals 2003 32 Ofek I., Beachey E.H Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli Infect Immun 1987; 22(1):247–54 33 Peumans, W.J and Van Damme, E J The role of lectins in plant defence Histochem J 1995, 27:253-271 34 Rogers D.J and Fish Marine algal lectins Lectin Reviews, 1991;1:129-42 35 Ron J D and Slifkin Methods in enzymology Academic Press, 1997; 310:145-151 36 Ryan K.J., Ray C.G Sherris Medical Microbiology 2004 37 Sato Y., Morimoto K., Hirayama M., Hori K High mannose-specific lectin (KAA-2) from the red alga Kappaphycus alvarezii potently inhibits influenza virus infection in a strain-independent manner Biochemical and Biophysical Research Communications 2011; 405:291-296 79 38 Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Sakaguchi T, Nishizono A, Hirayama M, Hori K Entry Inhibition of Influenza Viruses with High Mannose Binding Lectin ESA-2 from the Red Alga Eucheuma serra through the Recognition of Viral Hemagglutinin Mar Drugs 2015; 13:3454-3465 39 Sharon N., Lis H Lectins Kluwer Academic Publishers, The Netherlands 2003 40 Souza, J.B In vitro inhibition of oral streptococci binding to the acquired pellicle by algal lectins Journal of applied Microbiology 2007;103:1001-6 41 Stelio R.M.O., Antonia E N., Maria E P L., Yaskara F M M L and Norma M B B Purification and characterization of a lectin from the red alga Pterocladiella capillacea (S G Gmel.) Santel & Hommers Revista Brasil Bol 2002; 25(4):397-403 42 Sudhir Kumar, Urmila Barros Isolation of human erythrocyte agglutinins from marine algae Journal of Natural Pharmaceuticals 2012;vol.1, Issue 1:51-54 43 Sugahara T., Ohama Y., Fukyda A., Hayashi M., Kawakubo A., Kato K The cytotoxic effect of Eucheuma serra agglutinin (ESA) on cancer cells and its application to molecular probe for drug delivery system using lipid vesicles Cytotechnology 2001; 36:93-99  Tài liệu Internet 44 www.thuvienkhoahoc.com (Truy cập ngày 12/06/2015) 80 PHỤ LỤC Bảng 2.1 Giá trị OD750nm tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) Nồng độ OD750nm BSA (µg/mL) OD1 OD2 OD3 OD 20 0,095 0,098 0,097 0,097 40 0,164 0,163 0,165 0,164 60 0,226 0,226 0,227 0,226 80 0,264 0,264 0,263 0,264 100 0,322 0,321 0,321 0,321 120 0,384 0,386 0,385 0,385 Bảng 2.2 Giá trị Rf lg M protein thang chuẩn Khối lượng phân tử Khoảng cách di chuyển vạch M (Da) protein D (cm) 55.000 Rf lgM 1,8 0,286 4,470 36.500 2,4 0,381 4,562 29.000 3,1 0,492 4,462 20.100 4,0 0,635 4,303 14.300 4,7 0,746 4,155 6.500 5,6 0,889 3,813 A Bảng 3.9 Kết đo OD280nm hoạt độ NKHC phân đoạn sau sắc lọc gel cột nhựa Sephadex-75 STT OD280nm Hoạt độ NKHC STT OD280nm Hoạt độ NKHC 0,01 14 0,348 128 0,019 15 0,249 64 0,045 16 0,118 32 0,084 17 0,056 0,078 18 0,032 0,045 19 0,020 0,031 20 0,005 0,029 21 0,003 0,031 22 0,002 10 0,035 23 0,003 11 0,037 24 0,002 12 0,058 16 25 0,000 13 0,098 32 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum Nhiệt độ (oC) Hoạt độ NKHC % HU/mL 20 100 29 30 100 29 40 100 29 50 100 29 60 50 28 70 25,5 27 80 0 90 0 100 0 B Bảng 3.13 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum Hoạt độ NKHC pH % HU/mL 100 29 100 29 100 29 100 29 100 29 100 29 100 29 10 100 29 C Danh mục số thiết bị sử dụng nghiên cứu Máy ly tâm Máy quang phổ kế UV-Vis, SPECTRO, UV 2505 D [...]... nhau thu c tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thu n Xuất phát từ những vấn đề nêu trên tác giả đã chọn đề tài Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum làm luận văn tốt nghiệp cao học của mình 2 Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện thu nhận lectin - Nghiên cứu điều kiện tinh sạch lectin - Đánh giá các đặc tính của lectin thu nhận được 3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu a Đối tượng nghiên cứu: ... Xuất phát từ tiềm năng rất lớn của lectin từ rong biển nên tác giải đã chọn đề tài Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum làm luận văn tốt nghiệp cao học của mình 2 Mục tiêu và đối tượng của đề tài - Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu các điều kiện thu nhận, tinh sạch và đánh giá các đặc tính của lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum - Đối tượng nghiên cứu: Rong đỏ Echeuma denticulatum. .. sự thu nhận lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum Mặt khác, luận văn còn là tài liệu dùng để tham khảo cho sinh viên, học viên, nhà nghiên cứu sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này ở nước ta - Về mặt thực tiễn: Đề tài "Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ Eucheuma denticulatum không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học, nhằm khai thác một hợp chất có hoạt tính sinh học mới từ rong. .. mặt lớp vỏ của virus Vì vậy, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản và những ứng dụng của chúng trong tương lai 1.3 Lectin nguồn gốc từ rong biển 1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài 1.3.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Khác với lectin từ thực vật bậc cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ rong biển ở Việt Nam vẫn còn... Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phong trong việc nghiên cứu lectin từ rong biển Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loài rong biển thu c 3 dòng rong: rong đỏ, rong nâu và rong lục Trong đó, hoạt tính NKHC từ rong đỏ là phổ biến nhất [22, 16] Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ở nhiều địa... dụng trong các nghiên cứu hóa sinh và y sinh trong giai đoạn sắp tới [22] Từ những kết quả tổng quan nghiên cứu lectin từ rong biển trong và ngoài nước có thể đi đến một số kết luận như sau: Nghiên cứu lectin từ rong biển chưa được công bố nhiều, đặc biệt nghiên cứu lectin từ loài Eucheuma denticulatum, một đối tượng quan trọng và đầy tiềm năng để nuôi trồng ở quy mô công nghiệp Vì vậy, hướng nghiên cứu. .. của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephadex G-75 62 Hình 3.14 Điện di đồ trên SDS-PAGE của lectin tách từ rong đỏ E denticulatum 63 Hình 3.15 Sơ đồ quy trình công nghệ thu lectin từ rong đỏ E denticulatum 66 Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ E denticulatum 67 Hình 3.17 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ E denticulatum 69 xi... nghiên cứu chính 4.1 Xác định điều kiện để chiết lectin từ rong đỏ E denticulatum Đã xác định được điều kiện thích hợp để thu nhận lectin từ rong E denticulatum với loại dung môi chiết là ethanol 20%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/8 (w/v), thời gian chiết là 4 giờ và nhiệt độ chiết là 4oC 4.2 Tinh sạch lectin - Đã xác định được tác nhân tủa thích hợp để thu được chế phẩm lectin kỹ thu t từ rong E denticulatum. .. một số ít nghiên cứu được thực hiện bởi 17 Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Khánh Hòa Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiên cứu tại Viện này đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau, thu c 3 ngành gồm: rong đỏ, rong nâu và rong xanh Kết quả cho thấy hầu hết các loài rong biển sử dụng trong nghiên cứu đều có khả năng gây ngưng kết với ít nhất một loại hồng cầu từ động... ở Việt Nam Trong vài năm trở lại đây, lectin từ rong biển ở Việt Nam đang được quan tâm nghiên cứu trở lại Tuy nhiên, chỉ một số rất ít các nghiên cứu được thực hiện và thông tin về lectin từ rong biển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế 1.2.3.2 Sự phân bố lectin trong giới động vật Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài ... nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện thu nhận lectin - Nghiên cứu điều kiện tinh lectin - Đánh giá đặc tính lectin thu nhận Đối tượng phạm vi nghiên cứu a Đối tượng nghiên cứu: Rong đỏ Echeuma denticulatum. .. 1.3 Lectin nguồn gốc từ rong biển 1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển nước nước 1.3.1.1 Tình hình nghiên cứu nước Khác với lectin từ thực vật bậc cao, nay, việc nghiên cứu lectin từ rong. .. SDS-PAGE lectin tách từ rong đỏ E denticulatum 63 Hình 3.15 Sơ đồ quy trình công nghệ thu lectin từ rong đỏ E denticulatum 66 Hình 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ NKHC lectin từ rong đỏ E denticulatum