Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm 1951 [4], dùng Albumin huyết thanh bò (BSA - Bovine serium albumin) làm chất chuẩn.
Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein cần phân tích.
Hóa chất
Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20 g Na2CO3 (2%) pha trong 1.000mL nước cất. Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%). Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi sử dụng). Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng.
Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL.
Xây dựng đồ thị chuẩn
Cân 10mg BSA hòa tan trong 10mL nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng độ 1mg/mL. Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120µg/mL để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
Lấy chính xác 0,5mL dịch chứa BSA với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, bổ sung vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25mL thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 750nm.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường. Kết quả được trình bày trong Bảng 2.1 (phần Phụ lục).
Hình 2.2. Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry
Mẫu thí nghiệm
Lấy 0,5mL dịch protein cần kiểm tra và tiến hành bổ sung các hóa chất như đã nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính giá trị protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình.