Tiến hành kết tủa lectin ở các nồng độ ammonium sunfate % bão hòa khác nhau: 60, 65, 70, 75, 80, 85 và 90% ở nhiệt độ tủa 4oC, thời gian tủa 4 giờ. Thu nhận kết tủa bằng cách ly tâm dịch sau tủa ở 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 30 phút, sau đó hòa với dung dịch đệm phosphate để đưa về cùng thể tích 2mL, thẩm tích trong dung dịch đệm để loại muối. Kết quả xác định HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của chế phẩm lectin kỹ thuật được trình bày trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ % bão hòa (NH4)2SO4 đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin
Nồng độ % bão hòa (NH4)2SO4 (%) Hoạt độ tổng số (HU) Hoạt độ riêng (HU/mg)
Hiệu suất thu hồi (%) 60 64 25,6 2,9 65 128 47,4 5,8 70 256 73,1 11,6 75 512 123,9 23,2 80 1.024 145,7 45,7 85 512 98,5 23,2 90 256 47,4 11,6 DC lectin thô 2.240 89,2 100
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ muối bão hòa từ 60% đến 80% thì HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi đều tăng dần lên và đạt cực đại tại nồng độ muối bão hòa là 80% (1.024 HU; 145,7 HU/mg; 45,7 %). Nếu tiếp tục tăng nồng độ % bão hòa lên 85%, 90% thì HĐTS và HĐR đều giảm xuống (512 HU; 98,5 HU/mg) và (256 HU; 47,4 HU/mg), hiệu suất thu hồi cũng chỉ đạt 23,2% và 11,6%.
Vì vậy, đối với tác nhân tủa là (NH4)2SO4 thì nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa 80% sẽ cho hiệu quả tốt nhất so với các nồng độ muối bão hòa khác.
3.2.1.2. Khảo sát nồng độ ethanol để kết tủa lectin
Tiến hành kết tủa lectin bằng ethanol với tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) lần lượt là: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 ở nhiệt độ tủa 0oC, thời gian tủa 4 giờ. Thu nhận kết tủa bằng cách ly tâm dịch sau tủa ở 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 30 phút, sau đó hòa với dung dịch đệm phosphate để đưa về cùng thể tích 2ml. Kết quả xác định HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của chế phẩm lectin kỹ thuật được trình bày trong Bảng 3.7
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết/ethanol đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin
Tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) Hoạt độ tổng số (HU) Hoạt độ riêng (HU/mg)
Hiệu suất thu hồi (%) 1:1 64 37,6 2,9 1:2 128 44,2 5,7 1:3 256 50,2 11,5 1:4 1.024 150,6 45,7 1:5 1.024 120,5 45,7 DC lectin thô 2.240 89,2 100
Từ kết quả Bảng 3.7 cho thấy, khi tăng thể tích ethanol sử dụng (tỷ lệ DC : ethanol (v/v) từ 1:1 đến 1:4) thì HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi lectin tăng dần và cả 3 giá trị này đều đạt cực đại ở tỷ lệ 1:4 (1.024 HU; 150,6 HU/mg; 45,7%). Tuy nhiên, nếu tăng thế tích ethanol sử dụng lên cao hơn (tỷ lệ DC : ethanol (v/v) 1:5) thì hoạt độ riêng của lectin lại giảm xuống đáng kể (120,5 HU/mg). Vậy đối với tác nhân tủa là ethanol thì tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) 1:4 là cho kết quả tốt nhất.
3.2.1.3. So sánh khả năng tủa thu chế phẩm kỹ thuật của các tác nhân
Thí nghiệm với các tác nhân tủa (NH4)2SO4 và ethanol được tiến hành trong cùng điều kiện với cùng thể tích và cùng độ pha loãng. Do đó, có thể so sánh kết quả của các tác nhân khác nhau. Ở đây, ta so sánh các kết quả tủa (NH4)2SO4 80% độ bão hòa và dịch chiết : ethanol (v/v) 1:4.
Để thuận tiện cho việc đánh giá hiệu quả tinh sạch bằng phương pháp kết tủa với các tác nhân tủa khác nhau, tác giả đã tóm tắt kết quả ở Bảng 3.8, Hình 3.11 và Hình 3.12.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin
Tác nhân tủa Hoạt độ tổng (HU)
Hoạt độ riêng (HU/mg)
Hiệu suất thu hồi (%)
(NH4)2SO4 80% 1.024 145,7 45,7
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến HĐTS và hiệu suất thu hồi của CPKT từ DC rong đỏ E. denticulatum
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến HĐR và hiệu suất thu hồi của CPKT từ DC rong đỏ E. denticulatum
Kết quả từ Bảng 3.8, Hình 3.11 và Hình 3.12 và cho thấy với 2 tác nhân tủa là (NH4)2SO4 và ethanol, thì mặc dù HĐTS và hiệu suất thu hồi bằng nhau (1.024 HU,
45,7 %), nhưng HĐR của CPKT khi tủa bằng ethanol là 150,6 (HU/mg) cao hơn so với (NH4)2SO4 là 145,7 (HU/mg).
Mặt khác, sử dụng ethanol làm tác nhân tủa thì giá thành rẻ, quá trình thu CPKT đơn giản, có thể thu hồi lượng ethanol để tái sử dụng, sẽ giảm đáng kể chi phí sản xuất.
Vì vậy, căn cứ vào HĐTS, HĐR, hiệu suất thu hồi và sự phân tích trên tác giả đã chọn ethanol với tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) là 1:4 để làm tác nhân tủa protein lectin từ DC rong đỏ E. denticulatum cho các thí nghiệm tiếp theo.