đỏ E. denticulatum
Các loại hồng cầu được sử dụng trong thí nghiệm này gồm có: hồng cầu thỏ, cừu, ngựa, gà và hồng cầu người nhóm máu A, B, O. Các loại hồng cầu được sử dụng ở 3 dạng: hồng cầu tự nhiên, hồng cầu xử lý trypsin và hồng cầu xử lý papain. Tiến hành khảo sát khả năng ngưng kết các loại hồng cầu của lectin.
Kết quả khảo sát khả năng gây ngưng kết các loại hồng cầu khác nhau của lectin từ dịch chiết rong đỏ E. denticulatum được trình bày trong Bảng 3.16.
Bảng 3.16. Hoạt tính ngưng kết hồng cầu dịch chiết từ rong đỏ E. denticulatum
Thỏ Na Tb Pc Cừu N T P Gà N T P Ngựa N T P Người (A,B,O) N T P -d 512 1.024 8 1.024 1.024 - - - - - - - - - a Hồng cầu dạng tự nhiên. b
Hồng cầu xử lý enzyme trypsin.
c
Hồng cầu xử lý enzyme papain.
d
Không có hoạt tính nhưng kết hồng cầu.
Kết quả từ Bảng 3.16 cho thấy lectin từ rong đỏ E. denticulatum có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu thỏ và hồng cầu cừu ở dạng tự nhiên, và xử lý enzyme trypsin và papain. Nhưng lại không có khả năng gây ngưng kết với tất cả các loại hồng
cầu còn lại như: hồng cầu ngựa, gà và người. Trong đó, ở hồng cầu thỏ và cừu được xử lý enzyme là trypsin và papain thì hoạt độ NKHC của lectin đều cao hơn nhiều so với khả năng gây ngưng kết hồng cầu tự nhiên. Sở dĩ có hiện tượng này là vì khi xử lý hồng cầu với enzyme (trypsin hoặc papain) thì chính enzyme đã thủy phân giới hạn một số protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm bộc lộ các nhóm đường của nó. Vì vậy, lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, gây nên hiện tượng ngưng kết tế bào và làm cho hoạt độ của lectin tăng lên.
Kết quả khảo sát khả năng gây ngưng kết các loại hồng cầu khác nhau của 42 loài rong ở vùng biển Ninh Thuận của tác giả Lê Đình Hùng và cộng sự năm 2012 [22] cũng cho thấy hầu hết các loài rong đều có khả năng gây ngưng kết với hồng cầu thỏ và cừu, trong khi đó khả năng gây ngưng kết đối với các loại hồng cầu còn lại như: ngựa, gà và người đều cho tỷ lệ thấp, đặc biệt là đối với hồng cầu người. Kết quả trong nghiên cứu này cũng cho thấy hoạt độ NKHC của lectin tăng lên rõ rệt khi hồng cầu được xử lý enzyme. Không chỉ ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu của một số nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật hay Brazil cũng cho kết quả tương đồng với nghiên cứu trên [17, 19].
Không có khả năng gây ngưng kết nhóm máu người đặc hiệu. Vì vậy, lectin từ rong đỏ E. denticulatum sẽ không thể là những công cụ xác định nhóm máu giống một số lectin từ rong khác như: Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B
hay Codium fragile chỉ ngưng kết với hồng cầu máu A đã xử lý papain [34]. Tuy
nhiên, việc không gây ngưng kết tế bào hồng cầu người cũng đồng nghĩa với việc lectin này không gây độc với người. Vì vậy, chúng ta có thể nghiên cứu sử dụng chúng để bổ sung vào thực phẩm hay dược phẩm cho con người khi cần thiết.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu qua các thí nghiệm của đề tài, tác giả xin rút ra 4 kết luận cho quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát một số tính chất của lectin từ rong đỏ E.
denticulatum như sau:
Thứ nhất là các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ E. denticulatum
bao gồm:
- Dung môi chiết: ethanol 20%
- Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v): 1:8 - Thời gian chiết: 4 giờ
- Nhiệt độ chiết: 4oC.
Thứ hai là tinh sạch lectin bằng phương pháp kết tủa với ethanol, tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) là 1:4, nhiệt độ 0oC, thời gian 4 giờ. Sắc ký lọc gel Sephadex G- 75 thu được chế phẩm có hoạt độ tổng 510,7x103 HU, HTR đạt 15,4x103 HU/mg và hiệu suất thu hồi 59%.
Thứ ba là khối lượng phân tử lectin chiết tách từ rong đỏ E. denticulatum khoảng 29 kDa.
Thứ tư là đã bước đầu nghiên cứu xác định được một số tính chất đặc trưng của lectin từ rong đỏ E. denticulatum như sau:
•Lectin này khá bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động khá rộng từ 20 đến 50oC. •Hoạt tính NKHC không thay đổi từ vùng pH 3 đến 10.
•Không bị mất hoạt tính khi có mặt của các cation kim loại như: Ca2+, Mg2+ và EDTA với nồng độ 50mM.
•Lectin không có khả năng ngưng kết với các loại hồng cầu của ngựa, gà và người. Tuy nhiên, lectin này lại có khả năng gây ngưng kết với hồng cầu của thỏ và cừu.
•Lectin không có khả năng liên kết với tất cả các loại đường trong thí nghiệm mà chỉ liên kết được với 8/10 loại glycoprotein ở các nồng độ khác nhau đó là: Fetuin, Yeast mannan, Porcine thyroglobulin, Asialo-porcine thyroglobulin, Bovine thyroglobulin, Asialo- bovine thyroglobulin, Bovine submaxillary mucin, Asialo-bovine submaxillary mucin.
KHUYẾN NGHỊ
Để hoàn thiện hơn nữa quá trình tinh sạch cũng như nghiên cứu một cách toàn diện hơn các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận và ứng dụng của lectin từ rong
đỏ E. denticulatum tác giả có 3 khuyến nghị sau đây:
1. Tiếp tục nghiên cứu thêm các yếu tố khác nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ E. denticulatum.
2. Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm sau khi tinh sạch.
3. Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm lectin từ rong đỏ E. denticulatum
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Trương Văn Châu. Một số tính chất hóa sinh của Lectin mít na. Tạp chí khoa học-ĐHSP Hà Nội; 2004. p. 83-87.
2. Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh. Tách tinh chế và một số tính chất của Lectin từ hạt chay A. tonkinensis. Tạp chí khoa học; 1991. p. 20-27.
3. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa. Chế biến rong biển. Giáo trình Đại học Nha Trang; 2004.
4. Lê Thanh Mai và các cộng sự. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men. Hà Nội: Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật; 2006.
5. Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú, Đỗ Hoa Viên. Cơ sở công nghệ sinh học. Đà Nẵng: NXB Giáo dục Việt Nam; 2009. (Công nghệ hóa sinh; tập 2).
Tài liệu tiếng Anh
6. Allen, N. K and Brillantine L. A survey of hemagglutinins in various seeds. J. Immunol 1969; 102:1295-99.
7. Austin B. and Zhang H. Vibrio harveyi: a significant path gen of marine vertebrates and invertebrates. Letters in applied Microbiology 2006; 43(2):119-214.
8. Barondes S.H., Cooper D.N., Gitt M.A., Leffler H. Galectin: Structure and function of a large family of animal lectin. J. Biol. Chem 1994; 269:208-10
9. Bartolomeu Warlene S. de Souza et al. A survey of Antarctic algae for agglutinins. Oecol. Bras. 2007; 11(1):122-130.
10. Benevides N. M. B., Holanda M. L., Melo F. R., Freitas A. L. P. and Sampaio A. H. Purification and Partial Characterisation of the Lectin from the Marine red alga Enantiocladia duperreyi (C. Agardh) Falkenberg”, Botanica Marina 1998; vol 41:521-525.
11. Boyd W.C., Almodavar L.R., Boyld L.G. Agglutinins in marine algae for human erythrocytes. Transfusion (Philadelphia) 1966; 6:82-83.
12. Calvete J. J., Costa F. H. F., Saker S. S., Murciano M. P. M., Nagano C. S., Cavada B. S., Grangeiro T. B., Ramos M. V., Bloch C., Freitas B. T. and Sampaio A. H. The amino acid sequence of the agglutinin isolated from the red marine alga Bryothamnion triquetrum defines a novel lectin structure. CMLS. Cell. Mol. Life Sci 2000; 57:343-350.
13. Charles Santhanaraju Vairappan, and Mikio, Kawasaki. Nutritional properties, antioxidant potential and antibacterial activity of two edible seaweeds,
Kappaphycus alvarezii and Eucheuma denticulatum (Gigartinales,
Rhodophyta). Malaysian Journal of Science, 2008, 27 (2), 53-65.
14. Esipov, Sergei E., Shapiro, J. A. Kinetic model of Proteus mirabilis swarm colony development. Journal of Mathematical Biology 1998; 36 (3):249.
15. Fabio R.M., Norma M.B.B., Maria G.P., Marjory L.H., Francisca N. P.M., Stelio R. M.O., Ana L.P.F. and Luana M.C.M.S. Purification and partial characterization of a lectin from the red marine alga Vidalia obtusiloba C. Agardh. Revista Brasil. Bol 2004; 27(2):263-269.
16. Fabregas J. et al. A comparative study of seafish erythrocytes and agglutinins from seaweeds. Comp. Biochem. Physiol 1992; Vol 103A, No. 2:307-313.
17. Freitas A. L. P., Teixeira D. I. A., Costa F. H. F., Farias W. R. L., Lobato A. S. C., Sampaio A. H. and Benevides N. M. B. A new survey of Brazilian marine algae for agglutinins. Journal of Applied Phycology 1997; 9:495-501.
18. Goldstein I. J., Hughes R. C., Monsigny M., Osawa T. and Sharon N. What should be call a letin? Nature (London) 1980; 285:66.
19. Hori K., Keisuke M. & Keiji I. Some common properties of lectins from marine algae. Hydrobiologia 1990; 204/205:561-566.
20. Hori K., Oiwa C., Miyazawa K. and Ito K. Evidence for wide distribution of Agglutinins in Marine Algae. Botanica Marina, 1988; 31:133-38.
21. Hung L.D, Hori K., Nang H.Q. Screening and preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese marine algae. J. Appl Phycol 2009a; 21:89–97.
22. Hung L.D, Ly B.M, Trang V.T.D., Ngoc N.T.D., Hoa L.T.H., Trinh P.T.H. A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae. J. Appl. Phycol 2012; 24:227-235.
23. Hung L.D, Trang V.T.D., Ngoc N.T.D. High-manose type N-glycan specific lectins from red marine algae, carragenophytes. Biotechnology 2011; 9(1):87-98.
24. Jong Won Han, Kang Sup Yoon, Tatyana A. Klochkova, Mi-Sook Hwang, Gwang Hoon Kim. Purification and characterization of a lectin, BLP-3, from the marine green alga Bryopsis plumosa. J. Appl. Phycol 2011; 23:745-753.
25. Judd, W.J. The role of lectin in blood group serology. CRC Crit. Rew.Clin.Lab.Sci 1980; 12:171-214
26. Kawakubo A., Makino H., Hirohara H., Hori K. The marine red alga Eucheuma serra J. Agardh, a high yielding source of two isolectins. J. appl. Phycol, 1997; 9:331-338.
27. Kawakubo A., Makino H., Ohnishi J., Hirohara H. & Hori K. Occurrence of highly yielded lectins homologous within the genus Eucheuma. Journal of Applied Phycology 1999;11:149-156.
28. Leite Marques Y. F. M., Silva Melo L. M. C., Amorim Neves R. C., Freire E. A., Jorge D. M., Grangeiro T. B., Benevides N. M. B. Purification of a lectin fro the marine red alga Gracilaria ornata and its effect on the development of the cowpea weevil Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae). Biochimica et Biophysica Acta 2005; p. 137-145.
29. Liao W.R., Lin J.Y. & Huang R. Antibiotic activity of Lectins from marine algae against marine vibrios. Microbiol Biotechnol 2003; 30:433-439.
30. Lis H., Sharon N. Lectins as molecules and as tools. Annu Rev Biochem, 1986; 55:35-67.
31. Neish, I.C. and SuriaLink.com. The ABC of Eucheuma Seaplant Production: Agronomy, Biology and Crop - handling of Betaphycus, Eucheuma and Kappaphycus. Marine Botanicals 2003.
32. Ofek I., Beachey E.H. Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli. Infect Immun 1987; 22(1):247–54.
33. Peumans, W.J. and Van Damme, E. J. The role of lectins in plant defence. Histochem. J 1995, 27:253-271.
34. Rogers D.J. and Fish. Marine algal lectins. Lectin Reviews, 1991;1:129-42. 35. Ron J. D. and Slifkin. Methods in enzymology. Academic Press, 1997; 310:145-151.
36. Ryan K.J., Ray C.G. Sherris Medical Microbiology 2004.
37. Sato Y., Morimoto K., Hirayama M., Hori K. High mannose-specific lectin (KAA-2) from the red alga Kappaphycus alvarezii potently inhibits influenza virus infection in a strain-independent manner. Biochemical and Biophysical Research Communications 2011; 405:291-296.
38. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Sakaguchi T, Nishizono A, Hirayama M, Hori K. Entry Inhibition of Influenza Viruses with High Mannose Binding Lectin ESA-2 from the Red Alga Eucheuma serra through the Recognition of Viral Hemagglutinin. Mar. Drugs 2015; 13:3454-3465.
39. Sharon N., Lis H. Lectins. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands 2003. 40. Souza, J.B. In vitro inhibition of oral streptococci binding to the acquired pellicle by algal lectins. Journal of applied Microbiology 2007;103:1001-6.
41. Stelio R.M.O., Antonia E. N., Maria. E. P. L., Yaskara F. M. M. L. and Norma M. B. B. Purification and characterization of a lectin from the red alga Pterocladiella capillacea (S. G. Gmel.) Santel. & Hommers. Revista Brasil. Bol 2002; 25(4):397-403.
42. Sudhir Kumar, Urmila Barros. Isolation of human erythrocyte agglutinins from marine algae. Journal of Natural Pharmaceuticals 2012;vol.1, Issue 1:51-54.
43. Sugahara T., Ohama Y., Fukyda A., Hayashi M., Kawakubo A., Kato K. The cytotoxic effect of Eucheuma serra agglutinin (ESA) on cancer cells and its application to molecular probe for drug delivery system using lipid vesicles. Cytotechnology 2001; 36:93-99.
Tài liệu Internet
PHỤ LỤC
Bảng 2.1. Giá trị OD750nm tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml)
OD750nm Nồng độ BSA (µg/mL) OD1 OD2 OD3 OD 20 0,095 0,098 0,097 0,097 40 0,164 0,163 0,165 0,164 60 0,226 0,226 0,227 0,226 80 0,264 0,264 0,263 0,264 100 0,322 0,321 0,321 0,321 120 0,384 0,386 0,385 0,385
Bảng 2.2. Giá trị Rf và lg M của protein trong thang chuẩn
Khối lượng phân tử M (Da)
Khoảng cách di chuyển của vạch
protein D (cm) Rf lgM 55.000 1,8 0,286 4,470 36.500 2,4 0,381 4,562 29.000 3,1 0,492 4,462 20.100 4,0 0,635 4,303 14.300 4,7 0,746 4,155 6.500 5,6 0,889 3,813
Bảng 3.9. Kết quả đo OD280nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi sắc lọc gel trên cột nhựa Sephadex-75
STT OD280nm Hoạt độ NKHC STT OD280nm Hoạt độ NKHC 1 0,01 0 14 0,348 128 2 0,019 0 15 0,249 64 3 0,045 0 16 0,118 32 4 0,084 0 17 0,056 8 5 0,078 0 18 0,032 4 6 0,045 0 19 0,020 2 7 0,031 0 20 0,005 0 8 0,029 0 21 0,003 0 9 0,031 2 22 0,002 0 10 0,035 4 23 0,003 0 11 0,037 8 24 0,002 0 12 0,058 16 25 0,000 0 13 0,098 32
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ E.
denticulatum Hoạt độ NKHC Nhiệt độ (oC) % HU/mL 20 100 29 30 100 29 40 100 29 50 100 29 60 50 28 70 25,5 27 80 0 0 90 0 0 100 0 0
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ E. denticulatum Hoạt độ NKHC pH % HU/mL 3 100 29 4 100 29 5 100 29 6 100 29 7 100 29 8 100 29 9 100 29 10 100 29
Danh mục một số thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu
Máy ly tâm