1.4.1 Các kỹ thuật chiết tách lectin
Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein nên dễ tan trong nước. Vì vậy, việc chiết tách lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất. Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết khác nhau như: dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%, dung dịch muối CaCl2 0,1M, dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl,…
1.4.1.1. Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính
Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại. Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị I, anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2SO4,... Các protein khác nhau được kết tủa ở những nồng độ muối bão hòa khác nhau. Người ta sử dụng phương pháp kết tủa bằng muối trung tính trong các quy trình chiết tách lectin để cô đặc dung dịch protein cần tách.
1.4.1.2. Kết tủa phân đoạn bằng dung môi
Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong nước như: acetone, polyetylenglycol, ethanol,… làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể bị kết tủa nhanh chóng. Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất dễ gây biến tính protein. Vì vậy, việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp.
1.4.1.3. Thẩm tích
Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phân tử lớn hơn kích thước màng (kDa). Thẩm tích thường dùng để loại muối và những phân tử nhỏ không phải protein ra khỏi dung dịch chứa lectin cần làm sạch. Trong quá trình tinh sạch lectin, thẩm tích là một trong những công đoạn quan trọng giúp loại bỏ những tạp chất không phải lectin trong dịch chiết thô để tạo điều kiện thuận lợi cho những công đoạn tinh chế tiếp theo. Tuy nhiên, để thực hiện quá trình thẩm tích hiệu quả cần phải nghiên cứu xác lập được điều kiện tối ưu để thực hiện quá trình thẩm tích đạt hiệu quả.
1.4.2. Các kỹ thuật tinh chế lectin 1.4.2.1. Sắc ký lọc gel 1.4.2.1. Sắc ký lọc gel
Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thước phân tử. Nhựa thường được sử dụng là Sephadex với kích thước hạt khác nhau phụ thuộc vào bản chất lectin cần tinh chế. Mỗi hạt Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp. Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ xốp khác nhau. Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có kích thước phân tử khác nhau.
Nguyên lý chung của kỹ tinh sạch các chất bằng sắc ký lọc gel đó là dựa vào khối lượng phân tử, kích thước của các hạt khác nhau khi đi qua cột sắc ký có chứa các hạt gel sẽ được tách ra ở những thời gian khác nhau khi đi qua cột. Các chất có khối lượng phân tử và kích thước lớn thường ra khỏi cột trước, các chất có kích thước và khối lượng phân tử nhỏ hơn sẽ đi ra cột sau. Dựa vào đặc điểm này để thu được các phân đoạn có chứa các chất khác nhau.
Sephadex G-75 và Sephadex G-100 thường được sử dụng trong tinh chế các chất có hoạt tính sinh học, trong đó có lectin. Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân tử của chất cần tách.
1.4.2.2. Sắc ký trao đổi ion
Lectin có bản chất là protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tùy thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm. Lợi dụng tính chất này người ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như: DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE- trisacryl,… được sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl,… được sử dụng làm chất trao đổi cation. Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi. Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định.
1.4.2.3. Sắc ký ái lực
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là phối tử (ligand) được gắn vào một chất giá tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất giá được sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel,… Quá trình thực hiện sắc ký ái lực được tiến hành qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: Việc lựa chọn chất kết hợp có ái lực
đặc hiệu với protein cần tách có ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của protein cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa protein và chất kết hợp. Trong các thí nghiệm tinh chế lectin người ta thường lựa chọn các chất đường, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đường có ái lực hóa học với một lectin nhất định.
- Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái lực với
cột. Các protein có ái lực với cột cần được tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột.
- Giai đoạn 3: Rửa giải lectin ra khỏi cột. Cần phải dùng một dung dịch giải
hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột.
Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy, gradient nồng độ,...
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Mẫu rong đỏ Eucheuma denticulatum được thu tại vùng biển Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa trong 3/2014. Tất cả mẫu rong được thu hái một cách cẩn thận theo một thủ tục chuẩn đã được thiết lập từ trước, loại bỏ các tạp chất và rong lạ. Rong đuợc rửa sạch bằng nước ngọt để loại bỏ tạp chất, được bao gói trong các túi PA và được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Hồng cầu của máu thỏ, cừu, ngựa và gà do Viện Vaccine, Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa cung cấp. Hồng cầu thuộc các nhóm máu A, B, O ở người được cung cấp từ Bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa. Thủ tục lấy mẫu, xử lý mẫu và bảo quản theo các quy trình nghiêm ngặt tại Viện Vaccine và Bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa. Mẫu hồng cầu được bảo quản theo đúng tiêu chuẩn mẫu nghiên cứu và nhanh chóng được vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành các phân tích tiếp theo. Trong quá trình thực hiện các phân tích, các mẫu hồng cầu được bảo quản tại phòng thí nghiệm theo đúng quy định.
2.1.2. Hóa chất
Các loại đường và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose, L-fucose, D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D-galactoside, p- nitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-D-mannoside, laminaran, transferrin, fetuin, porcine thyroglobulin và procine stomach mucin; Yeast mannan mua từ hãng Merck (Đức). Sephadex G -75 mua của hãng Pharmacia, Uppsala, Thụy Điển. Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích.
2.1.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:
- Máy đo quang phổ khả biến UV-Vis (6405 UV/VIS, Jenway, England) - Máy ly tâm (Z36HK, Hermel, Germany)
- Máy ly tâm eppendrof (541R, Eppendorf, Germany) - Máy đo pH (827 pH Lab, Metrohm, Swissland) - Bể ổn nhiệt (B12, Heraeus, Germany)
- Hệ thống sắc ký lọc gel (GPC 2414, Waters, USA) - Thiết bị điện di đứng (AJ 6530, Atto, Japan)
- Tủ đông, tủ lạnh bảo quản mẫu trong quá trình nghiên cứu
- Các dụng cụ, thiết bị khác: Phễu chiết, ống nghiệm test, bình tam giác, ống đong, bình định mức, micropipette,…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu cổ điển được áp dụng để xác định các thông số phù hợp cho quá trình chiết và tinh sạch nhằm thu được dịch chiết lectin có hoạt tính cao nhất.
2.2.1. Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu
Hồng cầu được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của lectin là hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin.
Cách thức xử lý như sau: Máu động vật và người được rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch NaCl 0,85%. Sau khi rửa, huyền phù hồng cầu 2 % (v/v) được chuẩn bị bằng cách thêm dung dịch NaCl 0,85 % thành 100mL và được xem như hồng cầu tự nhiên.
Đối với hồng cầu được xử lý bằng enzyme: 1/10 thể tích của dung dịch enzyme trypsin hoặc papain 0,5% được cho vào huyền phù hồng cầu và hỗn hợp được giữ ấm ở 37oC trong 60 phút. Sau khi giữ ấm, huyền phù được rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch NaCl 0,85%, và huyền phù của hồng cầu 2% đã được xử lý enzyme được chuẩn bị trong dung dịch muối NaCl 0,85%.
Tiến hành:
- Cho 25µL NaCl 0,85% vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V.
- Thêm 25µL mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngưng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha là 1/2n (n: số lần pha loãng).
- Tiếp tục cho 25µL hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng. - Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.
Đọc kết quả
- Kết quả âm tính: tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ. - Kết quả dương tính: hồng cầu trong giếng bị ngưng kết hơn 50%.
Hình 2.1. Hình ảnh hiện tượng ngưng kết hồng cầu
Đơn vị hoạt độ
01 đơn vị hoạt độ lectin hay 01 đơn vị hoạt độ NKHC trên 1mL (HU/mL) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng.
Hoạt độ lectin được xác định theo 2 chỉ số:
- Hoạt độ tổng (Utổng): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất
định. Đơn vị: HU
Utổng = V. 2n
Trong đó: V: tổng thể tích (mL) n: số lần pha loãng
- Hoạt độ riêng (Uriêng): là số đơn vị hoạt độ lectin có trong 1mg protein. Đơn
vị: HU/mg
Utổng
Uriêng =
Protein tổng
Trong đó: Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính. Proteintổng: tổng hàm lượng protein.
Dương tính
2.2.2. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm 1951 [4], dùng Albumin huyết thanh bò (BSA - Bovine serium albumin) làm chất chuẩn.
Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein cần phân tích.
Hóa chất
Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20 g Na2CO3 (2%) pha trong 1.000mL nước cất. Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%). Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi sử dụng). Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng.
Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL.
Xây dựng đồ thị chuẩn
Cân 10mg BSA hòa tan trong 10mL nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng độ 1mg/mL. Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120µg/mL để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
Lấy chính xác 0,5mL dịch chứa BSA với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, bổ sung vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25mL thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 750nm.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường. Kết quả được trình bày trong Bảng 2.1 (phần Phụ lục).
Hình 2.2. Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry
Mẫu thí nghiệm
Lấy 0,5mL dịch protein cần kiểm tra và tiến hành bổ sung các hóa chất như đã nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính giá trị protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình.
2.2.3. Quy trình tổng quát dự kiến chiết lectin từ rong đỏ E. denticulatum
Để quá trình chiết đạt hiệu quả cao và thu được lectin có hoạt tính cao thì việc khảo sát các điều kiện chiết lectin là cần thiết. Do đó, quy trình dự kiến để tách chiết và tinh sạch lectin từ rong đỏ E. denticulatum như sau:
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tổng quát chiết lectin từ rong đỏ E. denticulatum
Giải thích quy trình:
-Nguyên liệu: Rong đỏ Eucheuma denticulatum được thu tại vùng biển Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa.
-Xử lý nguyên liệu: Rong sau khi đem về phòng thí nghiệm sẽ được rửa bằng nước ngọt để loại bỏ các tạp chất dính trên rong. Sau đó, rong được đem xay nhỏ trong môi trường Nitơ lỏng bằng cối xay inox. Nitơ lỏng vừa giúp tăng hiệu quả của quá trình xay rong, cũng như tạo môi trường lạnh giúp các protein không bị biến tính.
Điều kiện chiết:
- Dung môi, nồng độ dung môi chiết. - Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi.
- Thời gian chiết. - Nhiệt độ chiết. Nguyên liệu rong đỏ
E. denticulatum Rửa sạch, giữ -20oC Xay nhỏ Chiết lectin Tỷ lệ dịch chiết/dung môi Kết tủa lectin Ly tâm Lọc, loại bã Thẩm tích Sắc ký lọc gel G-75 Lectin
Rong sau khi xay sẽ được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng. Mục đích của quá trình xay là giúp phá vỡ cấu tạo thành tế bào của rong, giúp cho quá trình chiết lectin được dễ dàng.
-Chiết: Rong sẽ được tiến hành chiết với loại dung môi với thời gian, tỷ lệ và nhiệt độ phù hợp. Mục đích của quá trình chiết làm cho lectin trong rong hòa tan vào dung môi bằng các điều kiện thích hợp cho phép thu nhận được lượng lectin cao nhất.
-Lọc: rong sau khi chiết sẽ được lọc qua rây lọc để loại bã thu dịch chứa lectin. Sau khi lọc qua rây sẽ tiến hành ly tâm 6.000 vòng/10 phút để loại được hết cặn còn lại trong dịch chiết.
-Kết tủa dịch lectin: Sử dụng dung dịch ethanol để kết tủa lectin trong dịch chiết.
-Ly tâm thu tủa: Tốc độ 8.000 vòng/phút, nhiệt độ 4C trong 15 phút để thu tủa, loại bỏ dịch trong.
-Thẩm tích kết tủa: Sử dụng dung môi chiết với lượng ít nhất hòa tan hết kết tủa. Sau đó mang đi thẩm tích với kính thước màng loại 10 kDa, thời gian 16 giờ, nhiệt độ 4C.
-Ly tâm thu dịch trong: Dịch sau thẩm tích được ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút trong 15 phút để loại cặn, thu phần dịch trong, đây chính là chế phẩm lectin kỹ thuật.
-Chế phẩm lectin kỹ thuật được cô đặc để chạy sắc ký thu các phân đoạn có chứa lectin.
2.2.4. Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong đỏ E. denticulatum Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách