3.1.1. Tỷ lệ dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong đỏ E. denticulatum bằng dung dịch đệm phosphate (PBS 0,05M + 0,85% NaCl) với các tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) là: 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:12 và 1:14, ở nhiệt độ 4oC, thời gian chiết 3 giờ. Sau đó ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu được DC. Xác định HĐTS và HĐR của lectin từ DC thu được. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1, Hình 3.1 và Hình 3.2.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin
Tỉ lệ chiết Thể tích
(ml) HĐTS (HU) Protein tổng số (mg) HĐR (HU/mg)
1:2 6,5 104 10,53 9,88 1:4 15 480 13,2 36,36 1:6 26 832 17,68 47,06 1:8 35,5 1.136 21,3 53,33 1:10 45,5 728 22,75 32 1:12 55,5 444 23,31 19,05 1:14 65,5 262 22,27 11,76
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐR của lectin
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết có ảnh hưởng đáng kể đến HĐTS và HĐR của lectin. Cụ thể, khi tăng tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết từ 1:2 đến 1:8 thì HĐTS và HĐR của lectin đều tăng theo và đạt giá trị tối đa ở tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết là 1:8 với giá trị của HĐTS và HĐR thu được lần lượt là 1.136 HU và 53,33 HU/mg protein. Tuy nhiên, vượt quá giới hạn này thì HĐTS và HĐR lại có xu hướng giảm (ở tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết 1:14, HĐTS và HĐR chỉ còn 262 HU và 11,76 HU/mg protein)
Sở dĩ khi tăng tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết thì HĐTS và HĐR tăng theo là do có sự chênh lệch về gradient nồng độ giữa lectin trong nguyên liệu so với lectin có trong môi trường chiết. Vì vậy, lượng lectin chiết được sẽ tăng (theo định luật Fick). Tuy nhiên khi đạt được lượng lectin chiết tối đa, nếu tiếp tục tăng lượng dung môi chiết có thể sẽ không hiệu quả vì khi đó một lượng protein không mong muốn cũng sẽ khuếch tán ra ngoài và làm ảnh hưởng đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của dịch chiết. Mặt khác, khi lượng dung môi chiết quá nhiều sẽ có thể dẫn đến sự khó khăn trong quá trình chiết, tách và thu nhận dịch chiết.
Theo kết quả nghiên cứu của Shudong và cộng sự năm 2013 về tách chiết lectin từ hạt đậu Phaseolus vulgaris chỉ ra rằng tỷ lệ nguyên liệu : dung môi cũng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chiết lectin và hiệu quả chiết lectin tối đa đạt được ở tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:8.
Vì vậy, dựa vào kết quả đạt được cũng như các phân tích trên cho thấy, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết là 1:8 (w/v) thích hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Loại dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E. denticulatum trên 3 loại dung môi chiết gồm: nước cất, đệm phosphate (PBS 0,05M + 0,85% NaCl) và ethanol 30% với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) là 1:8, nhiệt độ chiết 4oC và thời gian chiết 3 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu được DC. Xác định HĐTS và HĐR của từng DC. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.2, Hình 3.3 và Hình 3.4.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin
Dung môi Thể tích (ml) HĐTS (HU) Protein tổng số (mg) HĐR (HU/mg)
Nước cất 35 560 16,8 33,33
PBS 0,05M 35 1.120 22,4 50
Ethanol
30% 35 1.120 20,3 55,17
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các loại dung môi chiết đến HĐR của lectin
Kết quả nghiên cứu từ Hình 3.3 và Hình 3.4 cho thấy dung môi chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính của lectin. Theo đó, HĐTS và HĐR của lectin thu được từ dung môi chiết PBS 0,05M và ethanol 30% không có sự khác biệt đáng kể và những giá trị này đều cao hơn so với nước cất. HĐTS và HĐR của lectin đạt được đối với dung môi chiết PBS 0,05M, ethanol 30% và nước cất lần lượt là 1.120 HU và 50 HU/mg protein; 1.120 HU và 55,17 HU/mg protein; 560 HU và 33,33 HU/mg protein.
Ảnh hưởng của các loại dung môi chiết khác nhau đến hoạt tính của lectin có thể được lý giải là do sự khác nhau về độ phân cực của các dung môi sử dụng. Nhìn chung, các hợp chất có độ phân cực cao sẽ được chiết hiệu quả bằng dung môi có độ phân cực cao và ngược lại. Trong trường hợp này nước có độ phân cực cao nhất với hằng số điện môi ( = 83), PBS 0,05M và ethanol 30% có độ phân cực thấp hơn. Kết quả nghiên cứu này cho thấy lectin được chiết hiệu quả hơn trong dung môi có độ phân cực thấp hiệu quả hơn là trong dung môi có độ phân cực cao. Ngoài ra, việc lựa chọn dung môi chiết thích hợp cần cân nhắc nhiều yếu tố: hiệu quả chiết, tính an toàn, khả năng tái sử dụng,… Dung môi ethanol là một trong những dung môi khá phổ biến, đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền, an toàn và đặc biệt là khả năng tái sử dụng cao của nó. Dựa vào các đặc điểm trên, tác giả chọn dung môi chiết lectin từ nguyên liệu rong đỏ E.
3.1.3. Nồng độ ethanol chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong đỏ E. denticulatum với dung môi ethanol ở nhiều nồng độ khác nhau, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) là 1:8, nhiệt độ chiết 4oC và thời gian chiết 3 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu được DC. Xác định HĐTS và HĐR của từng DC. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả của quá trình chiết lectin từ rong đỏ E. denticulatum được chỉ ra trong Bảng 3.3, Hình 3.5 và Hình 3.6.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến HĐTS và HĐR của lectin
Nồng độ
ethanol Thể tích (ml) HĐTS (HU) Protein tổng số (mg) HĐR (HU/mg)
0% 35 560 16,8 33,33 10% 35 560 17,5 32 20% 35 1.120 18,9 59,26 30% 35 1.120 20,3 55,17 40% 35 1.120 23,8 47,06 50% 35 560 25,9 21,62 60% 35 280 26,6 10,53
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến HĐR của lectin
Kết quả từ Hình 3.5 và Hình 3.6 cho thấy, khi tăng dần nồng độ ethanol từ 0% (được hiểu là nước cất) đến 20% thì hoạt độ NKHC của DC cũng tăng lên, ở nồng độ ethanol 20% thì HĐTS và HĐR đều đạt cực đại (1.120 HU; 59,26 HU/mg). Nếu tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 40% thì HĐTS không thay đổi, trong khi đó HĐR lại có xu hướng giảm dần. Ở mức nồng độ ethanol 50, 60% thì HĐTS và HĐR bắt đầu giảm mạnh và xuống thấp nhất ở nồng độ ethanol 60% (280 HU; 10,53 HU/mg).
Ở nồng độ ethanol thấp (0 - 10%), protein lectin không có khả năng khuếch tán ra bên ngoài; trong khi đó ở nồng độ ethanol quá cao (50, 60%) sẽ làm protein lectin bị biến tính, giảm khả năng NKHC của lectin.
Dựa vào các kết quả đạt được trong nghiên cứu này, tác giả chọn dung môi chiết lectin thích hợp là ethanol 20% để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4. Thời gian chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong đỏ E. denticulatum với các khoảng thời gian khác nhau: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 (giờ) bằng dung môi ethanol 20%, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) 1:8 và nhiệt độ chiết 4oC. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Xác định HĐTS và HĐR của từng DC.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS và HĐR của lectin
Thời gian
(giờ) Thể tích (ml) HĐTS (HU) Protein tổng số (mg) HĐR (HU/mg)
1 35 560 18,2 30,77 2 35 560 11,9 47,06 3 35 1.120 16,8 66,67 4 35 2.240 25,9 86,49 5 35 2.240 27,3 82,05 6 35 2.240 28,7 78,05 7 35 2.240 29,4 76,19 8 35 2.240 30,8 72,73 9 35 1.120 32,2 34,78
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS của lectin
Thời gian chiết là một trong những thông số cơ bản đối với các quá trình chiết các hợp chất sinh học nói chung từ vật liệu. Trong nghiên cứu này, thời gian chiết lectin có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chiết lectin từ rong E. denticulatum (Bảng 3.4, Hình 3.7 và Hình 3.8). Kết quả cho thấy rằng hiệu quả chiết lectin tăng cùng với thời gian chiết và đạt giá trị cao nhất ứng với thời gian chiết là 4 giờ. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian chiết trong khi vẫn giữ nguyên các điều kiện chiết khác thì hiệu quả chiết lectin không tăng đáng kể, thậm chí nếu thời gian kéo quá dài (đến 9 giờ) thì hiệu quả chiết lectin giảm rõ rệt. Giá trị của HĐTS và HĐR của lectin ứng với thời gian chiết 4 giờ lần lượt là 2.240 HU và 86,49 HU/mg protein.
Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu quả chiết lectin có thể được lý giải dựa vào định luật Fick về tốc độ khuếch tán của vật chất. Theo định luật này, lượng vật chất được khuếch tán ra môi trường chiết tỷ lệ thuận với thời gian chiết. Tuy nhiên, hiệu quả chiết chỉ thích hợp trong một khoảng thời gian thích hợp nếu kéo dài quá thời gian giới hạn thì có thể dẫn đến một số các hợp chất không mong muốn cũng được khuếch tán ra môi trường.
Dựa vào các kết quả đạt được trong nghiên cứu này, tác giả chọn thời gian thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ E.denticulatum là 4 giờ để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.5. Nhiệt độ chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong đỏ E.denticulatum với các nhiệt độ khác nhau: 4, 10, 20, 30, 40 (oC) bằng ethanol 20%, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) 1:8, thời gian chiết 4 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Xác định HĐTS và HĐR của từng DC. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5, Hình 3.5 và Hình 3.10.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến HĐTS và HĐR của lectin
Nhiệt độ
(oC) Thể tích (ml) HĐTS (HU) Protein tổng (mg) HĐR (HU/mg)
4 35 2.240 25,2 88,89
10 35 2.240 25,9 86,49
20 35 2.240 28 80
30 35 2.240 28,7 78,05
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến HĐTS của lectin
Kết quả nghiên cứu cho thấy rõ ràng rằng khi tăng nhiệt độ chiết từ 4oC lên 40 o
C (tăng 10 lần) nhưng HĐTS của lectin gần như không thay đổi với giá trị xấp xỉ 2.240 HU. Ngược lại, HĐR lại có xu hướng giảm đáng kể từ 88,89 HU/mg protein (4oC) xuống còn 76,19 HU/mg protein (40oC). Điều này có thể được lý giải là bởi vì nhiệt độ là một trong những nhân tố ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính của protein. Nhiệt độ càng cao thì mức độ ảnh hưởng đến hoạt tính protein càng lớn. Hơn nữa, khi tăng nhiệt độ chiết từ 4oC lên 40oC thì hiệu quả chiết các chất hòa tan từ nguyên liệu ra môi trường chiết tăng lên (theo định luật Fick) trong đó có cả các protein tạp (không phải lectin) cũng được chiết ra ngoài vật liệu. Vì vậy, dẫn đến HĐR của lectin bị giảm. Với mục đích xác định được nhiệt độ chiết thích hợp để thu được lectin có hoạt tính cao, tác giả chọn nhiệt độ chiết là 4oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Như vậy, sau khi khảo sát một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình chiết lectin từ rong E. denticulatum như đã được trình bày ở trên (Mục 3.5.1, 3.5.2, 3.5.3, 3.5.4 và 3.5.5), tác giả chọn quá trình chiết lectin với các điều kiện chiết như sau:
- Dung môi chiết: ethanol 20%
- Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v): 1:8 - Thời gian chiết: 4 giờ
- Nhiệt độ chiết: 4oC
Sử dụng các thông số chiết đã được xác định ở trên để thực hiện các nghiên cứu tinh sạch lectin từ rong E. denticulatum.
3.2. Tinh chế lectin
3.2.1. Khảo sát các tác nhân kết tủa để thu chế phẩm lectin kỹ thuật 3.2.1.1. Khảo sát nồng độ ammonium sunfate (NH4)2SO4 3.2.1.1. Khảo sát nồng độ ammonium sunfate (NH4)2SO4
Tiến hành kết tủa lectin ở các nồng độ ammonium sunfate % bão hòa khác nhau: 60, 65, 70, 75, 80, 85 và 90% ở nhiệt độ tủa 4oC, thời gian tủa 4 giờ. Thu nhận kết tủa bằng cách ly tâm dịch sau tủa ở 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 30 phút, sau đó hòa với dung dịch đệm phosphate để đưa về cùng thể tích 2mL, thẩm tích trong dung dịch đệm để loại muối. Kết quả xác định HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của chế phẩm lectin kỹ thuật được trình bày trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ % bão hòa (NH4)2SO4 đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin
Nồng độ % bão hòa (NH4)2SO4 (%) Hoạt độ tổng số (HU) Hoạt độ riêng (HU/mg)
Hiệu suất thu hồi (%) 60 64 25,6 2,9 65 128 47,4 5,8 70 256 73,1 11,6 75 512 123,9 23,2 80 1.024 145,7 45,7 85 512 98,5 23,2 90 256 47,4 11,6 DC lectin thô 2.240 89,2 100
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ muối bão hòa từ 60% đến 80% thì HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi đều tăng dần lên và đạt cực đại tại nồng độ muối bão hòa là 80% (1.024 HU; 145,7 HU/mg; 45,7 %). Nếu tiếp tục tăng nồng độ % bão hòa lên 85%, 90% thì HĐTS và HĐR đều giảm xuống (512 HU; 98,5 HU/mg) và (256 HU; 47,4 HU/mg), hiệu suất thu hồi cũng chỉ đạt 23,2% và 11,6%.
Vì vậy, đối với tác nhân tủa là (NH4)2SO4 thì nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa 80% sẽ cho hiệu quả tốt nhất so với các nồng độ muối bão hòa khác.
3.2.1.2. Khảo sát nồng độ ethanol để kết tủa lectin
Tiến hành kết tủa lectin bằng ethanol với tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) lần lượt là: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 ở nhiệt độ tủa 0oC, thời gian tủa 4 giờ. Thu nhận kết tủa bằng cách ly tâm dịch sau tủa ở 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 30 phút, sau đó hòa với dung dịch đệm phosphate để đưa về cùng thể tích 2ml. Kết quả xác định HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của chế phẩm lectin kỹ thuật được trình bày trong Bảng 3.7
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết/ethanol đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin
Tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) Hoạt độ tổng số (HU) Hoạt độ riêng (HU/mg)
Hiệu suất thu hồi (%) 1:1 64 37,6 2,9 1:2 128 44,2 5,7 1:3 256 50,2 11,5 1:4 1.024 150,6 45,7 1:5 1.024 120,5 45,7 DC lectin thô 2.240 89,2 100
Từ kết quả Bảng 3.7 cho thấy, khi tăng thể tích ethanol sử dụng (tỷ lệ DC : ethanol (v/v) từ 1:1 đến 1:4) thì HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi lectin tăng dần và cả 3 giá trị này đều đạt cực đại ở tỷ lệ 1:4 (1.024 HU; 150,6 HU/mg; 45,7%). Tuy nhiên, nếu tăng thế tích ethanol sử dụng lên cao hơn (tỷ lệ DC : ethanol (v/v) 1:5) thì hoạt độ riêng của lectin lại giảm xuống đáng kể (120,5 HU/mg). Vậy đối với tác nhân tủa là ethanol thì tỷ lệ dịch chiết : ethanol (v/v) 1:4 là cho kết quả tốt nhất.
3.2.1.3. So sánh khả năng tủa thu chế phẩm kỹ thuật của các tác nhân
Thí nghiệm với các tác nhân tủa (NH4)2SO4 và ethanol được tiến hành trong cùng điều kiện với cùng thể tích và cùng độ pha loãng. Do đó, có thể so sánh kết quả của các tác nhân khác nhau. Ở đây, ta so sánh các kết quả tủa (NH4)2SO4 80% độ bão hòa và dịch chiết : ethanol (v/v) 1:4.
Để thuận tiện cho việc đánh giá hiệu quả tinh sạch bằng phương pháp kết tủa với các tác nhân tủa khác nhau, tác giả đã tóm tắt kết quả ở Bảng 3.8, Hình 3.11 và Hình 3.12.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin
Tác nhân tủa Hoạt độ tổng (HU)
Hoạt độ riêng (HU/mg)
Hiệu suất thu hồi (%)
(NH4)2SO4 80% 1.024 145,7 45,7
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến HĐTS và hiệu suất thu hồi của CPKT từ DC rong đỏ E. denticulatum
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến HĐR và hiệu suất thu hồi của CPKT từ DC rong đỏ E. denticulatum
Kết quả từ Bảng 3.8, Hình 3.11 và Hình 3.12 và cho thấy với 2 tác nhân tủa là (NH4)2SO4 và ethanol, thì mặc dù HĐTS và hiệu suất thu hồi bằng nhau (1.024 HU,
45,7 %), nhưng HĐR của CPKT khi tủa bằng ethanol là 150,6 (HU/mg) cao hơn so với (NH4)2SO4 là 145,7 (HU/mg).
Mặt khác, sử dụng ethanol làm tác nhân tủa thì giá thành rẻ, quá trình thu CPKT đơn giản, có thể thu hồi lượng ethanol để tái sử dụng, sẽ giảm đáng kể chi phí sản xuất.