Nguyên tắc
Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những chất có kích thước lớn đi len lõi ở bên ngoài các hạt gel, di chuyển nhanh và ra ngoài trước. Trong khi đó những phân tử có kích thước nhỏ thì chui vào bên trong lỗ gel nên di chuyển chậm, ra khỏi cột sau.
Các thông số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel được thiết lập như sau:
- Gel: Sephadex G-75
- Kích thước cột: đường kính 1 cm, chiều cao 30 cm. - Đệm: PBS 0,05M pH 7 (đã loại khí)
- Thể tích mẫu: 1mL - Tốc độ dòng: 1mL/phút
- Thể tích mỗi phân đoạn: 1mL/phân đoạn - Số lượng phân đoạn: 25 phân đoạn
Thực hiện
Dụng cụ, thiết bị
- Cột sắc ký đã được rửa bằng HNO3 50% rồi rửa sạch lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng acetone và đem sấy khô.
- Ống nghiệm: sử dụng 25 ống nghiệm đã rửa sạch bằng nước cất và sấy khô.
Hóa chất
-Gel Sephadex G-75: ngâm 1,5g gel trong một lượng thừa dung dịch NaN3 0,02% trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Gel sau khi ngâm sẽ được rửa sạch bằng nước cất và nhồi vào cột. Gel cho vào cột phải liên tục để tránh hiện tượng phân lớp.
-Dung dịch đệm acetate sodium 0,05N.
-Hóa chất phân tích để xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry. -Hóa chất xác định hoạt độ NKHC.
Tiến hành
-Nhồi gel: Gel sau khi ngâm sẽ được nhồi vào cột gel. Nhồi gel liên tục để tránh hiện tượng phân lớp và bọt khí. Sau khi gel đã ổn định trong cột thì rửa cột bằng dung dịch đệm acetate 0,05N. Khi cột đã cân bằng trong dung dịch đệm (sau 24 giờ) thì có thể bắt đầu quá trình lọc gel.
-Hút 1mL dịch đã được kết tủa rồi cho vào cột gel. Khi đó, nồng độ protein cho vào cột khoảng 1mg/mL. Chú ý rằng, khi đưa mẫu vào không nên gây xáo trộn gel nhồi trong cột và tránh tạo bọt khí.
-Đưa mẫu vào thời điểm dung môi hạ xuống ngang bề mặt cột gel. Khi mẫu đã ngấm xuống thì mở vòi để dung môi chảy vào cột với lưu lượng định sẵn. Tốc độ chảy khoảng 1mL/phút. Sau đó, đặt ống nghiệm vào vị trí sẵn sàng rồi mở van để hứng dung dịch chảy qua cột. Trong mỗi thí nghiệm, thu lấy 25 phân đoạn. Mỗi phân đoạn có thể tích 1mL.
- Các phân đoạn thu được lần lượt được tiến hành đo OD ở bước sóng 280 nm và hoạt tính NKHC. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa các giá trị OD và hoạt tính của các phân đoạn, ghi nhận giá trị các peak tạo thành.
- Các phân đoạn có hoạt độ NKHC cao được thu lại, cô đặc bằng màng siêu lọc Amicon PM-10 (kích cỡ màng loại 10 kDa) và tiến hành xác định hàm lượng protein và hoạt độ NKHC.
- Hình 2.11 là hệ thống cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 để thực hiện quá trình tinh sạch lectin từ dịch chiết lectin thô.
Hình 2.11. Hệ thống cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75