Đề cương Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu, liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch. Lectin giữ vai trò quan trọng như là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tế bào với tế bào vì chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào. Những đặc tính này làm cho lectin trở thành một công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứu miễn dịch học, hóa sinh, sinh học tế bào, xác định và phát hiện nhóm máu, nghiên cứu tế bào ung thư…[77]. Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứng dụng của lectin từ rong biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [23,24]. Các nghiên cứu về lectin từ rong biển cho thấy đặc tính của những lectin này có nhiều khác biệt so với lectin từ thực vật bậc cao. Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp, tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực với glycoprotein (đặc biệt là các glycoprotein từ động vật) và thuộc nhóm protein rất bền nhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II [43]. Với những tính chất ưu việt trên, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng của chúng trong tương lai. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển khoảng 3260km, với hơn 1000 loài rong biển đã được tìm thấy. Trong đó, đã xác định được 151 loài thuộc ngành rong Lục (Chlorophyta), 269 loài thuộc ngành rong Đỏ (Rhodophyta), 143 loài thuộc ngành rong Nâu (Phaeophyta) và 76 loài thuộc ngành rong Lam (Cyanophyta) [58]. Đây là nguồn vật liệu vô cùng phong phú cung cấp cho việc nghiên cứu, điều chế những hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lectin. Với kết quả khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 80 loài rong biển thuộc vùng biển Ninh Thuận và Khánh Hòa từ năm 2009 đến 2011, chúng tôi nhận thấy, hơn 90% dịch chiết từ rong được khảo sát cho thấy sự hiện diện lectin. Chúng có khả năng làm ngưng kết với ít nhất một trong các loại hồng cầu được thử nghiệm. Trong đó, dịch chiết từ rong Eucheuma denticulatum thuộc dòng rong Đỏ cho hoạt tính ngưng kết hồng cầu mạnh nhất với cả hồng cầu thỏ và hồng cầu cừu [44, 45]. Đồng thời, loài 2 rong này cũng đã và đang được trồng phổ biến ở các vùng khác nhau thuộc tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận. Với những kết quả khảo sát sơ bộ và cơ sở nêu trên, đề tài được thực hiện “Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng”. 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu điều kiện tối ưu để thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum. Nội dung nghiên cứu • Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thu nhận lectin. • Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75. • Đánh giá các đặc tính của lectin thu nhận được. • Đánh giá khả năng của lectin kháng một số vi khuẩn gây độc cho người. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến của đề tài: Đề tài "Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng” không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học, nhằm khai thác một hợp chất hoạt tính sinh học mới từ rong biển để sử dụng làm thuốc thử chẩn đoán một số vi khuẩn gây bệnh cho người, mà còn góp phần nâng giá trị kinh tế. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN 1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển Rong biển là một loài thực vật sinh sống ở biển. Chúng mọc trên các rạn san hô, vách đá hoặc có thể mọc dưới các tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp. Sự có mặt của rong biển trong thủy vực không chỉ đóng vai trò quan trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của sinh vật biển mà còn là nguồn cung cấp thức ăn cho các loài động vật ven biển khác [4]. Ở nước ta có khoảng hơn 1000 loài rong biển, phân bố chủ yếu ở vùng biển các tỉnh phía Nam và phía Bắc. Với hơn 200 loài được tìm thấy ở cả hai miền Bắc Nam. Trong đó, có các đối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong Mơ (Sargassum), rong Đông (Hypnea), rong Mứt (Porphyza), và rong Bún (Enteromorpha) [31]. 1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho các mục đích y tế. Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của các hạt Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein. Những protein như vậy, được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật. Tuy nhiên, tất cả các nhà khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường đại học Dorpat (nay là trường đại học Tartu, Estonia) vào năm 1888. Chất hemagglutinin được Stillmark tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là ricin, một độc tố mà sau đó được xác định là có bản chất protein [34]. Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc liên quan đến chức năng của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [47]. Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạt tính sinh học, Peuman và cộng sự đã phân chia lectin thành 3 loại: 4 • Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liên kết đường, do đó không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các hợp chất liên kết đường. Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan (Orchidaceae). • Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khả năng gây ngưng kết tế bào và gây tủa, do tương tác với nhiều loại hợp chất cộng hợp đường. Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được phát hiện bởi vì khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi là hemmagglutinin. • Chimerolectin là những phân tử, trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học). Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom typ 2 (RIP, Type 2) có trong hạt thầu dầu (Ricinus communis L.,) hoặc hạt cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.). Song song với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâu vào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các lectin, để sử dụng chúng một cách thiết thực và có hiệu quả hơn. Hiện nay các nhà khoa học đã hiểu biết khá nhiều về bản chất của lectin. Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin như sau: “Lectin là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết. Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc glycolipid bề mặt. Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau” [61]. 1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới  Sự phân bố lectin trong giới thực vật Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt. Tác giả Allen và Brillantine (1969), đã tiến hành điều tra ở 2663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó các cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [9]. Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin [12]. 5 Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [6]. Lectin từ họ Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [2]. Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y (Lichenes) và Rong (Algae). Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [18], từ đó đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khác nhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam…[58]. Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật [8].  Sự phân bố lectin trong giới động vật Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm. Lectin trong giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus). Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra. Ở Việt Nam, khi khảo sát 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa xuất hiện 10 loài có chứa lectin [8]. Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều tra cơ bản. Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) cũng có chứa lectin. Ngoài ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)… Một kết quả nghiên cứu khá thú vị, là ở mô người như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin. Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin. Đó cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [14].  Lectin có nguồn gốc vi sinh vật Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện là vào năm 1942, khi Hirst và cộng sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [8]. Sau này, một số công trình khoa học của Bruoly (1948), Stone (1949) và Bruet (1951) cũng đã phát hiện thấy lectin ở một số loài virus khác [51]. Trên đối tượng là vi khuẩn E. coli, Ofek (1987) đã cho biết: trên bề mặt của tế bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào. Hoạt tính này mất đi 6 khi có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất amin của nó. Đó chính là lectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn. Dạng lectin này cũng đã được phát hiện ở một số loài vi khuẩn khác như Houssto năm 1983 hay của Smit và cộng sự năm 1984 [45]. Cấu tạo của lectin từ rong biển  Khối lượng phân tử của lectin từ rong biển Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ion hóa phun điện tử (electron spray ionization-mass spectrometry), khối lượng phân tử của khá nhiều dạng lectin đã được xác định. Kết luận có thể dẫn ra ở đây là khối lượng phân tử của lectin từ rong biển cũng có sự dao động khá lớn và lectin có nguồn gốc khác nhau thì khối lượng có thể giống nhau hoặc khác nhau. Lectin có nguồn gốc từ rong biển có khối lượng phân tử nhỏ nhất là lectin của Hypnea japonica thuộc dòng rong Đỏ, khoảng 4,2 kDa. Trong khi đó lectin có khối lượng phân tử lớn nhất cũng thuộc dòng rong Đỏ, Ptilota plumose, gồm một chuỗi polypeptide khoảng 170 kDa [50, 33]. Năm 1986, Rogers đã tinh chế lectin từ rong lục Codium fragile và đã xác định khối lượng phân tử của nó là 60 kDa, bao gồm 4 chuỗi polypeptide có cùng khối lượng là 15 kDa cấu tạo nên [50]. Dạng lectin này có điểm đẳng điện trong khoảng từ 3,8 đến 3,9. Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, Jong Won Han và các cộng sự (2011) đã xác định khối lượng phân tử của Bryopsis plumosa là 11,5 kDa, lectin này ở dạng đơn phân [33]. Cho đến nay, có khá nhiều nghiên cứu công bố về khối lượng phân tử của lectin và đã cho thấy mức độ biến đổi khá mạnh của chúng. Tuy nhiên, so với khối lượng phân tử của lectin từ thực vật bậc cao như lectin từ hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis L.,) là 108 kDa hay lectin từ động vật như sam biển Việt Nam (Tachpleus tridentatus) có khối lượng phân tử lên đến trên 700 kDa thì khối lượng phân tử của lectin từ rong biển lại khá thấp, phần lớn trong chúng dao động tập trung trong khoảng từ 15 đến 45 kDa. Các nhà khoa học cho rằng chưa thể tìm thấy được mối liên hệ nào giữa khối lượng phân tử lectin và hoạt tính của chính nó. Khối lượng phân tử của lectin không mang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóa của loài hay cá thể đó [8].  Cấu tạo phân tử lectin từ rong biển Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, khi nghiên cứu trình tự axit amin trong phân tử lectin từ rong biển các nhà khoa học đã nhận thấy: trình tự axit amin trong phân tử lectin phản ánh mối quan hệ trong quá trình tiến hóa. Khi nghiên 7 cứu cấu trúc bậc nhất chuỗi α của lectin ở 3 loài rong cùng chi Eucheuma là E. serra, E. amakusaensis và E. cottonii, Kawakubo và cộng sự đã cho biết: trình tự của 20 axit amin đầu N của có tỷ lệ tương đồng rất cao, thành phần gốc axit amin chủ yếu giàu các gốc Glx, Asx, Gly và Ser [35, 36]. Có khá nhiều công trình đã chỉ ra rằng hầu hết các dạng lectin từ rong biển được cấu tạo từ một mạch polypeptide. Chỉ một số ít lectin có cấu tạo từ hai mạch polypeptide trở lên, mỗi mạch polypeptide tạo thành một tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị này có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau. Ví dụ như lectin từ rong đỏ Vidalia obtusiloba có cấu trúc dimer, trọng lượng của 2 chuỗi polypeptide lần lượt là 59,6 và 15,2 kDa [22], trong khi đó lectin từ rong xanh Codium fragile lại có cấu tạo tetramer với khối lượng mỗi đơn phân đều là 15 kDa. Hori và cộng sự nghiên cứu cấu trúc bậc nhất của 2 đồng phân lectin hypnin A- 1 và hypnin A-2 từ rong đỏ Hypnea japonica cho thấy: chúng có cấu tạo đơn phân chỉ do một chuỗi polypeptide gồm 90 gốc axit amin tạo thành; trong đó, có 4 gốc cystines tạo thành 2 cầu nối disulfide: cys 5 -cys 62 và cys 12 -cys 89 ; 3 loại axit amin là serine, glycine và proline chiếm đến 43% số gốc axit amin có trong chuỗi polypeptide; trình tự axit amin của 2 lectin này chỉ khác nhau ở 3 vị trí: 19, 31 và 52, sự khác nhau của các gốc axit amin này không ảnh hưởng đến sự giống nhau về hoạt tính ngưng kết hồng cầu cũng như khả năng liên kết với một số glycoprotein của 2 loại lectin này. Mặt khác, ngoài glycoprotein, hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng còn bị ức chế bởi protein phospholipase A-2, điều này cho phép chúng ta nhận định rằng lectin hypnins không chỉ chứa vị trí liên kết với carbohydrate mà còn chứa vị trí liên kết với protein. Với trọng lượng phân tử chỉ xấp xỉ 9,1 kDa cùng với 2 cầu nối disulfide, đây được xem là 2 yếu tố chính làm tăng khả năng chịu nhiệt của 2 lectin này. Không những vậy, khi alkyl hóa hoặc cắt đứt cầu disulfide, Hori cũng nhận thấy hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng cũng bị mất đi, từ đây có thể đưa ra giả định rằng trung tâm hoạt động của 2 lectin này có chứa cầu nối disulfide [22]. Bất kỳ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc I hoặc cấu trúc không gian phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động. Đó là trung tâm liên kết carbohydrate. Chính trung tâm này quyết định hoạt tính của lectin. Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của chúng là các gốc axit amin hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin trung tâm hoạt động của chúng là do một số gốc axit amin như tyrozine, xerine, treonine, tryptophan… có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên. Các dạng lectin 8 khác nhau thì có thành phần axit amin trong trung tâm hoạt động là khác nhau. Cho đến nay, vấn đề về trung tâm hoạt động của lectin vẫn còn rất phức tạp [28, 19]. 1.2.3 Một số tính chất và sinh học của lectin từ rong biển  Tính tan và kết tủa Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng. Lectin có bản chất là protein nên chúng có thể đuợc kết tủa bởi một số tác nhân hóa như: ethanol, acetone, một số muối trung tính ở nồng độ cao đặc biệt là ammonium sunphate.  Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của nó Qua các thí nghiệm về khả năng liên kết với các loại đường ở lectin được tách chiết từ rong biển, người ta nhận thấy lectin từ rong biển ít liên kết với các loại đường đơn hay đường đa như ở thực vật bậc cao hay động vật mà ngược lại nó liên kết với các glycoprotein dạng N-glycan hay O-glycan như: porcine stomach mucin, lactotransferrin, asialofetuin…[39, 57]. Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường của lectin vẫn còn khá phức tạp. Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu sử dụng lectin. Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó [31]. Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu. Gần đây, dựa vào các loại đường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học.  Khả năng gây ngưng kết tế bào Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật và người. Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin. Số lượng lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít, vì chúng đồng thời có thể gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, cừu, gà, dê hay ngựa…. Theo tác giả Allen và Billantine, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loài chứa lectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loài chứa lectin không đặc hiệu nhóm máu. Lectin từ rong biển Ptilota plumosa ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu A đã xử lý papain mà không thể 9 ngưng kết với các nhóm máu khác của người như O, B hay AB [50]. Các lectin đặc hiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng. Theo Sharon (1989), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi… [55]. 1.3 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN Lectin từ rong biển đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống. Các ứng dụng đó có thể được tóm tắt như sau:  Lectin trong huyết học Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫn còn được áp dụng rộng rãi. Phương pháp xác định nhóm máu bằng lectin cho kết quả nhanh, chính xác mà không cần dùng huyết thanh mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi lectin phải tinh khiết và có tính đặc hiệu cao. Việc sử dụng lectin từ rong biển để xác định nhóm máu cũng đã được sử dụng trong nhiều năm nay. Lectin từ rong Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết với hồng cầu máu A đã xử lý papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác như A, B, O hay AB [50].  Lectin trong tế bào học Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tế bào và những biến đổi trên bề mặt màng tế bào trong quá trình biệt hóa bệnh lý thông qua sự thay đổi thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào. Năm 1988, lectin được tinh sạch từ Codium tomentosum được sử dụng như một công cụ để phát hiện sự có mặt của nhiều loại glycoprotein khác nhau mà phần lớn là Glu-NAc.  Lectin trong thuốc bảo vệ thực vật và ngũ cốc Lectin mà đặc biệt là lectin từ rong biển có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ và côn trùng có hại cho cây trồng vì chúng có khả năng liên kết với glycoprotein đường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tự chết. 10 Bảng 1.2: Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng Nguồn lectin Loại côn trùng Ảnh hưởng Liên kết đặc hiệu Tác giả Gracilaria cornea (rong Đỏ) Boophilus microplus Làm côn trùng chậm phát triển, giảm trọng lượng trứng và lượng trứng nở thành con… Fetuin, porcine stomach mucin Lima et al 2005 [41]. Gracilaria ornate (rong Đỏ) Callosobruchus maculatus Làm côn trùng chậm phát triển… Fetuin, porcine stomach mucin Leite et al 2005 [39].  Lectin trong y học Lectin có tiềm năng rất lớn trong nhiều lĩnh vực. Lectin được sử dụng như một công cụ chẩn đoán có hiệu quả. Dựa vào khả năng phân biệt và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật, lectin từ rong biển được sử dụng kết hợp với các xét nghiệm thông thường khác để nâng cao giá trị chẩn đoán và điều trị bệnh trên sinh vật biển. Dịch chiết lectin từ rong Eucheua serra và Galaxaura marginata ức chế sự phát triển của vi khuẩn biển gây hại cho cá là Vibrio pelagius và Vobrio vulnificus, 2 loại vi khuẩn này gây bệnh ở cá [40]. Lectin từ một số loài rong nâu như Fucus vesiculosus, Dictyopteris membranacea, Fucus serratus…có khả năng gây ngưng kết và ức chế sự phát triển của các chủng nấm nhầy gây bệnh như Candida guilliermondi [60]. Lectin từ một số loài rong đỏ như Eucheuma serra, Oscillatoria agardhii hay Griffithsia sp. có khả năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein dạng high manose N- glycan ở nồng độ rất thấp, đây là những glycoprotein có mặt chủ yếu trên bề mặt của màng tế bào HIV, do đó có thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế được khả năng mắc bệnh [31]. Như vậy có thể thấy, lectin đã và đang được nghiên cứu để sử dụng trong chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và rối loạn trao đổi chất, trong nghiên cứu sinh học và miễn dịch, làm mitogen trong nuôi cấy tế bào với mục đích chữa bệnh, tăng năng suất trong trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [8]. [...]... ….Trong số đó, có một vài lectin từ dòng rong đỏ đã được làm sáng tỏ về cấu trúc bậc 1 như: H japonica và Vidalia obtusiloba [22]  Tình hình nghiên cứu trong nước Khác với lectin từ thực vật cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ rong biển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu của Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiên cứu. .. biển Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loài rong biển thu c 3 dòng rong: rong đỏ, rong nâu và rong lục Trong đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu từ rong đỏ là phổ biến nhất [31,23] • Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ở nhiều địa điểm khác nhau trên thế giới với quy mô ngày càng lớn hơn: từ Nam Mỹ, Châu Âu, Châu Á cho đến... 1.3 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài  Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Công trình khoa học đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vào năm 1966, ông đã phát hiện rong biển cũng có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu ở người [31] Kể từ đó có rất nhiều công trình công bố sự có mặt của lectin trong rong biển: • Năm 1988, Hori đã khảo sát hoạt tính ngưng... tối ưu để chiết lectin từ rong E .denticulatum Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết…thì các yếu tố còn lại được cố định Yếu tố nào khảo sát xong thì sẽ được cố định ở giá trị tối ưu để tiếp tục khảo sát đến các yếu tố khác  Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết Tiến hành chiết lectin từ rong E .denticulatum bằng... quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lượng phân tử) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel 3 Phương pháp khảo sát khả năng liên kết carbohydrate của lectin Tiến hành khảo sát khả năng liên kết carbohydrate của lectin với một số loại đường và glycoprotein được liệt kê trong bảng 2.4 Khảo sát khả năng liên kết của lectin với một số loại đường và glycoprotein Đường (100mM) •... vòng/phút trong 15 phút, thu DC Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng DC So sánh, chọn ra thời gian chiết thích hợp 2.2.2 Khảo sát các nhân tủa và nồng độ thích hợp để thu chế phẩm lectin kỹ thu t Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa protein lectin ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt độ NKHC sau khi kết tủa Tiến hành khảo sát khả năng tủa protein lectin từ. .. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Rong Đỏ Eucheuma denticulatum thu ở vùng biển Khánh Hòa – Ninh Thu n 2.2.1 Vật liệu, hóa chất  Vật liệu Mẫu rong Eucheuma denticulatum thu ở vùng biển Khánh Hòa – Ninh Thu n Hồng cầu của máu thỏ, cừu, ngựa và gà lấy từ Viện Vaccine - Nha Trang Hồng cầu các nhóm máu A, B, O ở người lấy từ Bệnh viện đa khoa... dừng lại ở việc khảo sát sự có mặt của lectin trong rong biển mà những tính chất cơ bản của nó cũng đã được chú tâm đến [25,15] Tuy nhiên, cho đến nay số lượng lectin được tinh sạch cũng như khảo sát đặc tính hóa sinh vẫn còn rất khiêm tốn, đặc biệt là khi so sánh với lectin từ thực vật bậc cao [31] Hầu hết trong số đó là các lectin từ rong biển mà chủ yếu là ở một số dòng 12 rong đỏ như: Bryothamnion... của 31 loài rong biển trên hồng cầu người và động vật Từ kết quả nghiên cứu đạt được ông đã cho rằng hoạt tính ngưng kết hồng cầu đóng một vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tế bào rong biển Và hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loài rong biển khác nhau [29] • Tại Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phong trong việc nghiên cứu lectin từ rong biển Từ năm 1985 đến... những lectin có khả năng hoạt động qua sự ức chế chu kỳ sống của virus, ngăn chặn sự xâm nhập vào tế bào vật chủ của virus Thêm vào đó, những lectin này thường chịu được nhiệt độ cao, pH thấp, không có mùi, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein trên bề mặt lớp vỏ của virus Vì vậy, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản và những ứng dụng của chúng trong . nhau thu c tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thu n. Với những kết quả khảo sát sơ bộ và cơ sở nêu trên, đề tài được thực hiện Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả. cho người. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến của đề tài: Đề tài " ;Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng không chỉ có ý nghĩa về. denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng . 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu điều kiện tối ưu để thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum. Nội dung nghiên cứu • Nghiên cứu xác định các điều