Nghiên cứu thu nhận Theobromin thô từ vỏ quả ca cao

Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết Theobromin thô từ phế liệu vỏ quả ca cao để thu được sản phẩm Theobromin ứng dụng trong thực phẩm nhằm khai thác một cách t

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



NGUYỄN HỮU TUẤN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN THEOBROMIN THÔ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



NGUYỄN HỮU TUẤN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN THEOBROMIN THÔ

TỪ VỎ QUẢ CA CAO

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: ThS NGUYỄN VĂN TẶNG

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên: Nguyễn Hữu Tuấn

MSSV: 51131851

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm

Tên đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Theobromin thô từ vỏ quả ca cao”

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Nha Trang, ngày tháng năm 2013

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN (Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, phòng Khoa học Công nghệ đã xét duyệt cho phép em được thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu thu nhận Theobromin thô

từ vỏ quả ca cao” Sau hơn 12 tháng (từ tháng 5 năm 2012 đến tháng 5 năm 2013) thực hiện nghiên cứu dưới sự hướng dẫn hết sức tận tình của Thầy Nguyễn Văn Tặng em đã hoàn thành đề tài nghiên cứu và cùng với đồ án tốt nghiệp này

Em xin trân trọng cám ơn thầy Nguyễn Văn Tặng đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm, luôn động viên em những lúc khó khăn nhất để em có thể vượt qua và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học và đồ án tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn quý các thầy cô khoa Công nghệ Thực phẩm

đã truyền đạt cho em kiến thức và nhiều lời khuyên quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Trung tâm Thí nghiệm– thực hành, các thầy cô quản lý các phòng thí nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em thực hiện nghiên cứu của mình tại các phòng thí nghiệm

Em chân thành cảm ơn sự động viên giúp đỡ của gia đình và tất cả các bạn Trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang, mặc dù gặp rất nhiều khó khăn, thử thách nhưng được sự giúp

đỡ, ủng hộ, động viên của gia đình, thầy cô, bạn bè đã giúp em hoàn thành đề tài của mình

Nha trang, tháng 6 năm 2013 Sinh viên thực hiện

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC H NH ẢNH V ĐỒ TH .v

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Khái quát hoạt động nghiên cứu liên quan đến đề tài 2

1.1.1 Tổng quan về cây ca cao 2

1.1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của cây ca cao 2

1.1.1.2 Phân loại giống 3

1.1.1.3 Thu hái và chế biến 5

1.1.1.4 Cấu tạo và thành phần của quả ca cao 6

1.1.1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ca cao trên thế giới 7

1.1.1.6 Tình hình sản xuất ca cao trong nước 7

1.1.2 Tổng quan về Theobromin 8

1.1.2.1 Tính chất hóa học và lý học 8

1.1.2.2 Tính dược lý 9

1.1.2.3 Các phương pháp định lượng Theobromin 9

1.1.3 Tổng quan về quá trình tách trích ly Theobromin 11

1.1.3.1 Bản chất của quá trình trích ly 11

1.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 13

1.1.3.3 Phân loại các phương pháp trích ly 15

1.1.3.4 Lựa chọn dung môi cho quá trình trích ly 15

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài 16

1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới 16

1.2.2 Nghiên cứu trong nước 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phạm vi nghiên cứu 22

2.2.2 Xây dựng quy trình tách chiết Theobromin dự kiến 22

2.2.2.1 Quy trình nghiên cứu dự kiến 22

2.2.2.2 Thuyết minh quy trình 22

2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm 24

a Bố trí thí nghiệm xác định thành phần khối lượng và thành phần hóa học của vỏ quả ca cao 24

b Bố trí thí nghiện lựa chọn dung môi trích ly 25

c Bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly 27

d Bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly 27

2.2.2.4 Phương pháp phân tích HPLC-UV 29

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU V THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả xác định thành phần khối lượng và thành phần hóa học của quả ca cao 31

3.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn và giản đồ sắc ký 32

3.3 Kết quả xác định dung môi chiết Theobromin thô từ vỏ quả ca cao 33

3.4 Kết quả nghiên cứu xác định thời gian trích ly và số lần trích ly 35

3.5 Quy trình hoàn thiện thu nhận Theobromin thô từ vỏ quả ca cao 37

3.5.1 Sơ đồ quy trình 37

3.5.3 Thuyết minh quy trình 37

3.5.3 Chi phí để sản xuất 20g Theobromin thô từ vỏ quả ca cao: 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN V ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 39

4.1 Kết luận: 39

4.2 Đề xuất ý kiến: 39

T I LIỆU THAM KHẢO 40

7 Hình 1.7 Sơ đồ quy trình dự kiến chiết xuất Theobromin thô từ vỏ quả ca cao 23

8

Hình 1.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần khối lượng

9

Hình 1.9 Sơ đồ bố trí thí nghiện lựa chọn dung môi trích ly

10

Hình 1.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly

11 Hình 1.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly 29

15 Đồ thị 2.1 Xây dựng đường chuẩn Theobromine 32

16 Đồ thị 2.2 Sắc ký đồ Theobromine của mẫu chuẩn 33

17 Đồ thị 2.3 Sắc ký đồ Thebromine của mẫu phân tích 33

19 Đồ thị 2.5 Kết quả xác định thời gian, số lần trích ly 35

24 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất Theobromin thô từ vỏ quả ca cao 38

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

1 Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lớp vỏ cứng (shell) 6

2 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của lớp vỏ thịt (pulp) 6

3 Bảng 2.1 Thành phần khối lượng của quả ca cao tươi 31

4 Bảng 2.2 Thành phần hóa học của vỏ quả ca cao 31

5 Bảng 2.3 Chi phí sản xuất 20g Theobromin thô từ vỏ quả ca cao 38

6

Bảng 2.4 Kết quả phân tích Theobromin bằng phương pháp

7

Bảng 2.5 Kết quả phân tích Theobromin bằng phương pháp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

- HPLC: High-Performance Liquid Chromatography

- HPLV-UV: High-Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet

- L: lít

- NIRS: Near Infrared Reflectance Spectroscopy

- UIPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài:

Trong công nghiệp sản xuất ca cao thì chỉ có hạt ca cao là nguồn ca cao thương mại, còn vỏ ca cao thì thải bỏ ra môi trường bên ngoài, gây ô nhiễm môi trường, tác động xấu đến đời sống con người Hơn nữa, cây ca cao là công nghiệp

có giá trị kinh tế cao, do đó nhu cầu sản xuất hạt ca cao ngày càng tăng thì lượng phế phẩm thải ra môi trường ngày càng nhiều dẫn đến vấn đề ô nhiễm môi trường ngày càng tăng lên

Trong vỏ ca cao có chứa chất Theobromin, chất có khả năng làm tăng sức chịu đựng của tim, điều hoà huyết áp, tăng cường hoạt động của hệ tuần hoàn, chúng được tìm thấy trong hợp chất chữa bệnh tim cho người, được ứng dụng nhiều trong y học

Do đó, nghiên cứu thu hồi Theobromin từ phế liệu vỏ quả ca cao để thu Theobromin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, hạn chế sự ô nhiễm môi trường

và nâng cao giá trị sử dụng cho cây ca cao là vấn đề có tính rất cấp thiết hiện nay

2 Mục tiêu của đề tài:

Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết Theobromin thô từ phế liệu vỏ quả

ca cao để thu được sản phẩm Theobromin ứng dụng trong thực phẩm nhằm khai thác một cách triệt nguồn nguyên liệu quả ca cao, tận dụng nguồn phế thải vỏ ca cao, hạn chế sự ô nhiễm và bảo vệ môi trường, nâng cao giá trị sử dụng cho cây ca cao

3 Nội dung nghiên cứu:

 Xây dựng quy trình dự kiến thu nhận Theobromine thô từ vỏ quả ca cao

 Xác định thành phần khối lượng của quả ca cao và thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả ca cao

 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Theobromine

từ vỏ quả ca cao

 Đề xuất quy trình thu nhận Theobromine thô từ vỏ quả ca cao

 Sơ bộ tính chi phí sản xuất 20g Theobromin thô từ vỏ quả ca cao

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Khái quát hoạt động nghiên cứu liên quan đến đề tài:

1.1.1 Tổng quan về cây ca cao [3], [4], [12], [16], [38]

1.1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của cây ca cao:

a) Nguồn gốc:

Tên khoa học: Theobroma ca cao, theo hệ thống được phân loại thuộc họ

Trôm (Sterculiceae), theo phân loại của hệ thống APG II thì thuộc phân họ Byttnerivideae thuộc họ Cẩm quỳ (Mavalceae) Cây ca cao có nguồn gốc ở vùng Amazone, trung tâm châu Mỹ Người Aztec và Maya đã tìm thấy và sử dụng nó

Hình 1.1 Cây ca cao

Christopher Colombus khám phá ra hạt ca cao ở Châu Mỹ vào năm 1502 Hernando cortes đã mang rất nhiều ca cao về Tây Ban Nha vào năm 1958

Những nước trồng ca cao chủ yếu trên thế giới:

- Châu Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Nigeria, Uganda…

- Châu Mỹ: Brazil, Cameroon, Ecuador…

- Châu Á: Indonexia, Malaysia, Việt Nam…

Ở Việt Nam ca cao du nhập vào rất sớm, theo các nhà truyền giáo phương tây Việt Nam trồng ca cao đầu tiên là ở Quảng Ngãi, nhưng đến năm 2004 thì Đắc

chịu nắng nên mô hình trồng ca cao thường trồng xen kẽ với những cây ngắn ngày, dài ngày khác để che nắng

Hiện tại cây được trồng rộng rãi ở nhiều nơi, vùng Tây nguyên vẫn được đánh giá là có điều kiện lý tưởng nhất cho phát triển cây ca cao Ở đây theo nghiên cứu thống kê thì cây ra hoa cho quả quanh năm, sản lượng bình quân đạt 3kg hạt khô/ cây 5 tuổi Tuy nhiên, hiện tại ở Việt Nam cây ca cao chưa được phát triển rộng rãi do quy hoạch không tập trung, kỹ thuật xử lý sau thu hoạch cũng phức tạp, phải ủ lên men nên người dân ngại trồng

Khoảng năm 2002 tổ chức Succes Alliance có dự án phát trển cây ca cao mà khởi đầu từ Bến Tre Đến năm 2006 chuyến hàng xuất khẩu hạt ca cao được xuất hiện dù sản lượng vẫn còn thấp

b) Đặc điểm hình thái:

Là loại cây thuộc có tán thuộc tầng trung bình, sống dưới bóng những cây cổ thụ, chiều cao của cây có thể cao tới 11m, rễ ca cao thuộc loại rễ chùm nên không ăn sâu vào lòng đất Loại đất thích hợp nhất cho cây ca cao là mùn xốp Cây có thể sống tới 15 -20 năm, sau ba năm cây bắt đầu ra hoa, kết trái và cho trái quanh năm Trái ca cao đâm ra trực tiếp từ thân hoặc từ những cành lớn Cây cho sản lượng cao nhất khi cây khoảng 9 – 10 tuổi, cây mang lại khoảng 20 –

30 trái/năm, năm được mùa có thể lên đến 50 trái/năm Trái ca cao khi chưa chín

có màu xanh, khi trái chín có màu vàng, dáng bầu dục thuôn dài, có chiều dài khoảng 15 tới 25cm và đường kính khoảng 7 – 10cm Trong mỗi trái có 5 dãy hạt, mỗi dãy khoảng 25 tới 50 hạt

1.1.1.2 Phân loại giống:

 Giống Criollo:

Đây là loài cây ca cao nguyên thủy của người Mayas ở Mêxico, được mệnh danh là “công chúa của các loài ca cao” do hương vị thơm ngon tinh tế đặc biệt của

nó Giờ đây nó được trồng ở cả Venezuela, Madagasca, Indonesia

Năng suất thấp và khả năng kháng sâu bệnh kém nhưng chất lượng hạt ca cao là tốt nhất có thể làm ra loại Chocolate ngon nhất, thị phần 5% trên thị trường ca cao

Nhị hoa màu hồng nhạt, quả màu đỏ hoặc xanh trước khi chín, khi chín màu

đỏ sẫm, hình dáng dài, dưới rất nhọn, mang 10 khía đều nhau có khi phân thành 2 nhóm xen kẽ

Hình 1.2 Giống Criollo

 Giống Forastero:

Được trồng nhiều ở Brazil, Ghana…Loại ca cao này giàu chất béo và có mùi hơi hăng Nó dễ trồng sản lượng lại cao lên đến 90% lượng ca cao này được để sản xuất Chocolate Ở Việt Nam trồng chủ yếu giống này

Hình 1.3 Giống Forastero

Chất lượng trung bình, năng suất khá cao và kháng sâu bệnh, chiếm 80% thị

Nhụy hoa màu tím, quả màu xanh lá cây, vàng khi chín, hình dài, nhọn, ít khía, mặt trơn, phôi nhũ tươi, màu đỏ đậm Hạt hơi lép, tử diệp có màu đỏ đậm, lúc tươi có vị hơi đắng, 30 – 60 hạt/quả

 Giống Trinitario:

Loài ca cao đặc trưng cho vùng Tây bán cầu có xuất xứ từ Trinidat

Năng suất cao và khả năng kháng bệnh tốt, đây là giống có chất lượng trung bình Thị phần 10 – 15%

Là loại ca cao được lai tạo từ 2 giống: Criollo và Frastero nên có đặc điểm trung gian Phôi nhũ màu tím nhạt, quả dẹp, quả có rãnh sâu không rõ nét, chứa nhiều hơn

40 hạt/quả

Hình 1.4 Giống Trinitario 1.1.1.3 Thu hái và chế biến:

Chỉ thu hoạch khi trái đã đạt độ chín kỹ thuật, là lúc trái có màu vàng hoặc

đỏ cam tùy theo giống Trái chín thuận lợi cho việc lên men, hàm lượng bơ trong hạt cao và có hương thơm tốt nhất Không nên để quá muộn vì hạt có thể nảy mầm bên trong trái, bị hư do sâu bệnh, chuột, sóc phá hoại Còn nếu hái quá sớm thì có thể làm cho năng suất thấp, khó bóc hạt và chất lượng không cao

Đối với những trái ngang tầm tay ta dùng dao cắt, còn những trái cao hơn thì dùng những dụng cụ hái trái để hái Cắt cuống trái bằng kéo tỉa cành hoặc dao bén Cần lưu ý rằng kéo lưỡi càng bén thì càng ít tạo vết thương cho cây Tránh va chạm lưỡi cắt vào thân cây vì sự va chạm gây trầy xước, làm tổn thương đệm hoa sẽ ảnh hưởng xấu tới sự ra hoa kết trái ở các vụ sau

1.1.1.4 Cấu tạo và thành phần của quả ca cao:

Quả ca cao đƣợc cấu tạo từ 4 phần gồm: Lớp vỏ cứng bên ngoài cùng, tiếp theo là lớp vỏ nhầy màu trắng bao quanh hạt, kế đó là lớp vỏ trấu và hạt nằm trong cùng

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lớp vỏ cứng (shell):

Chất khoáng ( K, Na, Ca, Mg) 0,40

Hình 1.5 Cấu tạo giải phẫu của quả ca cao

1.1.1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ca cao trên thế giới:

a) Những nước trồng ca cao chủ yếu trên thế giới:

Ca cao được trồng trên 50 nước trên thế giới, chủ yếu là ở Tây Phi, trung tâm

và Nam Mỹ và châu Á Tuy vậy, sản lượng chính chỉ tập trung ở một số nước, khoảng 70% sản lượng thế giới được sản xuất từ 3 nước Bờ Biển Ngà, Ghana và Indonesia Bờ Biển Ngà là nước sản xuất ca cao lớn nhất thế giới, sản lượng niên vụ 2010/2011 đạt 1.56 triệu tấn (chiếm 40% tổng sản lượng cung cấp trên toàn cầu) Ghana đạt mức sản lượng 955.000 tấn Trong năm 2011, sản lượng cacao của Indonesia đạt khoảng 435.000 tấn

- Châu Phi gồm có Bờ Biển Ngà (Côtđivoa), Ghana, Nigieria, Uganđa

- Châu Mỹ gồm có Brazil, Cameroon, Ecuador

- Châu Á gồm có Inđônêsia, Maylasia, Việt Nam

b) Những nước tiêu thụ ca cao chủ yếu trên thế giới:

Mặc dù ca cao được sản xuất chủ yếu ở các nước đang phát triển nhưng nó lại được tiêu thụ chủ yếu ở châu Âu (Anh, Đức, Pháp, Nga, Ý, Tây Ban Nha, Bỉ, Hà Lan), Bắc Mỹ (Brazil, Mexico, Canada) và châu Á (Nhật) Trong đó, các nước Mỹ

La Tinh xuất khẩu ca cao vào Mỹ, các nước châu Phi bán ca cao chủ yếu vào châu

Âu còn châu Á nhập khẩu ca cao từ Inđônêsia, Maylasia, Ecuador hoặc các nước Bắc Mỹ

1.1.1.6 Tình hình sản xuất ca cao trong nước [40] :

Việt Nam có điều kiện địa lý thuận lợi cho việc trồng cây ca cao, Chính phủ Việt Nam có chính sách hỗ trợ các hộ nông dân trồng cây ca cao và được các tổ chức quốc tế giúp đỡ về mặt kỹ thuật Các tỉnh trồng nhiều ca cao là Bến Tre, Đăk Lăk, Tiền Giang, Bình Phước, Quảng Ngãi, Cần Thơ

Theo VCC, kế hoạch sản xuất ca cao đến cuối năm 2011 đạt 26.732 ha, tăng thêm 6.143 ha so với thời điểm hiện tại và dự báo đến năm 2015 diện tích ca cao trên cả nước sẽ đạt 53.580 ha Tuy nhiên trong số liệu này vẫn còn nhiều tỉnh có ý định phát triển ca cao nhưng chưa có kế hoạch và chỉ tiêu diện tích cụ thể

Báo cáo tại hội nghị cho thấy từ năm 2010 đến nay giá ca cao luôn ở mức cao và khá ổn định, bình quân trên 50.000 – trên 60.000 đồng/kg hạt khô, làm tăng thu nhập cho người nông dân trồng ca cao từ 15 – 20 triệu đồng/ha Đối với các hộ nông dân có đầu tư thâm canh, thu nhập từ ca cao có thể đạt mức 60 – 70 triệu đồng/ha Ngoài ra, thu nhập từ sản lượng các cây trồng xen với ca cao như dừa, điều, cây ăn trái khác… cũng góp phần đáng kể nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất của nông dân trồng ca cao

Thị trường thu mua ca cao tại Việt Nam hiện nay đang có rất nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước tham gia thu mua

Thị trường trong nước có các công ty thu mua ca cao như: Phạm Minh, Thành Hưng Thịnh, Phú Bình, Thảo Li, Thành Đạt, Nguyên Lộc, Trọng Đức, Cao Nguyên Xanh, Ca cao A1…

Thị trường nước ngoài như: Cargill, Armazaro, Olam, Touton, Grand Place… với sự tham gia thu mua hạt ca cao của nhiều công ty đã tạo nên một thị trường cạnh tranh, từ đó tạo tâm lý an tâm cho người nông dân mạnh dạn đầu tư mở rộng diện tích trồng mới ca cao

1.1.2 Tổng quan về Theobromin [3], [6], [8], [18], [25], [26], [29], [33]

1.1.2.1 Tính chất hóa học và lý học:

 Công thức phân tử: C7H8N4O2

 Công thức cấu tạo:

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Theobromin

Tên UIPAC: 3,7-dihydro-3,7-dimethyl-H-purine-2,6-dione:

Tên thông thường: 3,7 Dimethylxanthine

Theobromine thuộc nhóm alkaloit, là nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử có nhân dị vòng và có tính kiềm hoặc lưỡng tính, nitơ trong phân tử alkaloid tạo nên đặc tính cơ bản của loại hợp chất này

Là thành phần đặc trưng của ca cao, chiếm khoảng 1,5 – 1,7 % so với khối lượng của hạt

Theobromine không những có trong hạt mà còn có trong vỏ quả ca cao, hàm lượng của nó chiếm từ 0,5-1,0%

Theobromine ở dạng tinh thể bé, màu trắng, có vị đắng, bắt đầu thăng hoa ỏ nhiệt độ 3080C

Độ tan: tan trong nước (1,0g/2L), trong nước sôi (1,0g/0,15L) và trong etanol 95% (1,0g/2,2L), rất ít tan trong cloroform (1,0g/6L), hầu như không hòa tan trong benzene, diethyl ether và carbon tetrachloride

1.1.2.2 Tính dược lý:

Theobromine được sử dụng trong điều trị sưng và phù nề Theobromine cũng được sử dụng như một thuốc lợi tiểu và một chất kích thích tự nhiên tim mạch, tăng lưu lượng oxy đến các vùng khác nhau trong cơ thể Cải thiện lưu lượng máu, kích thích chức năng nhận thức và cải thiện trí nhớ Theobromin góp phần quan trọng trong việc điều trị hen suyễn

1.1.2.3 Các phương pháp định lượng Theobromin:

 Phương pháp kết tủa:

Dùng các chất kết tủa khác nhau (thuốc thử: HgI2 +KI hoặc dung dịch

I2 trong KI) để chuẩn độ Ví dụ: Cho dung dịch chứa I2 vào dung dịch chứa alkaloid trong môi trường trung tính hoặc axit yếu, I2 tạo thành kết tủa với alkaloid Chuẩn độ lượng I2 dư bằng dung dịch Na2S2O3 với chỉ thị là hồ tinh

Phản ứng với bạc nitrat (AgNO3): Theobromine thu được sau khi trích

ly cho phản ứng với bạc nitrat tạo thành muối bạc và axit nitric, chuẩn độ axit sinh ra bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein 1% cho đến khi

xuất hiện màu hồng bên, đọc thể tích NaOH 0,1N, rồi tính lượng

Theobromin có trong mẫu phân tích [10],[11]

Theobromin + AgNO3 -> Theobromin-Ag + HNO3

 Phương pháp quang phổ UV- Vis [21], [31]

Phương pháp quang phổhấp thụđiện tửvùng tửngọai (UV) và khảkiến (Vis)được áp dụngđể xácđịnhđịnh tính (nhận biết chất), xác địnhđịnh lượng, xácđịnh cấu trúc, nghiên cứu phức chất (xác định thành phần, hằng số bền), hệ

sốhấpthụ phân tử

Là chiếu chùm tia đơn sắc với một dãy các bước sóng qua dung dịch chất hấp thụánh sáng, khiđócác cấu tửtrong dung dịch sẽhấp thụ chọn lọc một sốtiaở những bước sóng khác nhau tùy theo cấu trúc của mỗi chất

Bộ phận phân tích và hiển thịkết quả cho tabiết các thông tin về cực đại hấp thụ và hiển thịcác phổđồhấp thụđiện tửcủa cáccấu tửtrong dung dịch cần phân tích.Nếu kết quả cho thấy cực đại hấp thụ và cườngđộ quang phổ hấp thụđiện tử, của mẫu thửvà mẫu chuẩn gần giống nhau trong khoảng bước sóng nhấtđịnh, ta cóthểđịnh tínhđược các mẫu nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn

Ban đầu xây dựng đường chuẩn từ Theobromin chuẩn, sau đó lấy mẫu cần phân tích Theobromin đi đo đọ hấp thụ ở bước sóng 276nm hoặc 310nm

Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng Theobromin

 Phương pháp Săc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): [9], [13], [14], [15], [27]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm

1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC

là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để phân tích Theobromin, Theophyllin và Cafein ở bước sóng 274nm

 Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp tia cực tím (HPLC-UV)

Phương pháp HPLC-UV nguyên tắc thực hiện tượng tự như HPLC, tuy nhiên nhờ có sự kết hợp với tia cực tím UV cho nên thời gian phát hiện nhanh hơn, cho hình ảnh quang phổ Theobromin rõ nét hơn, dựa vào điều đó giúp cho việc tính toán hàm lượng Theobromin chính xác hơn, độ tin cậy cao hơn

HPLC [23],[30]

 Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại (NIRS)

Là phương pháp rất hiện đại thường dùng để xác định hàm lượng Theobromnin và Cafein trong mẫu phân tích, cho kết quả chính xác trong thời gian ngắn, có tiến hành phân tích nhiều mẫu cùng một lúc.[20]

1.1.3 Tổng quan về quá trình tách trích ly Theobromin [1], [2]

1.1.3.1 Bản chất của quá trình trích ly:

Bản chất của quá trình trích ly là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khếch tán giữa các chất có nồng độ khác nhau

Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng là trích ly lỏng, còn trích ly chất hòa tan trong chất rắn là trích ly chất rắn

Bản chất của quá trình trích ly là quá trình khuếch tán phân tử và quá trình khuếch tán đối lưu

 Quá trình khuếch tán phân tử

Khuếch tán phân tử là quá trình dịch chuyển hỗn độn lẫn nhau giữa các phân tử của các chất khác nhau

Sự khuếch tán phân tử là dựa vào động học bên trong của các phân tử, hay còn

là sự chuyển động nhiệt tuân theo định luật Fick:

dS = - D * F * * ddc 

dx

Trong đó:

K: Hằng số khuếch tán

M: Độ dính của chất môi giới (dung môi)

T: Nhiệt độ tuyệt đối

r: Bán kính phân tử khuếch tán

 Khuếch tán đối lưu:

Là hình thái di chuyển của vật chất trong dung dịch trong phạm vi nhỏ

Sự khuếch tán đối lưu chịu tác động chủ yếu của sự chệch lệch nồng độ Nồng

độ càng lớn thì hiệu suất di chuyển từ vùng nồng độ cao tới vùng nồng độ thấp càng lớn Quá trình này chủ yếu là sự chuyển động của phân tử chất tan trên bề mặt vật liệu vào dung môi và ngoại lực bên ngoài

Trong quá trình trích ly thì 2 quá trình khuếch tán này xảy ra song song nhau Sự di chuyển vật chất trong khuếch tán phân tử dựa trên động năng của chuyển động nhiệt còn khuếch tán đối lưu sự di chuyển dựa vào lực tác động bên ngoài

Từ phương trình khuếch tán trên cho thấy tốc độ của quá trình khuếch tán chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, độ nhớt của môi trường khuếch tán (dung môi), thời gian khuếch tán, tốc độ khuấy đảo…

Như vậy, muốn tăng hiệu quả của quá trình khuếch tán chỉ cần tác động

1.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly:

 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu:

 Khi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thấp thì lượng chất trích ly vào dung môi thấp, kéo dài thời gian trích ly làm giảm chất lượng của sản phẩm

 Khi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tăng thì sẽ tạo sự chêch lệch nồng độ lớn, lương chất trích ly tăng do đó thời gian trích ly giảm Tuy nhiên, nếu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu cao quá thì hiệu quả trích ly không tăng thêm nữa mà lại hao tổn dung môi, giảm hiệu quả kinh tế

 Do đó cần chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu phù hợp với quá trình trích ly để đảm bảo hiệu suất trích ly, chất lượng sản phẩm và hiệu quả kinh tế

 Ảnh hưởng của loại dung môi:

Các loại dung môi khác nhau sẽ phù hợp với việc trích ly các thành phần khác nhau vì chúng khác nhau về độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt Các yếu tố này đều làm ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly

 Độ phân cực của dung môi:

Dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các nhóm chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực

 Dựa vào độ phân cực của dung môi người ta phân loại như sau:

Dung môi không phân cực: ete dầu hỏa, xăng, hexan, heptan, bezene…

Dung môi phân cực yếu và vừa: cloroform, diclorethane, axeton, etylaxetat…

Dung môi phân cực mạnh: nước, glyxerin, các loại cồn có mạch cacbon ngắn (metanol, etanol, isopropanol….)

Trong các yêu cầu và lựa chọn dung môi, khả năng hòa tan các chất cần trích ly là quan trọng nhất Khả năng hòa tan lại liên hệ chặt chẽ với độ phân cực của dung môi:

Các chất có nhiều nhóm chức: -OH, -COO, -CHO, -CO, -NH2, -CONH2… thường dễ tan trong các dung môi phân cực

Các chất có nhiều nhóm kỵ nước như : -CH3, -C2H5, các nhóm đồng đẳng… thường dễ tan trong các dung môi không phân cực

 Độ nhớt và sức căng bề mặt:

Dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏ thì dễ thấm vào nguyên liệu, tạo điều kiện thuân lợi cho quá trình trích ly và ngược lại

 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly:

Khi nhiệt độ tăng thì lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng, do đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly Tuy nhiên khi nhiệt độ tăng quá thì gây bất lợi cho quá trình trích ly trong một số trường hợp sau:

 Đối với tạp chất: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của hoạt chất tăng mà

độ tan của tạp chất cũng đồng thời tăng theo làm cho dịch chiết bị lẫn nhiều tạp Khi nhiệt độ tăng là cho các thành phần tinh bột, pectin thủy phân, độ nhớt của dung dịch tăng lên gây khó khăn cho quá trình trích ly, tinh chế

 Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi dễ bị hao hụt, một số dung môi có tính độc thì rất nguy hiểm Do đó thiết bị phải kín và có bộ phận hồi lưu dung môi

 Đối với các hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao thì dễ bị phân hủy, tồn tại trong

dung môi, ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm

Từ những phân tích trên ta nên chọn nhiệt độ trích ly sao cho phù hợp nhất

 Ảnh hưởng của thời gian trích ly:

Khi bắt đầu trích ly, các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo…) Do đó, nếu thời gian trích ly ngắn thì không chiết được hết các chất trong nguyên liệu, nhưng nếu thời gian trích ly quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho các công đoạn sau

Tóm lại, cần phải lựa chọn thời gian trích ly sao cho phù hợp với các

thành phần nguyên liệu, dung môi, phương pháp trích ly và đảm bảo hiệu quả

 Hình thái, tính chất và cấu tạo của tổ chức nguyên liệu:

Mức độ phá vỡ cấu trúc tế bào càng nhiều thì sự tiếp xúc giữa chất cần chiết và dung môi càng tăng nên rút ngắn thời gian chiết và chiết triệt để hơn

Kích thước càng nhỏ thì diện tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng tăng, hiệu suất chiết tăng, tuy nhiên cũng không nên nhỏ quá vì sẽ gây khó khăn cho quá trình phân ly tiếp theo

1.1.3.3 Phân loại các phương pháp trích ly:

Có nhiều cách phân loại, dựa vào nhừng yếu tố khác nhau:

 Dựa vào nhiệt độ, có các phương pháp chiết sau: chiết nóng, chiết nguội (ở nhiệt độ thường)

 Dựa vào chế độ làm việc, có phương pháp chiết sau: gián đoạn, bán liên tục, liên tục

 Dựa vào chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có phương pháp: ngược dòng, xuôi dòng, chéo dòng

 Dựa vào áp suất làm việc, có phương pháp chiết sau: áp suất thường (áp suất khí quyển), áp suất thấp (áp suất chân không), áp suất cao

1.1.3.4 Lựa chọn dung môi cho quá trình trích ly:

 Yêu cầu của dung môi:

 Dung môi hòa tan các chất cần chiết mà không hòa tan các chất khác

 Dung môi phải có thành phần hóa học ổn định không gây ra phản ứng phụ với nguyên liệu

 Dung môi không biến đổi thành phần của sản phẩm khi bảo quản

 Dung môi có nhiệt độ sôi thấp để dễ dàng tách dung môi ra khỏi chất cần chiết sau khi chiết Sau khi tách chiết không để lại mùi vị lạ

 Dung môi không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, chất lượng sản phẩm

 Dung môi khó cháy nổ, an toàn trong sản xuất

 Dung môi không ăn mòn thiết bị chiết

 Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, có khả năng sử dụng trong sản xuất

 Tìm hiểu dung môi sử dụng trong đề tài [5], [6], [10], [24], [25], [29], [39]

Dựa vào tính chất của Theobromine mà ta lựa chọn dung môi phù hợp nhất để nâng cao hiệu quả trích ly

Theobromine thuộc nhóm alkaloit, là nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử

có nhân dị vòng và có tính kiềm hoặc lưỡng tính, nitơ trong phân tử alkaloid tạo nên đặc tính cơ bản của loại hợp chất này[5] Cụ thể: trong phân tử Theobromin chứa cả hai nhóm chức không phân cực là –CH3 và nhóm chức phân cực :-NH-, -N=, -CO, dó đó Theobromine có thể tan trong cả hai dung môi phân cực và không phân cực

Dựa vào các đặc tính ta tiến hành lựa chọn các dung môi có tính phân

cực yếu như cloroform, etylaxetat và dung môi phân cực như etanol, nước

Ngoài các dung môi sử dụng trong quá trình trích ly kể trên còn có dung môi CO2 siêu tới hạn Đây là dung môi rất thích hợp để tách chiết Theobromin Tách chiết bằng dioxide carbon siêu tới hạn đòi hỏi chi phí đầu tư cao hơn nhưng nhờ tính chọn lọc cao Do đó, nó được khuyến khích cho việc tách chiết

và tinh chế các sản phẩm có giá trị như alkaloid Với công nghệ này, tách chiết

và tinh chế được tiến hành đồng thời, dung môi của các chất lỏng siêu tới hạn

có thể dễ dàng thay đổi trong các biến đổi của nhiệt độ và áp suất nhiệt động lực học Trong tách chiết bằng carbon dioxide siêu tới hạn, có thể làm giảm nhiệt như quá trình tách chiết thông thường Tuy nhiên, dung môi này đòi hỏi

sử dụng thiết bị phân tích hiện đại, chí phí gửi mẫu phân tích rất cao

Do đó cần tiến hành bố trí thí nghiệm để lựa chon dung môi phù hợp nhất, đạt hiệu quả trích ly tốt nhất

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài :

1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới [12], [26], [29], [33], [34], [35], [36],[37]

 Một bài báo khoa học mang tên “Tìm hiểu về lợi ích sức khỏe từ chocolate mang lại” của tác giả TS David Jockers (2003) trình bày về Theobromin và các công trình nghiên cứu liên quan như sau:

Ca cao chứa hợp chất Theobromin, nó là một alkaloid có tính đắng tương tự như Cafein Theobromin được sử dụng trong điều trị sưng và phù nề

Theobromin cũng được sử dụng như một thuốc lợi tiểu và một chất kích thích tự nhiên tim mạch, tăng lưu lượng oxy đến các vùng khác nhau trong cơ thể Cải thiện lưu lượng máu, kích thích chức năng nhận thức và cải thiện trí nhớ

 Một nghiên cứu được công bố trong tháng 4 năm 2007 bởi Cơ quan lưu trữ nội khoa cho thấy, ca cao có hiệu quả giảm huyết áp hơn so với trà xanh và đen Mặc

dù Theobromin và Cafein là các alkaloid rất giống nhau nhưng Theobromin không gây nghiện như Cafein Nó có tác động ít hơn đối với hệ thống thần kinh trung ương hơn so với Cafein Theobromin không kích thích chức năng tim mạch ở mức

độ lớn hơn so với Cafein Mặc dù nó không được coi là có tác dụng sinh lý gây nghiện như Cafein nhưng nó lại có vai trò quan trọng trong việc gây nghiện sôcôla

 Các nhà nghiên cứu thuộc Trường Y Harvard đã nghiên cứu tác động tiêu thụ ca cao đến tỉ lệ bệnh tật của người dân Ấn Độ sống trên các hòn đảo ngoài khơi bờ biển Panama Họ đã tìm thấy sự giảm đáng kể tỷ lệ bệnh tim và ung thư của những người sông trên đảo so với nhóm người sống trên đất liền tiêu thụ ít ca cao hơn

 Trong một công trình nghiên cứu của tác giả R Bhattacharjee [12] và P Lava Kumar năm 2007 có bài viết như sau:

 Khoảng 3,5% Theobromin xuất hiện trong hạt ca cao khô, nó là một chất kích thích cơ bắp Tuy nhiên, hàm lượng Theobromin cao gây ra những tác hại như suy thận, suy tim, và yếu cơ Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, ca cao và sôcôla giàu flavonoid có tác dụng chống ôxi hóa, tốt cho hệ tim mạch và giảm huyết áp

Qua công trình nguyên cứu trên ta thấy được lợi ích mà Theobromin mang lại, tuy nhiên hàm lượng Theobromin chỉ được sử dụng trong giới hạn cho phép Nếu dùng quá lượng thì gây tổn thương cơ thể

 Một bài viết của tác giả Marleny D A Saldana (2003)[29] đã chỉ ra rằng: “Tách chiết alkaloid bằng CO2 siêu tới hạn” Đây là bài viết rất hay viết về các phương pháp tách chiết alkaloids như sau:

 Alkaloid thường được tách chiết từ các sản phẩm bằng cách sử dụng dung môi chiết xuất thông thường qua các quá trình như chưng cất phân đoạn, kết tinh phân đoạn, cũng như công nghệ mới và đầy hứa hẹn bằng việc sử dụng carbon dioxide siêu tới hạn

 Tiềm năng ứng dụng của các quá trình trên được xác định bởi một mối quan

hệ giữa tính chi phí và tính chọn lọc Đối với sản xuất khối lượng lớn, xu hướng để lựa chọn thông thường là các quá trình được đề cập ở trên, khi họ chỉ yêu cầu thiết bị thông thường Tuy nhiên, các quá trình này lại có nguy cơ ô nhiễm do dư lượng các dung môi hóa học được sử dụng trong tách chiết còn sót lại và có thể làm biến đổi chất lượng của sản phẩm do sử dụng nhiệt độ cao trong quá trình chưng cất Tách chiết bằng dioxide carbon siêu tới hạn đòi hỏi chi phí đầu tư cao hơn nhưng nhờ tính chọn lọc cao, do đó, nó được khuyến khích cho việc tách chiết và tinh chế các sản phẩm có giá trị như alkaloid Với công nghệ này, tách chiết và tinh chế được tiến hành đồng thời, dung môi của các chất lỏng siêu tới hạn có thể dễ dàng thay đổi trong các biến đổi của nhiệt độ và áp suất nhiệt động lực học Trong tách chiết bằng cacbon dioxide siêu tới hạn, có thể làm giảm nhiệt như quá trình tách chiết

 Ngiên cứu của tác giả Sena, A.R.(2011)[30] , Kasabe A J và Badhe, G B (2010) [23] , giới thiệu về phương pháp định lượng Theobromin bằng phương pháp

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp tia cực tím (HPLC-UV), đây là phương pháp rất hiện đại, cho phép xác định Theobromin có độ chính xác rất cao, thời gian ngắn, có tính chọn lọc cao Tuy nhên phương pháp này đòi hỏi phải có thiết bị phân tích hiện đại, chi phí phân tích mẫu cao Ngoài ra còn có các phương pháp hiện đại khác dùng để định lượng Theobromin như là: Quang phổ UV-Vis, quang phổ cận hồng ngoại (NIRS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)… Các phương pháp này đều cho kết quả chính xác, thời gian phân tích nhanh, nhưng đòi hỏi thiết bị hiện đại, chi phí cao

 Nghiên cứu của Saldana[29]

, M D A., Mohamed, R S năm 2003 đã chỉ ra rằng:

