Nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ nội tạng cá chẽm (lates calcarifer) và thử nghiệm ứng dụng để sản xuất bột cá thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÂM TUYẾT HẬN NGHIÊN CỨU THU CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT BỘT CÁ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SỸ KĨ THUẬT Nha Trang - 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÂM TUYẾT HẬN NGHIÊN CỨU THU CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT BỘT CÁ THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60.54.10 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ VĂN NINH: Nha Trang - 2009 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nêu luận văn trung thực, chưa công bố cơng trình Tác giả luận văn Lâm Tuyết Hận ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn, trước hết xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Chế biến kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin giành cho thầy: TS Đỗ Văn Ninh - Phó Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang tận tình hướng dẫn động viên tơi suốt q trình thực luận văn Xin cám ơn: TS Nguyễn Anh Tuấn - Trưởng khoa Chế biến, GS TS Trần Thị Luyến, TS Nguyễn Thị Nga, PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện Cơng nghệ Sinh học, TS Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường -Trường Đại học Nha Trang thầy cô phản biện cho lời khuyên q báu để cơng trình nghiên cứu hồn thành có chất lượng Đặc biệt xin ghi nhận tình cảm, giúp đỡ của: cán thuộc Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, quý thầy cô giáo Khoa Chế biến bạn bè chia sẻ tơi q trình nghiên cứu iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE .4 1.1.1 Phân loại enzyme protease:[03], [06], [45], [48] .4 1.1.2 Protease cá động vật thuỷ sản [04], [34] 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme [06], [34], [44], [45] 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG PROTEASE NỘI TẠNG CỦA ĐỘNG VẬT THỦY SẢN [06], [11], [12], [34], [39], [42], [43] 12 1.2.1 Một số nghiên cứu protease nội tạng động vật thủy sản 12 1.2.2 Ứng dụng protease chế biến thủy sản 14 1.3 NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN THỦY SẢN Ở NƯỚC TA [34] 16 1.3.1 Những vấn đề tồn nghiên cứu ứng dụng protease chế biến 16 1.3.2 Hướng phát triển nghiên cứu ứng dụng protease, CPE nội tạng cá chế biến thủy sản nước ta.[34] 17 1.4 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHẼM VÀ PHẾ LIỆU CÁ CHẼM TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN[04], [16] .20 1.4.1 Giới thiệu cá Chẽm 20 1.4.2 Giới thiệu phế liệu ngành chế biến thuỷ sản Việt Nam [57] 23 1.5 GIỚI THIỆU VỀ BỘT CÁ VÀ PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PROTEASE ĐỂ SẢN XUẤT BỘT CÁ THỦY PHÂN TỪ CÁ NỤC [06], [29], [33] .24 iv CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26 2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme protease .26 2.1.2 Nguyên liệu cá sử dụng để thủy phân thu bột đạm .26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Sơ bố trí thí nghiệm tổng quát .27 2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu enzyme nội tạng cá Chẽm 28 2.2.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease DC CPE 32 2.2.4 Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho trình thủy phân thịt cá Nục chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm 34 2.3 Các phương pháp nghiên cứu: .37 2.3.1 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson [06] 37 2.3.2 Phương pháp phân tích 37 2.3.3 Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu sử dụng 38 2.3.4 Pháp xử lý số liệu 38 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 THÀNH PHẦN KHỐI LƯỢNG CỦA CÁ CHẼM 39 3.2 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA PROTEASE NỘI TẠNG CÁ CHẼM .39 3.2.1 Xác định điều kiện ủ thích hợp 39 3.2.2 Xác định dung môi chiết rút enzyme từ nội tạng cá Chẽm 42 3.2.3 Xác định tỷ lệ nước cất nội tạng cá 43 3.2.4 Xác định trình kết tủa enzyme 44 3.2.5 Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease DC CPE 47 3.2.6 Đề xuất quy trình thu nhận CPE nội tạng cá Chẽm 51 3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN THỊT CÁ NỤC BẰNG CPE NỘI TẠNG CÁ CHẼM 54 3.3.1 Thành phần hoá học cá Nục 54 3.3.2 Nghiên cứu chế độ thủy phân thịt cá Nục CPE nội tạng cá Chẽm 55 3.4 QUI TRÌNH ĐỀ XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT CÁ NỤC 77 v 3.4.1 Đề xuất qui trình 77 3.4.2.Thuyết minh qui trình 78 3.4.3 Sơ tính tốn chi phí ngun liệu sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Nục 78 3.4.4 Sản xuất thử bột cá Nục theo quy trình đề xuất 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO .83 PHẦN PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CPE: chế phẩm enzyme chế phẩm thu từ trình kết tủa protease nội tạng cá Chẽm DC: dịch chiết ĐC: đối chứng NC: nghiên cứu Naa: hàm lượng nitơ axit amin định lương theo phương pháp Sorensen (phương pháp formol) NNH3: nitơ NH3 NTS: nitơ tổng số pHopt: pH thích hợp topt: nhiệt độ thích hợp T: thời gian V: thể tích TN: tự nhiên vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần khối lượng cá Chẽm (% so với toàn thể) 39 Bảng 3.2 Kết thu nhận protease từ nội tạng cá Chẽm .53 Bảng 3.3 Sơ tính tốn giá thành cho 100g protease CPE (1,24 UI/g) 53 Bảng 3.4 Thành phần khối lượng thịt cá Nục (%) 54 Bảng 3.5 Thành phần hoá học chủ yếu cá Nục .54 Bảng 3.6 Thành phần amino acid tự thịt cá Nục tươi 55 Bảng 3.7 Trạng thái cảm quan mẫu thủy phân thịt cá Nục CPE nội tạng cá Chẽm 56 Bảng 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ muối bổ sung tới thay đổi trạng thái cảm quan mẫu thủy phân thịt cá Nục CPE 60 Bảng 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ nước bổ sung tới thay đổi trạng thái cảm quan mẫu thủy phân thịt cá Nục CPE 64 Bảng 3.10 Ảnh hưởng pH tới thay đổi trạng thái cảm quan mẫu thủy phân thịt cá Nục CPE 67 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ tới thay đổi trạng thái cảm quan mẫu thủy phân thịt cá Nục CPE 70 Bảng 3.12 Sự biến đổi trạng thái cảm quan hỗn hợp theo thời gian thủy phân .75 Bảng 3.13 Sơ tính tốn giá thành cho bột đạm thủy phân từ thịt cá Nục (trong 100kg thịt cá) 79 Bảng 3.14 Trạng thái cảm quan bột đạm thủy phân từ thịt cá Nục 79 Bảng 3.15 Thành phần hóa học bột đạm .80 Bảng 3.16 kết kiểm nghiệm vi sinh bột đạm thủy phân cá Nục .80 Bảng 3.17 Thành phần axit amin bột đạm thủy phân từ cá Nục 81 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 2.1.Cá Chẽm (Lates calcarifer) 26 Hình 2.2 Cá Nục thn (Decapterus macrosoma) .26 Hình 2.3 Sơ đồ tách chiết protease từ nội tạng cá Chẽm .27 Hình 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ ủ tới hoạt tính protease nội tạng cá Chẽm 40 Hình 3.2 Ảnh hưởng thời gian ủ tới hoạt tính protease nội tạng cá Chẽm 41 Hình 3.3 Ảnh hưởng dung mơi chiết đến hoạt tính protease nội tạng cá 42 Hình 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ dịch chiết đến hoạt tính protease nội tạng cá 43 Hình 3.5 Ảnh hưởng tác nhân kết tủa tới hoạt tính protease CPE 44 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ aceton (%) đến hoạt tính enzyme .45 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian tủa đến hoạt tính protease CPE .46 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme DC CPE 47 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme .49 Hình 3.10 Độ bền nhiệt enzyme nội tạng cá Chẽm 50 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ muối ăn tới hoạt tính enzyme protease nội tạng cá Chẽm .48 Hình 3.12 Quy trình thu nhận CPE nội tạng cá Chẽm 52 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ CPE tới hàm lượng protein mẫu thủy phân 58 Hình 3.14 Ảnh hưởng tỷ lệ CPE tới hàm lượng NH3 mẫu thủy phân 58 Hình 3.15 Ảnh hưởng tỷ lệ CPE tới hàm lượng Naa mẫu thủy phân 59 Hình 3.16 Ảnh hưởng tỷ lệ muối ăn tới hàm lượng protein mẫu thủy phân .61 Hình 3.17 Ảnh hưởng tỷ lệ muối ăn tới hàm lượng Naa mẫu thủy phân 62 e Bảng 1.21.Ảnh hưởng nồng độ muối đến hoạt độ enzyme DC CPE DC Nồng độ muối ăn(%) UI/ml CPE Hoạt độ tương đối (% so với ban đầu) UI/ml Hoạt độ tương đối (% so với ban đầu) 1.273 100.00 1.230 100.00 1.24 97.41 1.207 98.10 1.21 95.05 1.173 95.40 1.178 92.54 1.127 91.60 1.125 88.37 1.043 84.80 1.08 84.84 0.996 81.00 1.004 78.87 0.975 79.30 0.983 77.22 0.959 78.00 0.967 75.96 0.935 76.00 0.946 74.31 0.903 73.40 10 0.914 71.80 0.866 70.40 11 0.866 68.03 0.829 67.40 12 0.8 62.84 0.777 63.20 13 0.581 45.64 0.533 43.30 14 0.407 31.97 0.374 30.40 15 0.148 11.63 0.119 9.70 16 0.074 5.81 0.049 4.00 17 0.037 2.91 0.020 1.60 18 0.00984 0.77 0.010 0.80 19 0.00861 0.68 0.009 0.70 20 0.00492 0.39 0.005 0.40 f PHỤ LỤC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN THỊT CÁ NỤC BẰNG PROTEASE 2.1 Xác định tỷ lệ bổ sung protease CFE thích hợp tới q trình thủy phân Bảng 2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ CFE đến hàm lượng protein hòa tan mẫu thủy phân thịt cá Nục (0%) (1%) (2%) (3%) (4%) Thời Protein Protein Protein Protein Protein gian tương tương tương tương tương thủy Protein đối(% Protein đối (% Protein đối (% Protein đối (% Protein đối (% phân (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so với (h) ban ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) đầu) 39.07 100.00 39.07 100.00 39.07 100.00 39.07 100.00 39.07 100.00 52.58 134.57 55.16 141.17 61.39 157.14 61.48 157.36 64.83 165.94 108.36 277.35 135.67 347.26 143.03 366.08 149.61 382.92 149.52 382.71 112.62 288.25 144.71 370.37 160.36 410.45 191.24 489.49 203.31 520.37 140.28 359.04 182.90 468.13 208.06 532.53 210.63 539.11 215.52 551.63 10 160.28 410.23 188.71 482.99 216.19 553.34 218.61 559.53 221.80 567.70 Bảng 2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ CFE đến hàm lượng NH3 mẫu thủy phân thịt cá Nục (0%) (1%) Thời NH3 gian tương thủy NH3 đối(% NH3 phân (mg/g) so với (mg/g) (h) ban đầu) (2%) (3%) (4%) NH3 NH3 NH3 NH3 tương tương tương tương đối (% NH3 đối (% NH3 đối (% đối (% NH3 so (mg/g) (mg/g) so với (mg/g so với so với với ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) 0.329 100.00 0.329 100.00 0.329 100.00 0.329 100.00 0.329 100.00 0.346 105.15 0.359 109.09 0.373 113.33 0.415 126.06 0.422 128.18 0.366 111.21 0.379 115.15 0.390 118.48 0.461 140.00 0.474 143.94 0.389 118.18 0.394 119.70 0.411 124.85 0.488 148.18 0.496 150.91 0.395 120.00 0.402 122.12 0.432 131.21 0.494 150.00 0.504 153.33 10 0.412 125.15 0.419 127.27 0.436 132.42 0.518 157.58 0.549 166.97 g Bảng 2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ CFE đến hàm lượng Naa mẫu thủy phân thịt cá Nục (0%) (1%) (2%) (3%) (4%) Naa Thời Naa Naa Naa Naa tương gian tương tương tương tương thủy Naa đối(% Naa đối (% Naa đối (% Naa đối (% Naa đối (% so phân (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) (mg/g) so với (mg/g so với với (h) ban ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) đầu) 6.30 100.00 6.30 100.00 6.30 100.00 6.30 100.00 6.30 100.00 8.51 135.08 9.45 150.05 10.08 160.05 10.08 160.05 10.08 160.05 9.45 150.05 10.08 160.05 11.65 184.97 12.61 200.16 12.98 206.08 10.89 172.86 12.02 190.74 13.26 210.48 13.84 219.63 14.58 226.14 11.21 177.86 12.61 200.11 13.86 220.05 14.13 240.16 14.83 251.27 10 11.37 180.53 13.01 206.51 14.43 229.10 14.82 245.87 15.10 255.50 2.2 Xác định nồng độ muối ăn bổ sung thích hợp cho q trình thủy phân Bảng 2.4 Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hàm lượng protein hoà tan mẫu thủy phân thịt cá Nục (0%) (1%) (2%) (3%) (4%) Thời Protein Protein Protein Protein Protein gian tương tương tương tương tương thủy Protein đối(% Protein đối (% Protein đối (% Protein đối (% Protein đối (% phân (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so với (h) ban ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) đầu) 42.08 100.00 42.08 100.00 42.08 100.00 42.08 100.00 42.08 100.00 171.20 406.84 161.59 384.00 169.78 403.47 159.16 378.22 148.32 352.47 213.39 507.12 214.64 510.08 203.29 483.09 182.12 432.81 173.31 411.85 247.72 588.68 255.43 607.00 230.73 548.31 199.93 475.12 189.05 449.26 266.37 633.00 262.58 624.00 251.46 597.57 234.86 558.12 198.51 471.75 10 276.04 656.00 269.31 640.00 256.88 610.45 242.00 575.08 221.31 525.92 h Bảng 2.5 Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hàm lượng NH3 mẫu thủy phân thịt cá Nục (0%) (1%) Thời NH3 gian tương thủy NH3 đối(% NH3 phân (mg/g) so với (mg/g) (h) ban đầu) (2%) (3%) (4%) NH3 NH3 NH3 NH3 tương tương tương tương đối (% NH3 đối (% NH3 đối (% đối (% NH3 so (mg/g) (mg/g) so với (mg/g) so với so với với ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) 0.324 100.00 0.324 100.00 0.324 100.00 0.324 100.00 0.324 100.00 0.445 137.27 0.389 120.00 0.370 114.29 0.347 107.14 0.330 101.79 0.533 164.55 0.454 140.00 0.444 137.14 0.412 127.14 0.391 120.79 0.731 225.76 0.663 204.55 0.648 200.00 0.602 185.71 0.572 176.43 0.810 250.00 0.787 242.86 0.773 238.57 0.727 224.29 0.690 213.07 10 0.829 255.76 0.810 250.00 0.791 244.29 0.741 228.57 0.704 217.14 Bảng 2.6 Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hàm lượng Naa mẫu thủy phân thịt cá Nục (0%) (1%) (2%) (3%) (4%) Naa Thời Naa Naa Naa Naa tương gian tương tương tương tương thủy Naa đối(% Naa đối (% Naa đối (% Naa đối (% Naa đối (% so phân (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) (mg/g) so với (mg/g so với với (h) ban ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) đầu) 6.25 100.00 6.25 100.00 6.25 100.00 6.25 100.00 6.25 100.00 6.40 102.40 6.83 109.29 7.59 121.43 7.16 114.49 6.82 109.19 7.19 115.00 8.07 129.16 8.30 132.86 8.02 128.27 7.69 122.97 7.59 121.51 9.33 149.35 10.00 159.93 9.48 151.72 8.63 138.02 7.90 126.37 10.40 166.33 10.73 171.62 10.44 167.11 9.19 147.03 10 8.56 136.98 11.51 184.11 12.22 195.49 11.64 186.24 10.13 162.01 i 2.3 Xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho q trình thủy phân Bảng 2.7 Ảnh hưởng tỷ lệ nước bổ sung đến hàm lượng protein hòa tan mẫu thủy phân thịt cá Nục Thời gian thủy phân (h) (0%) (10%) (20%) (30%) Protein Protein Protein Protein tương Protein Protein tương đối Protein tương đối Protein tương đối đối(% so (mg/g) với ban (mg/g) (% so với (mg/g) (% so với (mg/g) (% so với ban đầu) ban đầu) ban đầu) đầu) 49.22 100.00 49.22 100.00 49.22 100.00 49.22 100.00 79.97 162.48 93.22 189.40 93.39 189.75 110.55 224.61 114.77 233.18 122.98 249.87 166.77 338.83 170.64 346.69 118.21 240.17 136.45 277.22 208.10 422.80 192.15 390.38 180.23 366.18 213.39 433.55 251.37 510.71 241.52 490.70 10 192.15 390.38 220.88 448.76 260.83 529.93 251.11 510.19 Bảng 2.8 Ảnh hưởng tỷ lệ nước bổ sung đến hàm lượng NH3 mẫu thủy phân cá (0%) Thời gian NH3 thủy (mg/g) phân (h) (10%) (20%) (30%) NH3 NH3 tương NH3 NH3 tương tương NH3 NH3 đối (% NH3 tương đối đối (% so so (mg/g) với ban (% so với (mg/g) đối (% so (mg/g) với ban ban đầu) đầu) với ban đầu) đầu) 0.332 100.00 0.332 100.00 0.332 100.00 0.332 100.00 0.381 114.85 0.398 120.00 0.433 130.30 0.493 148.48 0.398 120.00 0.412 124.24 0.503 151.52 0.573 172.73 0.428 128.79 0.453 136.36 0.563 169.70 0.624 187.88 0.450 135.45 0.523 157.58 0.634 190.91 0.704 212.12 10 0.501 150.91 0.584 175.76 0.684 206.06 0.875 263.64 j Bảng 2.9 Ảnh hưởng tỷ lệ nước bổ sung đến hàm lượng Naa mẫu thủy phân thịt cá Nục (0%) (10%) (20%) (30%) Naa Naa Naa tương Naa tương tương tương Naa Naa đối(% so đối (% Naa đối (% so (mg/g) so với với ban (mg/g) đối (% (mg/g) so với ầu) ban với ban ban đầu) đầu) đầu) Thời gian thủy phân (h) Naa (mg/g) 6.26 100.00 6.26 100.00 6.26 100.00 6.26 100.00 6.53 104.39 6.59 105.31 7.01 112.04 6.80 108.72 6.91 110.38 7.17 114.59 7.92 126.52 7.57 121.04 7.60 121.41 8.01 128.02 9.01 144.02 8.60 137.51 8.45 135.02 8.92 142.61 9.56 152.78 9.26 148.01 10 9.01 144.04 9.62 153.72 10.30 164.69 10.01 160.04 2.4 Xác định pH thích hợp cho trình thủy phân Bảng 2.10 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng protein hoà tan mẫu thủy phân thịt cá Nục (pH TN) (pH= 7,0) Thời Protein gian tương thủy Protein đối(% Protein phân (mg/g) so với (mg/g) (h) ban đầu) (PH=8,0) (PH=9,0) (PH=10,0) Protein Protein Protein Protein tương tương tương tương Protein đối (% Protein đối (% Protein đối (% đối (% so với (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so với ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) 40.62 100.00 40.62 100.00 40.62 100.00 40.62 100.00 40.62 100.00 79.97 196.88 93.22 229.50 108.58 267.30 119.20 293.45 122.08 300.55 106.60 262.43 113.05 278.31 117.35 288.90 182.60 449.53 188.02 462.87 128.58 316.53 157.91 388.75 180.10 443.39 203.89 501.94 208.36 512.95 149.27 367.47 170.64 420.09 208.40 513.06 240.92 593.11 234.73 577.86 10 155.97 383.98 187.72 462.13 213.09 524.60 254.99 627.73 242.08 595.97 k Bảng 2.11 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng NH3 mẫu thủy phân thịt cá Nục (pH TN) (pH= 7,0) Thời NH3 gian tương thủy NH3 đối(% NH3 phân (mg/g) so với (mg/g) (h) ban ầu) (PH=8,0) (PH=9,0) (PH=10,0) NH3 NH3 NH3 NH3 tương tương tương tương đối (% NH3 NH3 đối (% NH3 đối (% đối (% so (mg/g) so với (mg/g) so với so với (mg/g) với ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) 0.336 100.00 0.336 100.00 0.336 100.00 0.336 100.00 0.336 100.00 0.384 114.24 0.398 118.48 0.417 124.24 0.428 127.27 0.441 131.21 0.448 133.33 0.472 140.61 0.487 144.85 0.501 149.09 0.518 154.24 0.461 137.27 0.499 148.48 0.524 156.06 0.550 163.64 0.570 169.70 0.489 145.45 0.527 156.97 0.545 162.12 0.587 174.85 0.614 182.73 10 0.538 160.00 0.556 165.45 0.579 172.42 0.635 189.09 0.682 203.03 Bảng 2.12 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng Naa mẫu thủy phân thịt cá Nục (pH TN) (pH= 7,0) (PH=8,0) (PH=9,0) (PH=10,0) Naa Thời Naa Naa Naa Naa tương gian tương tương tương tương thủy Naa đối(% Naa đối (% Naa đối (% Naa đối (% Naa đối (% phân (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so (mg/g) so với (mg/g so với với (h) ban ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) đầu) 6.29 100.00 6.29 100.00 6.29 100.00 6.29 100.00 6.29 100.00 9.03 143.53 9.72 154.53 10.57 168.04 10.26 163.07 9.25 147.04 10.98 174.50 11.58 184.07 13.34 212.05 12.91 205.19 12.08 192.12 12.39 197.04 13.12 208.53 14.47 230.11 14.16 225.08 12.72 202.17 13.31 211.53 14.34 228.00 15.75 250.37 15.10 240.11 13.92 221.27 10 13.97 222.06 15.07 239.54 16.55 263.12 16.11 256.14 15.29 243.07 l 2.5 Xác định nhiệt độ thích hợp cho trình thủy phân Bảng 2.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng protein hòa tan mẫu thủy phân thịt cá Nục (30OC) (45 OC) Thời Protein gian tương thủy Protein đối(% Protein phân (mg/g) so với (mg/g) (h) ban đầu) (50OC) (55 OC) (60OC) Protein Protein Protein Protein tương tương tương tương Protein đối (% Protein đối (% Protein đối (% đối (% so với (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so với ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) 39.50 100.00 39.50 100.00 39.50 100.00 39.50 100.00 39.50 100.00 90.27 228.54 91.11 230.65 95.71 242.30 84.42 213.73 80.47 203.73 134.30 340.00 146.94 372.00 153.71 389.14 114.95 291.00 105.07 266.00 167.88 425.00 175.86 445.20 187.63 475.00 161.16 408.00 151.38 383.25 194.74 493.00 207.20 524.56 217.31 550.15 188.02 476.00 167.94 425.17 10 202.24 512.00 216.79 548.84 222.51 563.32 199.95 506.19 175.81 445.10 Bảng 2.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng NH3 mẫu thủy phân thịt cá Nục (30OC) (45OC) Thời NH3 gian tương thủy NH3 đối(% NH3 phân (mg/g) so với (mg/g) (h) ban ầu) 100% 0.330 (50OC) (55OC) (60 OC) NH3 NH3 NH3 NH3 tương tương tương tương đối (% NH3 đối (% NH3 đối (% đối (% NH3 so (mg/g) (mg/g) so với (mg/g so với so với với ban ban ban ban đầu) đầu) đầu) đầu) 0.330 100 0.330 100 0.330 100% 0.330 100 0.424 128.57 0.396 120.00 0.377 114.03 0.354 107.14 0.354 107.14 0.471 142.86 0.462 140.00 0.453 137.11 0.420 127.14 0.420 115.14 0.943 238.00 0.707 214.29 0.660 200.08 0.613 185.71 0.613 165.71 1.286 284.00 0.801 242.86 0.787 239.01 0.740 224.29 0.740 214.29 10 1.629 293.51 0.896 271.43 0.806 249.05 0.754 238.57 0.754 228.57 m Bảng 2.15 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng Naa mẫu thủy phân thịt cá Nục (30OC) (45 OC) (50 OC) (55OC) Naa Thời Naa Naa Naa tương gian tương tương tương thủy Naa đối(% Naa đối (% Naa đối (% Naa đối (% phân (mg/g) so với (mg/g) so với (mg/g) so (mg/g) so với với (h) ban ban ban ban ầu) đầu) đầu) đầu) (60OC) Naa (mg/g Naa tương đối (% so với ban đầu) 6.30 100.00 6.30 100.00 6.30 100.00 630.00 100.00 630.00 100.00 6.78 107.69 7.55 119.87 8.02 127.26 698.96 110.95 698.96 110.95 8.08 128.24 9.14 145.04 9.70 154.02 848.77 134.73 785.77 124.73 9.20 146.00 10.41 165.22 11.41 181.09 1000.19 158.76 968.69 153.76 9.58 152.02 12.15 192.78 13.55 215.00 1112.96 176.66 1049.96 166.66 10 9.91 157.31 13.27 210.57 14.98 237.82 1178.86 187.12 1122.16 178.12 2.6 Xác định thời gian thủy phân thịt cá Nục NH3 tương Protein Protein tương đối (% so với ban đối (% so (mg/g) đầu) với ban đầu) Thời gian thủy phân (giờ) Na.a (mg/g) Naa tương đối(% so với ban đầu) NNH3 (mg/g) 6.30 100.00 0.33 100.00 42.46 100.00 7.65 121.43 0.62 187.88 88.41 208.21 8.37 132.86 0.69 207.88 124.16 292.42 10.08 159.93 0.86 259.70 135.77 319.76 11.86 188.21 0.98 296.97 151.30 356.34 10 18.02 286.11 1.23 371.82 195.37 460.12 12 29.84 473.72 1.52 460.30 235.78 555.30 14 43.79 695.07 1.97 596.97 267.60 630.25 16 45.68 725.12 2.21 669.65 271.85 640.25 18 47.13 748.16 2.41 731.32 278.21 655.23 20 50.09 795.09 2.57 780.12 285.43 672.23 22 50.80 806.32 2.68 812.06 288.82 680.21 24 50.79 806.22 2.76 836.07 290.48 684.12 n PHỤ LỤC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Xác định hoạt độ enzyme protease theo phương pháp anson cải tiến [6, 29] 3.1.1.Nguyên tắc Dùng protein (casein hemoglobin) làm chất Xác định hoạt độ phân giải protein enzyme sở định hướng lượng sản phẩm tạo thành phản ứng phản ứng màu với thuốc thử folin –cio- calteau Dựa vào đồ thị chuẩn định lượng tyrozin tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân tác dụng enzyme Đơn vị hoạt độ proteolitic (HP) lượng enzyme mà phút 30 oC có khả phân giải protein tạo thành sản phẩm hoà tan acid tricloaxetic cho phản ứng màu với thuốc thử folin-cio-calteau tương đương với 1 mol tryrozin Hoạt độ riêng chế phẩm biểu diễn số đơn vị hoạt động proteolitic mg protein chế phẩm 3.1.2 Hoá chất cần + Dung dich tiêu chuẩn tyrozin (1mol/1ml): cân xác 18,12 mg tyrozin tinh khiết hồ tan dung dịch HCl 0,2 N, cho vào bình định mức 100 ml thêm dung dịch HCl 0,2N vào vạch mức Từ dung dịch pha loãng tiếp tục dung dịch HCl 0,2N để nhận dung dịch có nồng độ 0,01mol/ml Lập đồ thị tiêu chuẩn tyrozin: từ dung dịch dã pha loãng trên, lấy 1ml cho vào ống nghiệm, thêm 4ml dung dịch Na2CO3 6% lắc đều, thêm 1ml thuốc thử folin pha loãng lần, để 30 phút nhiệt độ phòng so màu máy so màu,vẽ đồ thị chuẩn: trục hoành ghi số mol tyrozin, trục tung ghi số đọc máy + Dung dịch chất: cân 2g casein hoà tan, cho vào cốc 100ml, thêm 30ml dung dịch NaOH 0,1N đun cách thuỷ khuấy tan hoàn toàn, để nguội dùng dung dịch HCl 0,1N để hiệu pH đến pH = Sau điều chỉnh cho vào ống đong thêm vào vạch 100ml + Thuốc thử folin- ciocalteau + Dung dịch Na2CO3 6%, dung d ịch acid triclo axetic 5% 3.1.3 Cách tiến hành: Chuẩn bị hai ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm ống kiểm tra Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch chất đạt đến 30C, giữ 10 phút 30C, cho 1ml dung dịch enzyme đạt đến 30 C tiếp tục giữ nhiệt độ 30C 10 phút sau cho o 5ml acid tricloaxetic 5% lắc giữ 30 phút nhiệt độ 30C , lọc lấy 1ml dịch lọc suốt cho vào ống nghiệm khác để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin: thêm vào 1ml dịch lọc 4ml Na2CO3 6% lắc đều, thêm 1ml thuốc thử folin pha loãng lần lắc giữ 30 phút nhiệt độ phòng, so màu máy so màu Ống kiểm tra: sau cho 2ml dung dịch chất cho 5ml dung dịch acid tricloaxetic 5% lắc cho 1ml dung dịch enzyme Các giai đoạn giống ống thí nghiệm 3.1.4.Tính kết quả: Lấy hiệu số đọc máy mẫu thí nghiệm (ETN) mẫu kiểm tra (EKT) Dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng tyrozin tương ứng Tính đơn vị hoạt động proteolitic 1ml dung dịch enzyme lấy xác định hoạt độ theo công thức: mol tyrozin đơn vị UI/ml = t Trong đó: 8: thể tích tồn hỗn hợp phản ứng (1 ml dung dịch chất, 1ml dung dịch enzyme, 5ml triaxetic) t: thời gian enzyme tác dụng với chất (10 phút) 3.2 Định lượng protein hoà tan theo phương pháp Lowry [6, 29, 20, 35] 3.2.1 Nguyên tắc Phương pháp định lương nghiên cứu mẫu có độ nhạy cao 10 lần so với phương pháp biuret Các axit amin có vịng thơm Tyr Trp có mặt protein phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau tạo thành phức chất màu xanh đen có độ hấp thụ cực đại bước sóng 650nm Dựa vào đường chuẩn protein để định lượng hàm lượng protein 3.2.2 Hóa chất sử dụng - Dung dịch albumin chuẩn 0,1% - Dung dịch A: Na2CO3 2% NaOH 0,1N - Dung dịch B: CuSO4 0,5% natri kali tatrat 1% - Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A B theo tỷ lệ 50/1 p 3.2.3 Cách tiến hành - Cho vào ống nghiệm lượng dung dịch mẫu tính tốn cho khối lượng protein có dung dịch khoảng từ 0,02÷0,32mg protein Thêm vào ống nghiệm 2ml dung dịch C lắc để yên 10 phút nhiệt độ phịng Sau thêm 1ml thuốc thử Folin pha loãng lắc để yên 30 phút cho thêm nước cất đủ 5ml Sau đem so màu bước sóng 650nm - Ống đối chứng: thay dung dịch mẫu nước cất tiến hành tương tự ống thí nghiệm - Dựng đường chuẩn protein: từ dung dịch protein chuẩn lấy vào ống nghiệm lượng protein sau: 20, 40, 60, 80, 100µg protein Thứ tự thành phần tỷ lệ hóa chất tương tự so màu bước sóng 650nm để dựng đường chuẩn protein 3.2.4 Tính kết Lấy hiệu số đọc máy ống thí nghiệm ống đối chứng sau đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng protein 3.3 Xác định NH3 theo phương pháp chưng cất lôi nước [6, 35] Nguyên lý Người ta dùng chất kiềm mạnh NH3 để đẩy khỏi thực phẩm dùng nước để lôi NH3, định hướng NH3 dung dịch acid tiêu chuẩn Tuy nhiên thực tế người ta dùng acid tiêu chuẩn dư để hấp thụ hết NH3 bay sau dùng kiềm tiêu chuẩn để định lượng acid dư cịn lại tính kết 3.4 Định lượng acid amin phương pháp formol [20, 29, 35] Nguyên lý Dựa vào tính trung tính acid amin dung dịch nước có chứa hai nhóm – COOH – NH2 phân ly Khi cho formol trung tính vào nhóm –NH2 kết hợp với formol tạo thành nhóm metylic (-N=CH2) làm cho acid amin tính kiềm, lúc tính acid nhóm –COOH rõ Khi ta định lượng dung dịch NaOH 0,1 N, từ lượng NaOH 0,1 N tiêu tốn ta tính hàm lượng nitơ có acid amin q PHỤ LỤC MỘT SỐ MÁY THIẾT BỊ DÙNG TRONG NC LUẬN VĂN Hình 1: Máy so màu Hình 2: Máy ly tâm lạnh ống nhỏ r Hình 3: Máy ly tâm lạnh lớn Hình 4: Tủ sấy chân khơng s Hình 5: Máy dập mẫu Hình 6:Máy đo pH Hình 7: Tủ ủ mẫu thuỷ phân ... lý nội tạng cá Chẽm để chiết rút, thu nhận dịch chiết nội tạng xử lý dịch chiết thu chế phẩm enzyme nội tạng cá Chẽm, từ xây dựng qui trình thu nhận chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm Nghiên cứu. .. enzyme protease từ nội tạng cá Chẽm (Lates calcarifer) thử nghiệm ứng dụng để sản xuất bột cá thực phẩm? ?? nhằm tăng giá trị sử dụng sử dụng triệt để nguồn phế liệu cá Chẽm nguyên liệu cá tạp, giảm...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÂM TUYẾT HẬN NGHIÊN CỨU THU CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT BỘT CÁ THỰC PHẨM Chuyên ngành: