Do các enzyme khi còn nằm trong tế bào thường ở dạng chưa hoạt động (zimogen) nên cần phải hoạt hóa enzyme. Năng lượng hoạt hóa cần cho cho quá trình hoạt hóa enzyme là nhiệt lượng cung cấp từ môi trường bằng cách ủ. Mỗi enzyme cần có một chế độ ủ thích hợp cho quá trình hoạt hóa.
Để xác định nhiệt độ ủ và thời gian ủ thích hợp cho hoạt hóa enzyme, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau:
10 30 ... 60 70 Ủ ở các nhiệt độ(00C) khác 25 30 … 55 60
Chọn nhiệt độ và thời gian ủ thích hợp
Ủ ở topt với các thời gian (phút)
Chiết rút bằng dung môi
Ly tâm lạnh
Xác định hoạt tính protease Nghiền nhuyễn Nội tạng cá Chẽm
29
2.2.2.2. Nghiên cứu chọn dung môi chiết
Xác định dung môi chiết thích hợp
Tiến hành chiết rút enzyme bằng các dung môi: nước cất, nước muối sinh lý, đệm phosphat 0,03M (pH=7), tỷ lệ 1/1, sau đó ly tâm lạnh, thu dịch chiết. Xác định hoạt tính protease từng dịch chiết, so sanh, chọn dung môi thích hợp. Bố trí thí nghiệm như sau:
Chiết bằng các dung môi
Nước cất Nước muối sinh lý Đệm phosphate (pH 7)
Xác định hoạt tính protease của DC Chọn chọn dung môi thích hợp Nghiền nhuyễn và ử với nhiệt độ,
thơì gian thích hợp Nội tạng cá Chẽm
30
Xác định tỷ lệ dung môi chiết và nguyên liệu thích hợp
Sau khi chọn được dung môi thích hợp, xác định tỷ lệ dung môi chiết và nguyên liệu. Bố trí thí nghiệm như sau:
2.2.2.3. Nghiên cứu chọn tác nhân kết tủa thu CPE
Xác định tác nhân kết tủa
Tiến hành tủa enzyme bằng các tác nhân: aceton 70%, ethanol 70%, (NH4)2SO4 70% trong thời gian 30 phút, nhiệt độ 4oC, sau đó ly tâm lạnh thu tủa, xác định hoạt tính protease. Bố trí thí nghiệm như sau:
Chiết bằng bằng dung môi thích hợp với các tỷ lệ
1/1 1,5/1 4/1
Xác định hoạt độ protease của DC Chọn chọn tỷ lệ dung môi thích hợp
Nghiền nhuyễn và ử với thời gian, nhiệt độ thích hợp Nội tạng cá Chẽm 3/1 …. Aceton Kết tủa lạnh bằng các tác nhân kết tủa: Ammonium suphate Ethanol
Xác định hoạt tính protease của CPE Chọn tác nhân kết tủa thích hợp
31
Xác định nồng độ tác nhân kết tủa
Tiến hành chọn nồng độ tủa ở các nồng độ: 40, 50, 60, 70, 80, 90% trong thời gian 30 phút, nhiệt độ 4oC sau ly tâm lạnh, thu tủa, xác định hoạt tính protease. Bố trí thí nghiệm như sau:
Xác định thời gian kết tủa
Tiến hành tủa protease lần lượt thời gian là: 15, 20, 30, ...120 phút, xác định hoạt tính protease. Bố trí thí nghiệm mhư sau:
DC
Kết tủa bằng tác nhân tủa thích hợp ở các nồng độ khác nhau
40% 50% … 80% 90%
…
Xác định hoạt độ protease của các CPE
Chọn nồng độ tác nhân kết tủa thích hợp
DC
Kết tủa lạnh với aceton nồng độ thích hợp ở thời gian: (phút)
15 30 … 115 120
…
Xác định hoạt tính protease của các CPE Chọn thời gian kết tủa thích hợp
32