2.1.1. Nguồn thu nhận enzyme protease
Đối tượng dùng để nghiên cứu tách chiết protease là nội tạng cá Chẽm (Hình 2.1) Tên khoa học: Lates calcarifer
Tên tiếng Anh: Seabass.
Nguồn thu enzyme la nội tạng cá Chẽm được thu gom tại nhà máy Chế Biến Xuất Nhập Khẩu Và Dịch Vụ Thủy Sản Cà Mau ngay sau khi fillet và được bảo quản lạnh, thời gian bảo quản lạnh không quá 5 giờ. Nội tạng thu được loại bỏ sạch mỡ, gan, bong bóng, trứng, còn lại dạ dày, ruột, tụy tạng đưa đi bảo quản ngay. Nếu thời gian dài hơn, nội tạng cá Chẽm được cấp đông và bảo quản lạnh. Nội tạng thu được phải từ cá Chẽm còn tươi tốt, cá Chẽm nuôi quảng canh hoặc tự nhiên.
Hình 2.1.Cá Chẽm (Lates calcarifer) 2.1.2. Nguyên liệu cá sử dụng để thủy phân thu bột cá
Cá Nục nguyên liệu: Cá Nục thuôn (Hình 2.2) Tên khoa học: Decapterus macrosoma
Tên tiếng Anh: Layang scad Cá thuôn có sản lượng khá cao
Vùng phân bố: vịnh Bắc Bộ, vùng biển Trung Bộ và Tây Nam Bộ Mùa vụ khai thác : Quanh năm.
Cá Nục dùng làm thí nghiệm được mua tại tàu đánh bắt của các ngư dân huyện Trần Văn Thời tỉnh Cà Mau. Cá Nục phải tươi đảm bảo yêu cầu kỹ thuật theo tiêu chuẩn TCVN 3250-88.
27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.3. Sơ đồ tách chiết protease từ nội tạng cá Chẽm
Từ sơ đồ tổng thể trên ta bố trí thí nghiệm để xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết enzyme như sau:
NC K/N Thủy phân sản xuất bột cá Nục
Dung môi chiết
Tỷ lệ dm/nội tạng Bảo quản ủ Ly tâm lạnh Chiết rút DC Xử lý Kết tủa CPE Ly tâm lạnh
KN chịu muối,t0opt, pHopt Độ bền nhiệt Tác nhân tủa T, nồng Nội tạng cá Chẽm Nhiệt độ Thời gian
28
2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu về enzyme nội tạng cá Chẽm 2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình ủ 2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình ủ
Do các enzyme khi còn nằm trong tế bào thường ở dạng chưa hoạt động (zimogen) nên cần phải hoạt hóa enzyme. Năng lượng hoạt hóa cần cho cho quá trình hoạt hóa enzyme là nhiệt lượng cung cấp từ môi trường bằng cách ủ. Mỗi enzyme cần có một chế độ ủ thích hợp cho quá trình hoạt hóa.
Để xác định nhiệt độ ủ và thời gian ủ thích hợp cho hoạt hóa enzyme, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau:
10 30 ... 60 70 Ủ ở các nhiệt độ(00C) khác 25 30 … 55 60
Chọn nhiệt độ và thời gian ủ thích hợp
Ủ ở topt với các thời gian (phút)
Chiết rút bằng dung môi
Ly tâm lạnh
Xác định hoạt tính protease Nghiền nhuyễn Nội tạng cá Chẽm
29
2.2.2.2. Nghiên cứu chọn dung môi chiết
Xác định dung môi chiết thích hợp
Tiến hành chiết rút enzyme bằng các dung môi: nước cất, nước muối sinh lý, đệm phosphat 0,03M (pH=7), tỷ lệ 1/1, sau đó ly tâm lạnh, thu dịch chiết. Xác định hoạt tính protease từng dịch chiết, so sanh, chọn dung môi thích hợp. Bố trí thí nghiệm như sau:
Chiết bằng các dung môi
Nước cất Nước muối sinh lý Đệm phosphate (pH 7)
Xác định hoạt tính protease của DC Chọn chọn dung môi thích hợp Nghiền nhuyễn và ử với nhiệt độ,
thơì gian thích hợp Nội tạng cá Chẽm
30
Xác định tỷ lệ dung môi chiết và nguyên liệu thích hợp
Sau khi chọn được dung môi thích hợp, xác định tỷ lệ dung môi chiết và nguyên liệu. Bố trí thí nghiệm như sau:
2.2.2.3. Nghiên cứu chọn tác nhân kết tủa thu CPE
Xác định tác nhân kết tủa
Tiến hành tủa enzyme bằng các tác nhân: aceton 70%, ethanol 70%, (NH4)2SO4 70% trong thời gian 30 phút, nhiệt độ 4oC, sau đó ly tâm lạnh thu tủa, xác định hoạt tính protease. Bố trí thí nghiệm như sau:
Chiết bằng bằng dung môi thích hợp với các tỷ lệ
1/1 1,5/1 4/1
Xác định hoạt độ protease của DC Chọn chọn tỷ lệ dung môi thích hợp
Nghiền nhuyễn và ử với thời gian, nhiệt độ thích hợp Nội tạng cá Chẽm 3/1 …. Aceton Kết tủa lạnh bằng các tác nhân kết tủa: Ammonium suphate Ethanol
Xác định hoạt tính protease của CPE Chọn tác nhân kết tủa thích hợp
31
Xác định nồng độ tác nhân kết tủa
Tiến hành chọn nồng độ tủa ở các nồng độ: 40, 50, 60, 70, 80, 90% trong thời gian 30 phút, nhiệt độ 4oC sau ly tâm lạnh, thu tủa, xác định hoạt tính protease. Bố trí thí nghiệm như sau:
Xác định thời gian kết tủa
Tiến hành tủa protease lần lượt thời gian là: 15, 20, 30, ...120 phút, xác định hoạt tính protease. Bố trí thí nghiệm mhư sau:
DC
Kết tủa bằng tác nhân tủa thích hợp ở các nồng độ khác nhau
40% 50% … 80% 90%
…
Xác định hoạt độ protease của các CPE
Chọn nồng độ tác nhân kết tủa thích hợp
DC
Kết tủa lạnh với aceton nồng độ thích hợp ở thời gian: (phút)
15 30 … 115 120
…
Xác định hoạt tính protease của các CPE Chọn thời gian kết tủa thích hợp
32
2.2.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của DC và CPE
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease
Xác định nhiệt độ thích hợp (topt ) cho hoạt tính protease bằng cách cho protease tác động với cơ chất casein ở các nhiệt độ khác nhau: 5oC, 10oC, 15oC, 20oC,…. 90oC trong thời gian 10 phút. Sau đó tiến hành xác định hoạt tính protease. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Xác định độ bền nhiệt ảnh hưởng đến hoạt tính protease DC và CPE
Giữ enzyme ở nhiệt độ 60oC trong các khoảng thời gian khác nhau: 0; 10; 20, 40…60 phút. Sau đó nhanh chóng làm lạnh enzyme về nhiệt độ phòng và xác định hoạt tính protease. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau :
Chọn nhiệt độ thích hợp DC và CPE
Để cố định thời gian 30 phút với các nhiệt độ (oC)
5 10 … 80 90
…
Xác định hoạt tính protease của DC & CPE
DC và CPE
Giữ ở nhiệt 60 oC trong khoảng thời gian (phút)
0 10 … 50 60
Xác định hoạt tính protease của DC & CPE Kết luận về độ bền nhiệt của enzyme
33
Xác định độ của nồng độ muối ăn đến hoạt độ enzyme.
Tiến hành xác định khả năng chịu muối của DC và CPE, lần lượt qua các nồng độ: 1%, 2%, 3%, ...25%, sau đó xác định hoạt độ protease, so sanh chọn nồng độ thích hợp. Bố trí nghiệm như sau:
Xác định ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease DC và CPE
CPE Protease hòa cùng nước cất sau đó điều chỉnh pH của DC và CPE ở các giá trị : 2,0 ; 2,5; 3,0, 3,5, 4,0...11,0. xác định hoạt tính protease. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
2,0 DC và CPE Ở các giá trị pH 2,5 … 10,5 11,0 Xác định hoạt tính protease Xác định pH tối ưu DC và CPE ở các nồng độ muối ăn (%) 0 1,0 … 19,0 20,0
Xác định hoạt tính protease của DC & CPE Chọn nồng độ muối ăn thích hợp
34
2.2.4. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt cá Nục bằng chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm. bằng chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm.
Để có thể tìm được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân thịt cá Nục bằng protease từ nội tạng cá Chẽm, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình thuỷ phân
Thủy phân thịt cá Nục bằng CPE với tỷ lệ bổ sung vào các hỗn hợp khác nhau : 0% ÷4% so với nguyên liệu. Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ phòng, pH tự nhiên của thịt cá với tỷ lệ nước bổ sung là 20%, mỗi mẫu thủy phân chứa 200g thịt cá Nục. Sau các thời điểm 0; 2;…;10 giờ lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu: hàm lượng protein hòa tan, Naa và NNH3. Từ đó lựa chọn tỷ lệ CPE thích hợp cho quá trình thủy phân. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân
Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân, tiến hành 5 mẫu thí nghiệm (mỗi mẫu 200g thịt cá) thủy phân thịt cá Nục bằng CPE với tỷ lệ thích hợp ở pH tự nhiên và bổ sung 20% nước. Các mẫu thủy phân thực hiện ở: Nhiệt độ phòng, 45oC, 50oC, 55oC và 60oC. Sau đó lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu: protein hòa tan, Naa và NNH3 từ đó lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau :
Bổ sung CPE với các tỷ lệ (%)
0% 1% 2% 3% 4%
Thủy phân
Xác định protein hòa tan, Naa và NNH3 Chọn tỷ lệ enzyme thích hợp
35
Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến quá trình thuỷ phân
Để có thể lựa chọn tỷ lệ muối ăn thích hợp tiến hành bố trí thí nghiệm thủy phân thịt cá Nục trong điều kiện có bổ sung muối ăn với tỷ lệ:0% ÷ 4%. Sau đó lấy mẫu phân tích để chọn tỷ lệ muối ăn thích hợp. Sơ đồ bố thí nghiệm như :
Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thuỷ phân
Tiến hành xác định tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp khác nhau: 0%;10%, 20%; 30% so với nguyên liệu cá. Lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học. Từ đó chọn tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Chọn nhiệt độ thích hợp Thịt cá Nục + CPE
Thủy phân ở các nhiệt độ
Nhiệt độ 450C 50OC 550C 600C phòng
Xác định protein hòa tan, Naa và NNH3
Thịt cá Nục + CPE + Muối
Bổ sung muối ăn với các tỷ lệ (%)
Chọn tỷ lệ muối ăn thích hợp Xác định protein hòa tan, Naa và NNH3
36
Ảnh hưởng của pH đến quá trình thuỷ phân
Thủy phân ở các pH khác nhau:pH tự nhiên của thịt cá, pH 7, pH8, pH 9, pH 10. Sau đó lấy mẫu phân tích một số chỉ tiêu hóa học.
Từ đó chọn pH thích hợp cho quá trình thủy phân. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng protein tan, Naa và NNH3
Sau khi nghiên cứu chọn được các điều kiện nhiệt độ, pH, tỷ lệ CPE, tỷ lệ nước bổ sung và tỷ lệ muối bổ sung thích hợp. Tiến hành thí nghiệm chọn thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
Thịt cá Nục + CPE + Muối
Bổ sung nước với các tỷ lệ (%)
Chọn tỷ lệ nước thích hợp Xác định protein hòa tan, Naa và NNH3
0 10 20 30
Chọn pHthích hợp
Thịt cá Nục + CPE + Muối + Nước
Điều chỉnh pH ở các giá trị khác nhau
pH tự nhiên pH 7, 0 pH 8, 0 pH 9,0 pH 10,0
37
Thử nghiệm sản xuất bột đạm thủy phân từ thịt cá Nục
Sau khi chọn được các điều kiện thích hợp ở trên, tiến hành thử sản xuất bột
đạm theo điều kiện tối ưu đã lựa chọn và phân tích sơ bộ thành phần hóa học, thành phần axit amin của bột đạm sản xuất được.
2.3. Các phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson [06]
Nguyên tắc của phương pháp là dùng protein casein làm cơ chất xác định hoạt độ thủy phân protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để định lượng tương ứng với lượng sản phẩm tạo thành dưới tác dụng của enzyme. Tiến hành ở phụ lục 3.
2.3.2. Phương pháp phân tích.
- Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson, bước sóng 660 nm [06], [28].
- Phân tích hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry, quét ở bước sóng 650mm trên máy so màu.(xem phần phụ lục 3) [29], [35].
- Định lượng NTS theo phương pháp Kjeldahl [20]. - Định lượng Naa theo phương pháp Sorensen [20].
- Định lượng đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (theo TCVN 3705 – 1990). - Định lượng NNH3 theo phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước [20]. - Định lượng đạm formon theo phương pháp Sorensen [20].
Xác định thời gian thủy phân tối ưu Thịt cá + nước +[muối]tu+[CPE]tu +pHtu+totu
Thủy phân ở t0tư trong thời gian (giờ)
0 2 3 ... 20 22 24
38
- Định lượng lipit theo phương pháp Soxhlett [29], [35].
- Xác định hàm lượng nước theo phương pháp sấy ở 1050C [35]. - Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung ở 600oC [35]. - Kiểm tra cảm quan cá tươi theo TCVN 3250- 88 [37].
- Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật theo TCVN 4883-93, 4991-89.
- Xác định thành phần các acid amin bằng phương pháp sắc ký khí trên máy GC-FID.
2.3.3. Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng
- Cân điện tử Shimazu (Nhật), loại 3200g và 220g, độ chính xác 10-6 (g) - Máy ly tâm lạnh ống nhỏ Rotina – Đức
- Máy ly tâm lạnh thể tích lớn - Máy so màu
- Máy đo pH - Tủ hút khí độc
- Tủ sấy vuông, 0 3000C – Trung Quốc
- Lò nung vuông, XMT – 15, 12000C - Việt Nam - Thiết bị chưng cất đạm tổng quát - Đức
- Thiết bị chưng cất đạm đơn giản - Máy sấy chân không
- Các loại tủ giữ nhiệt 35oC, 40oC, 45oC…90oC - Tủ làm lạnh:
2.3.4. Pháp xử lý số liệu
- Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí nghiệm điều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm.
- Số liệu được xử lý để vẽ đồ thị trên phần mềm Excel với hệ số tương quan R≥ 0,95.
39
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THÀNH PHẦN KHỐI LƯỢNG CỦA CÁ CHẼM.
Kết quả xác định thành phần khối lượng của cá Chẽm trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Thành phần khối lượng của cá Chẽm (% so với toàn bộ cơ thể)
Thịt cá Đầu cá Xương cá Vây + vẩy Nội tạng Gan, bong bóng, mỡ
43,22 21,97 16,93 6,1 5,4 6,33
Kết quả cho thấy nội tạng cá chiếm tỷ lệ khá cao 5,4 % so với toàn bộ cơ thể cá, đây là phần không ăn được. Tuy nhiên không cao như một số loài cá như cá thu, cá ngừ [34] nhưng do kích thước khai thác từng cá thể của cá Chẽm lớn nên lượng nội tạng chẽm rất lớn. Trong quá trình chế biến, nội tạng cá cũng tách riêng ra khỏi phần thân. Do vậy, việc thu nhận và sử dụng nội tạng làm nguyên liệu thu CPE sẽ dễ dàng. Theo như Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng (1989), nguyên liệu thủy sản [04], Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến,
Công nghệ enzyme [06] và Phạm Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học và ứng dụng [12] enzyme protease có nhiều trong nội tạng, tụy tạng của cá.
3.2. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA PROTEASE NỘI TẠNG CÁ CHẼM. PROTEASE NỘI TẠNG CÁ CHẼM.
3.2.1. Xác định điều kiện ủ thích hợp
Nội tạng cá Chẽm sau khi nghiền nhuyễn không xác định hoạt tính ngay mà ủ ở chế độ thích hợp để chiết rút và thu CPE có hoạt tính cao. Các thông số cần xác định trong quá trình ủ gồm: Nhiệt độ, thời gian.
3.2.1.1. Ảnh hưởng nhiệt độ ủ
Nội tạng cá Chẽm sau khi loại bỏ mỡ, gan, bong bóng, tiếp theo là nghiền trong cói đá, sau đó hành giữ mẫu nội tạng cá đã nghiền trong thời gian 30 phút lần lượt lấy mẫu thí nghiệm ở các nhiệt độ: 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55, 60 (oC), mỗi nhiệt độ điều được hành thí nghiệm 3 lần, chiết rút protease bằng nước cất, ly tâm thu dịch chiết và xác định hoạt tính protease DC của 3 lần thí nghiệm, lấy kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm.
40
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ủ tới hoạt tính protease của DC nội tạng cá Chẽm trình bày trong bảng 1.1 phụ lục 1 và hình 3.1. 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 25 30 35 40 45 50 55 60 Nhiệt độ ủ (độ C) H o ạt đ ộ t ư ơ n g đ ố i (% so v ớ i c ự c