Ở nƣớc ta chƣa có quy trình chế biến để tận thu vỏ trái ca cao. Thông thƣờng, sau khi thu hoạch hạt thƣờng đƣợc tách khỏi trái, sau đó vỏ đƣợc bỏ lại ngay tại vƣờn. Việc này có lợi là giảm công vận chuyển nhƣng nếu để vỏ trái trên mặt đất mà không xử lý thì đây là môi trƣờng rất tốt cho nhiều loài sâu bệnh hại phát triển, phát tán và lây lan gây ô nhiễm môi trƣờng vì do vỏ trái ca cao khá giàu dinh dƣỡng. Do đó, việc tận dụng nguồn vỏ trái ca cao giàu dinh dƣỡng nhƣ một nguồn nguyên liệu chính để chế biến thành phân hữu cơ sinh học (dùng bón lại cho cây ca cao) hoặc thức ăn cho vật nuôi (trâu, bò, v.v..) sẽ góp phần nâng cao hiệu
20
quả kinh tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng, qua đó giúp cho việc trồng và chế biến ca cao đuợc phát triển một cách bền vững. Vì vậy năm 2007 Sở Khoa học và Công nghệ đã phối hợp với Viện Khoa học kỹ thuật Miền Nam tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu sử dụng vỏ trái ca cao làm nguyên liệu sản xuất phân bón hữu cơ sinh học chuyên dùng cho cây ca cao và thức ăn bổ sung trong khẩu phần ăn của bò tại Châu Thành, Bến Tre [40]. Qua nghiên cứu này, cho thấy khả năng ứng dụng của vỏ quả ca cao trong đời sống rất phổ biến, tạo ra sản phẩm có giá trị, các sản phẩm tái tạo phục vụ chăn nuôi, trồng trọt. Tuy nhiên, việc sử dụng vỏ quả ca cao là thức ăn gia súc cần lƣu ý về liều lƣợng bổ sung vào khẩu phần ăn, trong vỏ ca cao chứa một lƣợng Theobromin nhất định, nếu bổ sung quá nhiều thì gây tích lũy Theobromin trong cơ thể gia súc, gây độc, ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và sinh sản của chúng. Do đó, nghiên cứu tách chiết Theobromin từ vỏ ca cao, sau đó lấy phần bã vỏ ca cao ứng dụng làm thức ăn gia súc hoặc phân bón hữu cơ... là hƣớng nghiên cứu mang lại hiệu quả vô cùng lớn, tận dụng triệt để hoàn toàn phế thải vỏ quả ca cao.
Tác giả Nguyễn Văn Tặng [3] (2010) và Nguyễn Thị Hiền đã viết trong cuốn sách Công nghệ sản xuất chè, cà phê, ca cao nhƣ sau: Theobromin ở dạng tinh thể bé, màu trắng, có vị đắng, công thức phân tử là C7H8N4O2. Theobromin hòa tan trong clorofoc, axit axetic. Theobromin không những có trong hạt mà còn có trong vỏ quả ca cao, hàm lƣợng của nó chiếm từ 0,5-1,0% so với trọng lƣợng của vỏ.
Tác giả Hà Duyên Tƣ [6] và Đỗ Thị Tuyên[5],[39] đã viết : Theobromine thuộc nhóm alkaloit, là nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử có nhân dị vòng và có tính kiềm hoặc lƣỡng tính, nitơ trong phân tử alkaloid tạo nên đặc tính cơ bản của loại hợp chất này. Alkaloit trong thực tế tồn tại ở hai dạng là alkaloit bazơ và muối alkaloit. Các alkaloit bazơ thực tế không tan trong nƣớc nhƣng tan trong các dung môi hữu cơ nhƣ CHCl3, ete hoặc các ancol bậc thấp nhƣ: methnol, ethanol, propannol, buthanol.. Ngƣợc lại với bazơ, các muối alkaloit nói chung tan đƣợc trong nƣớc nóng và cồn nhƣng hầu nhƣ không tan trong dung môi hữu cơ nhƣ CHCl3, ete, benzene. Qua nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Tặng, Hà Duyên Tƣ [6] và Đỗ Thị Tuyên[5],[39] giúp ta biết đƣợc tính chất hóa học và vật lý của Theobromin, khả
năng hòa tan Theobromin trong các dung môi, lựa chọn các dung môi thích hợp sử dụng trong đề tài này.
Một số hƣớng nghiên cứu tận dụng vỏ quả ca cao của các sinh viên Trƣờng Đại học Nha Trang đƣợc thực hiện do thầy Nguyễn văn Tặng hƣớng dẫn:
“Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm nƣớc quả từ phế liệu vỏ quả ca cao” của sinh viênHuỳnh Văn Ngọt (2012).
”Nghiên cứu thử nghiệm lên men rƣợu vang từ phế liệu vỏ quả ca cao” của sinh viên Nguyễn Thị Út (2012).
“Nghiên cứu thử nghiệm thu nhận Gum từ phế liệu vỏ quả cacao” của sinh viên Phạm Thị Thạnh (2012)
“Nghiên cứu thử nghiệm thu nhận chất màu thô từ phế liệu vỏ cứng quả ca cao” của sinh viên Nguyễn Ngọc Tính (2012).
”Nghiên cứu thử nghiệm thu nhận pectin từ phế liệu vỏ quả ca cao” của sinh viên La Anh Hùng (2012)
Đây là các hƣớng nghiên cứu mới về vỏ quả ca cao do các sinh viên trƣờng Đại học Nha Trang thực hiện, tuy kết quả chỉ dừng là thử nghiệm ở phòng thí nghiệm nhƣng đó là cơ sở để đánh giá khả năng ứng dụng của vỏ quả ca cao, là kết quả cho các nghiên cứu sâu hơn về tận thu vỏ quả ca cao, nghiên cứu sản xuất trên qui mô lớn hơn, đƣợc chuyển giap công nghệ để ứng dụng vào trong thực tế.
Nghiên cứu tách chiết Theobromin từ phế liệu vỏ quả ca cao là lĩnh vực rất mới ở nƣớc ta. Hiện nay, ở nƣớc ta vẫn chƣa có công trình nghiên cứu cụ thể nào.
22
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Cây ca cao đƣợc trồng ở tỉnh Đắc Lắc, thuộc nhóm Forastero khi chín vỏ có màu vàng, trái ca cao sau khi chín đƣợc thu hái và vận chuyển về Nha Trang, tại đây vỏ ca cao đƣợc tách ra khỏi hạt và đƣợc xử lý làm sạch và phơi khô.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.2.1 Phạm vi nghiên cứu : 2.2.1 Phạm vi nghiên cứu :
Trong phòng thí nghiệm, do đó ta thƣờng lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thông thƣờng đó là dùng các dung môi hữu cơ. Vì tính chọn lọc không cao nên ta chấp nhận sai số hệ thống cho cả quá trình tách chiết.
2.2.2 Xây dựng quy trình tách chiết Theobromin dự kiến2.2.2.1 Quy trình nghiên cứu dự kiến: Hình 1.7 2.2.2.1 Quy trình nghiên cứu dự kiến: Hình 1.7 2.2.2.2 Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu vỏ ca cao:
Thu nhận vỏ quả ca cao sau khi tách lấy phần hạt, nếu không sử dụng ngay phải bảo quản vỏ ca cao trong điều kiện tốt nhất để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm sau này. Chất lƣợng nguyên liệu là yếu tố ảnh hƣởng lớn đến chất lƣợng sản phẩm sau này. Quả ca cao đƣợc chọn phải đạt đƣợc độ chín kỹ thuật, không bị úng thối, không bị sâu bệnh, không bị đen và nấm mốc.
Xử lý sơ bộ: phân loại, rửa, làm ráo, cắt nhỏ
Phân loại nhằm mục đích loại bỏ những quả kém phẩm chất, bị sâu bệnh, bị dập úng… không đạt chỉ tiêu chất lƣợng để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm sau này.
Rửa là công đoạn nhằm loại bỏ các tạp chất vô cơ (đất đá, cát bụi trong quá trình thu hái, vận chuyển). Ngoài ra, còn loại bỏ một phần lớn vi sinh vật trên bề mặt quả. Yêu cầu trong quá trình rửa là nguyên liệu sau khi rửa phải không dập nát, thời gian rửa ngắn, tốn ít nƣớc.
Làm ráo: nhắm mục đích tạo điều kiện thuân lợi cho quá trình cắt nhỏ dễ dàng hơn.
Cắt nhỏ: tạo điều kiện thuận cho quá trình sấy, quá trình sấy dễ dàng hơn thời gian sấy nhanh hơn Ngoài ra, cắt nhỏ còn tạo điều kiện cho quá trình nghiền dễ dàng hơn.
Trích ly: Trích ly bằng các dung môi đã chọn, tiến hành ở các điều kiện tối ƣu nhất để năng cao hiệu suất trích ly. Bố trí thí nghiệm lựa dung môi và thời gian trích ly cho thích hợp nhất.
Hình 1.7 Sơ đồ quy trình dự kiến chiết xuất Theobromin thô từ vỏ quả ca cao
Vỏ quả ca cao Xử lý sơ bộ Trích ly Lọc loại bã Cô quay Sấy phun Sản phẩm - Xác định dung môi trích ly - Xác định thời gian trích ly. - Xác định số lần trích ly - Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1
- Nhệt độ: Nhiệt độ sôi của dung môi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
24
Lọc bã:
Sau khi trích ly xong ta tiến hành lọc bã, loại bỏ phần bã vỏ quả ca cao và các tạp chất tạp chất khác tạo điều kiện thuận lợi cho các công đoạn tiếp theo. Ta tiến hành lọc qua bông gòn, tráng rửa bã, phễu lọc và bông gòn, sau đó tập trung dịch lọc.
Cô quay chân không:
Nhằm mục đích thu hồi dung môi cho lần trích ly sau, tăng nồng độ chất tan trong dung dịch, tạo điều kiên thuận lợi quá trình sấy phun sau này. Quá trình cô quay thực hiện bằng thiết bị cô quay chân không ở áp suất chân không 1000mpa, tốc độ quay của bình chứa mẫu là 40 vòng/phút, nhiệt độ cô quay là 45oC.
Sấy phun:
Sau quá trình cô quay chân không ta tiến hành sấy phun để thu sản phẩm. Đặc biệt sản phẩm sau khi sấy phun thì ở dạng bột không cần phải nghiền mẫu, thời gian sấy nhanh, đảm bảo đƣợc chất lƣợng sản phẩm. Mẫu đƣợc sấy phun ở nhiệt độ 1450
C. Sản phẩm sau khi đƣợc sấy phun đƣợc bao gói hút chân không, bảo quản lạnh.
2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm:
a.Bố trí thí nghiệm xác định thành phần khối lƣợng và thành phần hóa học của vỏ quả ca cao:
Mục đích: Xác định thành phần khối lƣợng của vỏ quả ca cao và thành phần hóa học có trong đó.
Cách tiến hành:
Lấy 3 quả ca cao đem đi cân rồi bổ đôi để xác định khối lƣợng các thành phần gồm vỏ quả, vỏ cứng, hạt.
Sau đó, lấy vỏ quả ca cao đem đi phân tích các chỉ tiêu hóa học gồm hàm lƣợng ẩm, tro, protein, lipid, Theobromin. Hàm lƣợng cacbohydrat đƣợc tính gần đúng theo công thức sau:
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.8
Hình 1.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần khối lƣợng và thành phần hóa học của vỏ quả ca cao
b.Bố trí thí nghiện lựa chọn dung môi trích ly: [5], [6], [10], [19], [21], [24], [32]
Các loại dung môi khác nhau sẽ phù hợp với việc trích ly các thành phần khác nhau vì chúng khác nhau về độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt.
Dựa vào tính chất vật lý của Theobromin mà ta lựa chọn dung môi trích ly sao cho phù hợp nhất, đạt hiệu suất trích ly cao nhất. Do đó, thí nghiệm nhằm xác định dung môi phù hợp để cho hiệu suất trích ly cao nhất.
Cách tiến hành: chuẩn bị 3 mẫu thí nghiệm trích ly tƣơng ứng với 3 dung môi là: nƣớc, cồn 70 (%V), cloroform (lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần)
Trích ly ở cùng điều kiện:
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1.
Thời gian trích ly: 30 phút, cho vào bể ổn nhiệt. Cân Quả ca cao Tách hạt Lipit Phần hạt Phần vỏ Xác định thành phần khối lƣợng vỏ quả và hạt Phân tích thành phần hóa học Protein Độ ẩm Theobromin Tro
26
Nhiệt độ sôi của mỗi dung môi: nƣớc ở 1000C, cồn 70 (%V) ở 79,80C, cloroform ở 61,20C.
Khối lƣợng mẫu ca cao: 10g.
Số lần trích ly: 1 lần
Mẫu 1: cân 10g mẫu vỏ ca cao khô trích ly bằng 270ml cloroform + 10 ml NH3 10% + 12g NaSO4 khan -> lọc -> cô quay đuổi dung môi (hoàn toàn) -> hòa tan lại trong nƣớc -> định mức 50 ml lấy 15ml cho vào ống nhựa (M1).
Mẫu 2: cân 10g mẫu vỏ ca cao khô trích ly bằng 270ml nƣớc cất + 10ml axit axetic 5% sau khi trích ly lọc -> định mức 50 ml -> lấy 15 ml cho vào ống nhựa có nắp đậy (M2).
Mẫu 3: cân 10g mẫu vỏ ca cao khô trích ly bằng 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5% lọc định mức 50 ml ->lấy 15ml cho vào ống nhựa có nắp đậy (M3). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gửi 3 mẫu trên đi phân tích HPLC-UV để đánh giá lựa chọn dung môi cho kết quả trích ly hàm lƣợng Theobromin cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.9
Vỏ quả ca cao
Trích ly
Chọn dung môi cho hàm lƣợng Theobromine cao nhất Phân tích HPLC-UV Cloroform Cồn 70 (%V) Nƣớc Lọc bã
Hình 1.9 Sơ đồ bố trí thí nghiện lựa chọn dung môi trích ly Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
c. Bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi phù hợp nhất, ta tiến hành bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly. Thời gian trích ly ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu suất trích ly và chất lƣợng của sản phẩm. Nếu thời gian trích ly ngắn thì không chiết đƣợc hết các chất trong nguyên liệu, nhƣng nếu thời gian trích ly quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho các công đoạn sau. Vì vậy cần phải bố trí nghiệm xác định thời gian phù hợp nhất.
Bố trí thí nghiệm: chuẩn bị 3 mẫu tƣơng ứng với thời gian trích ly là: 30 phút, 60 phút, 90 phút (lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần).
Trích ly trong cùng điều kiện:
Khối lƣợng mẫu ca cao: 10g
Dung môi: Cồn 70 (%V).
Nhiệt độ sôi: 800 C
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1.
Số lần trích ly: 1 lần.
Cân 10g mẫu vỏ ca cao, bổ sung 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%, cho vào bình tam giác 500ml có nắp đậy. Trích ly mẫu ở bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800C trong thời gian 60 phút (3 mẫu), 90 phút (3 mẫu). Sau đó lọc bã, đem cô quay loại dung môi cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml. Gửi mẫu phân tích hàm lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC- UV. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn thời gian cho kết quả Theobromin cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.10 d. Bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly:
Sau khi lựa chọn thời gian trích ly phù hợp ta tiến hành lựa chọn số lần trích ly nhằm mục đích tách chiết một cách triệt để Theobromine có trong nguyên liệu.
Bố trí thí nghiệm: chuẩn bị 2 mẫu tƣơng ứng với số lần trích ly là 1 lần, 2 lần, (lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần).
28
Hình 1.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
Trích ly trong cùng điều kiện:
Khối lƣợng mẫu ca cao: 10g
Dung môi: Cồn 70 (%V).
Nhiệt độ sôi: 800 C
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1.
Thời gian trích ly: 90 phút.
Mẫu 1: Cân 10g mẫu vỏ ca cao, trích ly bằng 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%. Cho vào bình tam giác 500 ml.
Cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800C, thời gian trích ly là 90 phút sau đó lọc lấy dịch. Đem cô quay loại dung môi cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml, cho vào ống nhựa đánh số (trích ly 1 lần).
Trích ly Vỏ quả ca cao (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30 phút
Chọn thời gian cho hàm lƣợng Theobromine cao nhất 90 phút Lọc bã Phân tích HPLC-UV 60 phút
Mẫu 2: Cân 10g mẫu vỏ ca cao, trích ly bằng 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%. Cho vào bình tam giác 500ml. Cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800
C, thời gian trích ly là 90 phút rồi lọc lấy dịch (trích ly lần 1). Bã còn lại đem đi cho vào bình tam giác 500ml, bổ sung 10ml axit axetic 5%, cộng thêm 270ml cồn 70 (%V). Tiến hành tƣợng tự nhƣ lần đầu, cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800
C. Thời gian 90 phút rồi lọc lấy dịch (trích ly lần 2). Sau đó cộng dịch lọc của 2 lần trích ly đem cô quay loại cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml, cho vào ống nhựa đánh số (trích ly 2 lần).
Gửi mẫu phân tích HPLC- UV. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn số lần trích ly cho kết quả hàm lƣợng Theobromin cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.11
Hình 1.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly 2.2.2.4 Phƣơng pháp phân tích HPLC-UV [7].
Thực hiện phân tích: cân 1 gram mẫu vào ống ly tâm 50 mL, thêm tiếp vào mẫu 20 mL nƣớc cất. Vortex 2 phút, đánh siêu âm trong vòng 15 phút. Ly tâm lấy phần
Trích ly Vỏ quả ca cao 2 lần Chọn số lần trích ly cho hàm lƣợng Theobromine cao nhất 1 lần Lọc Phân tích HPLC-UV
30
trong cho vào bình định mức 100 mL (lặp lại thêm 02 lần). Dung dịch thu đƣợc định mức 100 mL bằng nƣớc cất (có thể pha loãng mẫu nếu cần) qua màng lọc 13 mm, 0,45 m, thu dịch lọc -> Tiến hành phân tích trên máy HPLC/UV.
Điều kiện: - Bƣớc sóng: 272 nm. - Pha động: ACN: dd H3PO4 0.05% / 15:85. - Tốc độ dòng: 0,5mL/phút. - Cột: C18 (250 x 4,6 mm, 5μm) – Hiệu Merck. Tính kết quả: mau dm m