Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi phù hợp nhất, ta tiến hành bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly. Thời gian trích ly ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu suất trích ly và chất lƣợng của sản phẩm. Nếu thời gian trích ly ngắn thì không chiết đƣợc hết các chất trong nguyên liệu, nhƣng nếu thời gian trích ly quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho các công đoạn sau. Vì vậy cần phải bố trí nghiệm xác định thời gian phù hợp nhất.
Bố trí thí nghiệm: chuẩn bị 3 mẫu tƣơng ứng với thời gian trích ly là: 30 phút, 60 phút, 90 phút (lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần).
Trích ly trong cùng điều kiện:
Khối lƣợng mẫu ca cao: 10g
Dung môi: Cồn 70 (%V).
Nhiệt độ sôi: 800 C
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1.
Số lần trích ly: 1 lần.
Cân 10g mẫu vỏ ca cao, bổ sung 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%, cho vào bình tam giác 500ml có nắp đậy. Trích ly mẫu ở bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800C trong thời gian 60 phút (3 mẫu), 90 phút (3 mẫu). Sau đó lọc bã, đem cô quay loại dung môi cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml. Gửi mẫu phân tích hàm lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC- UV. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn thời gian cho kết quả Theobromin cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.10 d. Bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly:
Sau khi lựa chọn thời gian trích ly phù hợp ta tiến hành lựa chọn số lần trích ly nhằm mục đích tách chiết một cách triệt để Theobromine có trong nguyên liệu.
Bố trí thí nghiệm: chuẩn bị 2 mẫu tƣơng ứng với số lần trích ly là 1 lần, 2 lần, (lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần).
28
Hình 1.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
Trích ly trong cùng điều kiện:
Khối lƣợng mẫu ca cao: 10g
Dung môi: Cồn 70 (%V).
Nhiệt độ sôi: 800 C
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1.
Thời gian trích ly: 90 phút.
Mẫu 1: Cân 10g mẫu vỏ ca cao, trích ly bằng 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%. Cho vào bình tam giác 500 ml.
Cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800C, thời gian trích ly là 90 phút sau đó lọc lấy dịch. Đem cô quay loại dung môi cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml, cho vào ống nhựa đánh số (trích ly 1 lần).
Trích ly Vỏ quả ca cao
30 phút
Chọn thời gian cho hàm lƣợng Theobromine cao nhất 90 phút Lọc bã Phân tích HPLC-UV 60 phút
Mẫu 2: Cân 10g mẫu vỏ ca cao, trích ly bằng 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%. Cho vào bình tam giác 500ml. Cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800
C, thời gian trích ly là 90 phút rồi lọc lấy dịch (trích ly lần 1). Bã còn lại đem đi cho vào bình tam giác 500ml, bổ sung 10ml axit axetic 5%, cộng thêm 270ml cồn 70 (%V). Tiến hành tƣợng tự nhƣ lần đầu, cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800
C. Thời gian 90 phút rồi lọc lấy dịch (trích ly lần 2). Sau đó cộng dịch lọc của 2 lần trích ly đem cô quay loại cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml, cho vào ống nhựa đánh số (trích ly 2 lần).
Gửi mẫu phân tích HPLC- UV. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn số lần trích ly cho kết quả hàm lƣợng Theobromin cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.11
Hình 1.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly 2.2.2.4 Phƣơng pháp phân tích HPLC-UV [7].
Thực hiện phân tích: cân 1 gram mẫu vào ống ly tâm 50 mL, thêm tiếp vào mẫu 20 mL nƣớc cất. Vortex 2 phút, đánh siêu âm trong vòng 15 phút. Ly tâm lấy phần
Trích ly Vỏ quả ca cao 2 lần Chọn số lần trích ly cho hàm lƣợng Theobromine cao nhất 1 lần Lọc Phân tích HPLC-UV
30
trong cho vào bình định mức 100 mL (lặp lại thêm 02 lần). Dung dịch thu đƣợc định mức 100 mL bằng nƣớc cất (có thể pha loãng mẫu nếu cần) qua màng lọc 13 mm, 0,45 m, thu dịch lọc -> Tiến hành phân tích trên máy HPLC/UV.
Điều kiện: - Bƣớc sóng: 272 nm. - Pha động: ACN: dd H3PO4 0.05% / 15:85. - Tốc độ dòng: 0,5mL/phút. - Cột: C18 (250 x 4,6 mm, 5μm) – Hiệu Merck. Tính kết quả: mau dm m f P V C C 0 Trong đó:
- C: hàm lƣợng chất phân tích có trong mẫu, tính theo mg/kg.
- C0: hàm lƣợng chất phân tích trong dịch chiết thông qua đƣờng chuẩn, mg/L.
- mmẫu: lƣợng cân của mẫu thử, g. - P: độ tinh khiết của chất chuẩn. - Vdm: thể tích định mức mẫu, mL. - f: hệ số pha loãng (nếu có)
2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu:
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phƣơng pháp thống kê, mỗi thí nghiệm lặp 3 lần. Kết quả là trung bình cộng của các thí nghiệm lặp, xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và SPSS phiên bản 16 và vẽ đồ thị, biểu diễn kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU V THẢO LUẬN
3.1Kết quả xác định thành phần khối lƣợng và thành phần hóa học của quả ca cao: a. Thành phần khối lƣợng:
Bảng 2.1 Thành phần khối lƣợng của quả ca cao tƣơi.
Trong đó:
mquả : khối lƣợng quả ca cao
m vỏ quả ca cao: khối lƣợng vỏ quả ca cao
m hạt : khối lƣợng của hạt ca cao
Nhận xét: Qua bảng thành phần khối lƣợng của quả ca cao ta thấy, tỷ lệ của vỏ quả ca cao là rất lớn chiếm 75,65%. Trong khi, tỉ lệ hạt ca cao đƣợc sử dụng chỉ là 24,35%. Vì thế, việc tận dụng phế liệu vỏ quả ca cao để sản xuất Theobromin rất có hiệu quả, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.
b.Thành phần hóa học của vỏ quả ca cao
Bảng 2.2 : Thành phần hóa học của vỏ quả ca cao Chỉ tiêu (% tổng hàm lƣợng chất khô)
Độ ẩm Theobromin (mg/kg vỏ ca cao khô) Lipid Protein Tro Cacbohydrat
0,93 2,42 11,44 85,21 87,06 63,52
Nhận xét: Qua bảng thành phần hóa học của vỏ quả ca cao ta thấy, độ ẩm của vỏ quả ca cao rất lớn chiếm tới 87,06%, hàm lƣợng chất khô chỉ chiếm 12,94%. Trong đó, hàm lƣợng lipid và protein rất thấp chỉ chiếm 0,93 và 2,42% tổng hàm lƣợng
Mẫu mquả (kg) m vỏ quả ca cao (kg) m hạt (kg) % Vỏ quả % Hạt 1 1,86 1,31 0,55 70,43 29,57 2 1,84 1,44 0,4 78,26 21,74 3 1,84 1,44 0,4 78,26 21,74 Trung bình 75,65 24,35
32
chất khô tƣơng ứng. Hàm lƣợng tro cũng khá thấp chiếm 11,44% tổng hàm lƣợng chất khô. Cacbohydrat chiếm tỷ lệ cao tới 85,21% tổng hàm lƣợng chất khô nên sẽ ảnh hƣởng nhiều đến quá trình chiết sau này. Đặc biệt, hàm lƣợng Theobromin thấp chỉ chiếm 63,52 mg/kg vỏ khô. Vì vậy, trong nghiên cứu tiếp theo phải tìm phƣơng pháp hợp lý cho quá trình tách chiết Theobromin từ vỏ quả ca cao để đạt hiệu quả cao nhất.
3.2 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn và giản đồ sắc ký:
Nhận xét:
Qua hai giản đồ phân tích HPLC-UV của mẫu chuẩn (đồ thị 2.2) và mẫu phân tích (đồ thị 2.3) ta thấy Theobromin đƣợc phát hiện ở khoảng thời gian từ 6 - 6,2 phút, ở bƣớc sóng 272nm.
Từ sắc kí đồ Theobromin của mẫu phân tích và phƣơng trình đƣờng chuẩn của Theobromin ta tính đƣợc hàm lƣợng Theobromin trong mẫu vỏ quả ca cao phân tích là 0,02mg/L.
Phần nền sắc ký đồ Theobromin của mẫu phân tích (đồ thị 2.3) có bƣớc sóng rất cao, chứng tỏ trong mẫu phân tích có nhiều tạp chất, ảnh hƣởng đến nền sắc ký của Theobromin trong mẫu vỏ ca cao khô.
Nồng độ Theobromin (mg/L) uV
Đồ thị 2.2 Sắc ký đồ Thebromine mẫu chuẩn
Đồ thị 2.3Sắc ký đồ Thebromine của mẫu phân tích
3.3 Kết quả xác định dung môi chiết Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
Kết quả thí nghiệm xác định dung môi chiết đƣợc thể hiện trên đồ thị 2.1 nhƣ sau:
Hàm lƣợng Theobromin thô thu đƣợc:
Mẫu trích ly bằng cloroform có kết quả 0,92 mg/kg. Mẫu trích ly bằng nƣớc thu đƣợc 3,45 mg/kg.
34
Mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V) thu đƣợc 22,25 mg/kg.
Từ kết quả phân tích ở trên ta thấy, mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V) cho hàm lƣợng Theobromin cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với mẫu trích ly bằng cloroform và nƣớc.
Đồ thị 2.4 Kết quả lựa chọn dung môi Chú thích:
1: Mẫu vỏ ca cao khô.
2: Mẫu trích ly bằng cloroform. 3: Mẫu trích ly bằng nƣớc cất 4: Mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V)
Kí hiệu a, b, c, d chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
Nhận xét:
Từ kết quả thực nghiệm thu đƣợc thể hiện ở đồ thị 2.4 cho thấy mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V) cho kết quả cao nhất và khác biệt so với mẫu trích ly bằng chloroform và nƣớc cất, gấp 24,2 lần so với cloroform, gấp 6,4 lần so với nƣớc cất. Tuy nhiên, kết quả hàm lƣợng Theobromin của mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V) ở thời gian là 30 phút
thấp hơn nhiều so với hàm lƣợng Theobromin từ mẫu vỏ ca cao khô (Mẫu 1). Điều đó chứng minh rằng, thời gian trích ly 30 phút chƣa đủ để tách chiết hết Theobromin trong mẫu ca cao. Vì vậy cần bố trí thời gian trích ly mẫu ca cao hợp lý để hiệu suất trích ly là cao nhất.
Giải thích:
Trong cấu trúc phân tử của Theobromin có nhiều nhóm phân cực (–CO, -N=) hơn so với nhóm không phân cực (-CH3). Các nhóm phân cực này quyết định khả năng hòa tan của Theobromin trong các dung môi phân cực hơn là các dung môi không phân cực hoặc phân cực yếu. Vì vậy, Theobromin tan nhiều trong dung môi phân cực nhƣ là: cồn, nƣớc. Trong ba mẫu trích ly từ ba dung môi nhƣ: cồn 70 (%V), nƣớc, clorofoc. Mẫu ca cao trích ly bằng dung môi cồn 70 (%V) cho hàm lƣợng Theobromin cao nhất, khác biệt với các dung môi còn lại.
Từ kết quả này chọn cồn 70 (%V) làm dung môi.
3.4 Kết quả nghiên cứu xác định thời gian trích ly và số lần trích ly Kết quả đƣợc thể hiện dƣới đồ thị 2.5 Kết quả đƣợc thể hiện dƣới đồ thị 2.5
Đồ thị 2.5 Kết quả xác định thời gian, số lần trích ly Chú thích: 1: Mẫu trích ly 30 phút (1 lần) 2: Mẫu trích ly 60 phút (1 lần) Mẫu a b d c b
36
3: Mẫu trích ly 90 phút (1 lần) 4: Mẫu trích ly 90 phút (2 lần)
5: Mẫu trích ly 90 phút (1 lần) khử tạp bằng chì axetat
Kí hiệu a, b, c, d chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
Nhận xét:
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lƣợng Theobromin thu đƣợc ở điều kiện thời gian dài 90 phút khác biệt và cao gấp 1,7 lần so với 60 phút.
Không có sự khác biệt về hàm lƣợng Theobromin thu đƣợc khi số lần trích ly là 1 lần và 2 lần ở 90 phút.
Hàm lƣợng Theobromin sau khi khử tạp chất cao hơn so với khi chƣa khử tạp.
Giải thích:
Theo lý thuyết của trích ly thời gian càng dài thì lƣợng chất khuếch tán càng tăng, ở thời gian chiết 90 phút thì hầu nhƣ các tế bào của vỏ ca cao trƣơng nở tối đa nên giải phóng lƣợng chất Theobromin, nhƣng thời gian phải có giới hạn, khi đạt đƣợc mức độ trích ly cao nhất nếu kéo dài thời gian thì sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế. Nên 90 phút là thời gian thích hợp.
Ta thấy trên đồ thị 2.6, số lần chiết khác nhau thì hàm lƣợng Theobromin thu đƣợc cũng khác nhau. Số lần chiết càng tăng thì hàm lƣợng Theobromin thu đƣợc càng tăng, tổng hàm lƣợng Theobromin trong các lần chiết có tăng lên nhƣng không đáng kể. Điều này đƣợc giải thích dựa vào cấu trúc của nguyên liệu, vỏ ca cao sau khi làm khô đƣợc xay nhỏ đã phá vỡ cấu trúc tế bào, trong nguyên liệu Theobromin tập trung chủ yếu giữa các không bào, đƣợc bao bọc bởi lớp Cellulose và Lipoprotein. Nên chỉ cần phá vỡ cấu trúc này thì dễ dàng thu nhận đƣợc Theobromin. Quá trình phơi khô nhằm tăng hàm lƣợng chất khô tuyệt đối, xay làm phá vỡ cấu trúc tế bào nguyên liệu tạo điều kiện cho dung môi ngấm sâu vào trong, từ đó làm tăng hiệu quả chiết. Khi tăng số lần chiết hàm lƣợng Theobromin tăng, nhƣng tổng hàm lƣợng tăng của cả 2 lần chiết không nhiều. Cụ thể khi tăng số lần chiết (>2) thì hàm lƣợng Theobromin thu đƣợc không đáng kể, làm ảnh hƣởng đến
hiệu quả kinh tế, lãng phí năng lƣợng, tốn thời gian, nhân công,…Vì vậy, chọn số lần chiết là 1 lần là thích hợp.
Phƣơng pháp phân tích HPLC-UV phụ thuộc vào độ nhớt của dịch nên sau khi khử tạp độ nhớt giảm. Sau khi khử tạp, mẫu đem đi phân tích HPLC-UV hàm lƣợng Theobromin tăng là do tạp chất trong mẫu bị loại bỏ một lƣợng lớn, khi phân tích HPLC-UV thì đồ thị sắc ký đồ Theobromin rõ hơn, việc tính toán chính xác hơn. Qua kết quả đó cho ta một kết luận quan trọng là Chì axetat đƣợc sử đụng để khử tạp không ảnh hƣởng tới Theobromin, hàm lƣợng Theobromin không giảm đi sau khi khử tạp.
Từ kết quả thực nghiệm chọn thời gian chiết là 90 phút, 1 lần chiết, dùng chì axetat 10% để khử tạp.
3.5 Quy trình hoàn thiện thu nhận Theobromin thô từ vỏ quả ca cao
Sau khi tiến hành các thí nghiệm, hoàn thiện quy trình tách chiết Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
3.5.1 Sơ đồ quy trình: Hình 2.1 3.5.3 Thuyết minh quy trình 3.5.3 Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu, xử lý tạp chất, làm khô, làm nhỏ: Trái ca cao đƣợc thu mua từ tỉnh Đắc Lắc và vận chuyển về Nha Trang bằng xe khách, ca cao thuộc nhóm Forastero khi còn sống có màu xanh, lúc chín có màu vàng, ít hoặc không có rãnh, nguyên liệu đƣợc xử lý ngay sau khi về Nha Trang, vỏ cứng đƣợc tách ra khỏi vỏ thịt rồi đem đi phơi khô, xay nhỏ rồi bảo quản trong túi nilon tối màu ở nhiệt độ thƣờng.
Chiết, lọc: Dùng dụng cụ chiết có nắp đậy kín, cho nguyên liệu khô vào, sau đó cho dung môi cồn 70 (%V) với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 27/1, thời gian chiết 90 phút, nhiệt độ chiết là 800C, sau khi chiết đem dịch chiết đi lọc bằng giấy lọc hoặc bông.
Tiếp theo, cô quay để loại dung môi cồn trên thiết bị cất quay chân không ở áp suất chân không là 1000 mpa và nhiệt độ 450C.
38
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất Theobromin thô từ vỏ quả ca cao
Dung dịch sau khi cô đặc, sau đo đó đem sấy phun ở nhiệt độ 1450
C. Thu nhận Theobromin thô, đem đi bao gói bằng bao PA hút chân không.
3.5.3 Chi phí để sản xuất 20g Theobromin thô từ vỏ quả ca cao:
Kết quả phân tích HPLC-UV hàm lƣợng Theobromin trích ly bằng dung môi cồn 70 (%V) là 55,8 mg/kg. Nghĩa là trong 1kg vỏ ca cao khô có 55,8 mg Theobromin hay trong 1000 kg vỏ ca cao khô có 55,8 g Theobromin.
Bảng 2.3. Chi phí sản xuất 20g Theobromin thô từ vỏ quả ca cao Nguyên liệu Số lƣợng Giá 1 đơn vị Thành tiền (VNĐ)
Vỏ ca cao tƣơi 1300 g 500/ kg 260
Cồn 960 10 lít* 22.000 đ/ lít 222.000
Bông gòn 100g 16.000đ 16.000
Tổng cộng 238260
- Dung môi: Cồn 70 (%V) - Thời gian trích ly: 90 phút - Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1 - Nhiệt độ: 800C - Số lần trích ly: 1 lần Nhiệt độ sấy 1450C Vỏ quả ca cao
Xử lý sơ bộ nguyên liệu
Trích ly
Lọc bã Cô quay
Sấy phun
Theobromin thô Bao gói chân không
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN V ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1 Kết luận:
Quá trình nghiên cứu quy trình chiết xuất Theobromin thô từ vỏ quả ca cao đã đạt đƣợc những kết quả nhƣ sau:
Dung môi trích ly là cồn 70 (%V). Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1. Nhiệt độ trích ly: 800C.
Số lần trích ly: 1 lần.
Cô quay ở nhiệt độ 450C và áp suất chân không 1000 mpa. Sấy phun ở nhiệt độ 1450C.
Bao gói bằng bao PA hút chân không.
Hàm lƣợng Theobromin thu đƣợc theo quy trình trên là 55,8 mg/kg.