2.2.2.1 Quy trình nghiên cứu dự kiến: Hình 1.7 2.2.2.2 Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu vỏ ca cao:
Thu nhận vỏ quả ca cao sau khi tách lấy phần hạt, nếu không sử dụng ngay phải bảo quản vỏ ca cao trong điều kiện tốt nhất để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm sau này. Chất lƣợng nguyên liệu là yếu tố ảnh hƣởng lớn đến chất lƣợng sản phẩm sau này. Quả ca cao đƣợc chọn phải đạt đƣợc độ chín kỹ thuật, không bị úng thối, không bị sâu bệnh, không bị đen và nấm mốc.
Xử lý sơ bộ: phân loại, rửa, làm ráo, cắt nhỏ
Phân loại nhằm mục đích loại bỏ những quả kém phẩm chất, bị sâu bệnh, bị dập úng… không đạt chỉ tiêu chất lƣợng để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm sau này.
Rửa là công đoạn nhằm loại bỏ các tạp chất vô cơ (đất đá, cát bụi trong quá trình thu hái, vận chuyển). Ngoài ra, còn loại bỏ một phần lớn vi sinh vật trên bề mặt quả. Yêu cầu trong quá trình rửa là nguyên liệu sau khi rửa phải không dập nát, thời gian rửa ngắn, tốn ít nƣớc.
Làm ráo: nhắm mục đích tạo điều kiện thuân lợi cho quá trình cắt nhỏ dễ dàng hơn.
Cắt nhỏ: tạo điều kiện thuận cho quá trình sấy, quá trình sấy dễ dàng hơn thời gian sấy nhanh hơn Ngoài ra, cắt nhỏ còn tạo điều kiện cho quá trình nghiền dễ dàng hơn.
Trích ly: Trích ly bằng các dung môi đã chọn, tiến hành ở các điều kiện tối ƣu nhất để năng cao hiệu suất trích ly. Bố trí thí nghiệm lựa dung môi và thời gian trích ly cho thích hợp nhất.
Hình 1.7 Sơ đồ quy trình dự kiến chiết xuất Theobromin thô từ vỏ quả ca cao
Vỏ quả ca cao Xử lý sơ bộ Trích ly Lọc loại bã Cô quay Sấy phun Sản phẩm - Xác định dung môi trích ly - Xác định thời gian trích ly. - Xác định số lần trích ly - Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1
- Nhệt độ: Nhiệt độ sôi của dung môi.
24
Lọc bã:
Sau khi trích ly xong ta tiến hành lọc bã, loại bỏ phần bã vỏ quả ca cao và các tạp chất tạp chất khác tạo điều kiện thuận lợi cho các công đoạn tiếp theo. Ta tiến hành lọc qua bông gòn, tráng rửa bã, phễu lọc và bông gòn, sau đó tập trung dịch lọc.
Cô quay chân không:
Nhằm mục đích thu hồi dung môi cho lần trích ly sau, tăng nồng độ chất tan trong dung dịch, tạo điều kiên thuận lợi quá trình sấy phun sau này. Quá trình cô quay thực hiện bằng thiết bị cô quay chân không ở áp suất chân không 1000mpa, tốc độ quay của bình chứa mẫu là 40 vòng/phút, nhiệt độ cô quay là 45oC.
Sấy phun:
Sau quá trình cô quay chân không ta tiến hành sấy phun để thu sản phẩm. Đặc biệt sản phẩm sau khi sấy phun thì ở dạng bột không cần phải nghiền mẫu, thời gian sấy nhanh, đảm bảo đƣợc chất lƣợng sản phẩm. Mẫu đƣợc sấy phun ở nhiệt độ 1450
C. Sản phẩm sau khi đƣợc sấy phun đƣợc bao gói hút chân không, bảo quản lạnh.
2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm:
a.Bố trí thí nghiệm xác định thành phần khối lƣợng và thành phần hóa học của vỏ quả ca cao:
Mục đích: Xác định thành phần khối lƣợng của vỏ quả ca cao và thành phần hóa học có trong đó.
Cách tiến hành:
Lấy 3 quả ca cao đem đi cân rồi bổ đôi để xác định khối lƣợng các thành phần gồm vỏ quả, vỏ cứng, hạt.
Sau đó, lấy vỏ quả ca cao đem đi phân tích các chỉ tiêu hóa học gồm hàm lƣợng ẩm, tro, protein, lipid, Theobromin. Hàm lƣợng cacbohydrat đƣợc tính gần đúng theo công thức sau:
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.8
Hình 1.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần khối lƣợng và thành phần hóa học của vỏ quả ca cao
b.Bố trí thí nghiện lựa chọn dung môi trích ly: [5], [6], [10], [19], [21], [24], [32]
Các loại dung môi khác nhau sẽ phù hợp với việc trích ly các thành phần khác nhau vì chúng khác nhau về độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt.
Dựa vào tính chất vật lý của Theobromin mà ta lựa chọn dung môi trích ly sao cho phù hợp nhất, đạt hiệu suất trích ly cao nhất. Do đó, thí nghiệm nhằm xác định dung môi phù hợp để cho hiệu suất trích ly cao nhất.
Cách tiến hành: chuẩn bị 3 mẫu thí nghiệm trích ly tƣơng ứng với 3 dung môi là: nƣớc, cồn 70 (%V), cloroform (lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần)
Trích ly ở cùng điều kiện:
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1.
Thời gian trích ly: 30 phút, cho vào bể ổn nhiệt. Cân Quả ca cao Tách hạt Lipit Phần hạt Phần vỏ Xác định thành phần khối lƣợng vỏ quả và hạt Phân tích thành phần hóa học Protein Độ ẩm Theobromin Tro
26
Nhiệt độ sôi của mỗi dung môi: nƣớc ở 1000C, cồn 70 (%V) ở 79,80C, cloroform ở 61,20C.
Khối lƣợng mẫu ca cao: 10g.
Số lần trích ly: 1 lần
Mẫu 1: cân 10g mẫu vỏ ca cao khô trích ly bằng 270ml cloroform + 10 ml NH3 10% + 12g NaSO4 khan -> lọc -> cô quay đuổi dung môi (hoàn toàn) -> hòa tan lại trong nƣớc -> định mức 50 ml lấy 15ml cho vào ống nhựa (M1).
Mẫu 2: cân 10g mẫu vỏ ca cao khô trích ly bằng 270ml nƣớc cất + 10ml axit axetic 5% sau khi trích ly lọc -> định mức 50 ml -> lấy 15 ml cho vào ống nhựa có nắp đậy (M2).
Mẫu 3: cân 10g mẫu vỏ ca cao khô trích ly bằng 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5% lọc định mức 50 ml ->lấy 15ml cho vào ống nhựa có nắp đậy (M3).
Gửi 3 mẫu trên đi phân tích HPLC-UV để đánh giá lựa chọn dung môi cho kết quả trích ly hàm lƣợng Theobromin cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.9
Vỏ quả ca cao
Trích ly
Chọn dung môi cho hàm lƣợng Theobromine cao nhất Phân tích HPLC-UV Cloroform Cồn 70 (%V) Nƣớc Lọc bã
Hình 1.9 Sơ đồ bố trí thí nghiện lựa chọn dung môi trích ly Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
c. Bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi phù hợp nhất, ta tiến hành bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly. Thời gian trích ly ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu suất trích ly và chất lƣợng của sản phẩm. Nếu thời gian trích ly ngắn thì không chiết đƣợc hết các chất trong nguyên liệu, nhƣng nếu thời gian trích ly quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho các công đoạn sau. Vì vậy cần phải bố trí nghiệm xác định thời gian phù hợp nhất.
Bố trí thí nghiệm: chuẩn bị 3 mẫu tƣơng ứng với thời gian trích ly là: 30 phút, 60 phút, 90 phút (lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần).
Trích ly trong cùng điều kiện:
Khối lƣợng mẫu ca cao: 10g
Dung môi: Cồn 70 (%V).
Nhiệt độ sôi: 800 C
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1.
Số lần trích ly: 1 lần.
Cân 10g mẫu vỏ ca cao, bổ sung 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%, cho vào bình tam giác 500ml có nắp đậy. Trích ly mẫu ở bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800C trong thời gian 60 phút (3 mẫu), 90 phút (3 mẫu). Sau đó lọc bã, đem cô quay loại dung môi cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml. Gửi mẫu phân tích hàm lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC- UV. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn thời gian cho kết quả Theobromin cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.10 d. Bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly:
Sau khi lựa chọn thời gian trích ly phù hợp ta tiến hành lựa chọn số lần trích ly nhằm mục đích tách chiết một cách triệt để Theobromine có trong nguyên liệu.
Bố trí thí nghiệm: chuẩn bị 2 mẫu tƣơng ứng với số lần trích ly là 1 lần, 2 lần, (lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần).
28
Hình 1.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
Trích ly trong cùng điều kiện:
Khối lƣợng mẫu ca cao: 10g
Dung môi: Cồn 70 (%V).
Nhiệt độ sôi: 800 C
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 27/1.
Thời gian trích ly: 90 phút.
Mẫu 1: Cân 10g mẫu vỏ ca cao, trích ly bằng 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%. Cho vào bình tam giác 500 ml.
Cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800C, thời gian trích ly là 90 phút sau đó lọc lấy dịch. Đem cô quay loại dung môi cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml, cho vào ống nhựa đánh số (trích ly 1 lần).
Trích ly Vỏ quả ca cao
30 phút
Chọn thời gian cho hàm lƣợng Theobromine cao nhất 90 phút Lọc bã Phân tích HPLC-UV 60 phút
Mẫu 2: Cân 10g mẫu vỏ ca cao, trích ly bằng 270ml cồn 70 (%V) + 10ml axit axetic 5%. Cho vào bình tam giác 500ml. Cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800
C, thời gian trích ly là 90 phút rồi lọc lấy dịch (trích ly lần 1). Bã còn lại đem đi cho vào bình tam giác 500ml, bổ sung 10ml axit axetic 5%, cộng thêm 270ml cồn 70 (%V). Tiến hành tƣợng tự nhƣ lần đầu, cho vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 800
C. Thời gian 90 phút rồi lọc lấy dịch (trích ly lần 2). Sau đó cộng dịch lọc của 2 lần trích ly đem cô quay loại cồn 70 (%V), mỗi mẫu đạt thể tích 30ml, cho vào ống nhựa đánh số (trích ly 2 lần).
Gửi mẫu phân tích HPLC- UV. Sau khi có kết quả đánh giá, lựa chọn số lần trích ly cho kết quả hàm lƣợng Theobromin cao nhất.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 1.11
Hình 1.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly 2.2.2.4 Phƣơng pháp phân tích HPLC-UV [7].
Thực hiện phân tích: cân 1 gram mẫu vào ống ly tâm 50 mL, thêm tiếp vào mẫu 20 mL nƣớc cất. Vortex 2 phút, đánh siêu âm trong vòng 15 phút. Ly tâm lấy phần
Trích ly Vỏ quả ca cao 2 lần Chọn số lần trích ly cho hàm lƣợng Theobromine cao nhất 1 lần Lọc Phân tích HPLC-UV
30
trong cho vào bình định mức 100 mL (lặp lại thêm 02 lần). Dung dịch thu đƣợc định mức 100 mL bằng nƣớc cất (có thể pha loãng mẫu nếu cần) qua màng lọc 13 mm, 0,45 m, thu dịch lọc -> Tiến hành phân tích trên máy HPLC/UV.
Điều kiện: - Bƣớc sóng: 272 nm. - Pha động: ACN: dd H3PO4 0.05% / 15:85. - Tốc độ dòng: 0,5mL/phút. - Cột: C18 (250 x 4,6 mm, 5μm) – Hiệu Merck. Tính kết quả: mau dm m f P V C C 0 Trong đó:
- C: hàm lƣợng chất phân tích có trong mẫu, tính theo mg/kg.
- C0: hàm lƣợng chất phân tích trong dịch chiết thông qua đƣờng chuẩn, mg/L.
- mmẫu: lƣợng cân của mẫu thử, g. - P: độ tinh khiết của chất chuẩn. - Vdm: thể tích định mức mẫu, mL. - f: hệ số pha loãng (nếu có)
2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu:
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phƣơng pháp thống kê, mỗi thí nghiệm lặp 3 lần. Kết quả là trung bình cộng của các thí nghiệm lặp, xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và SPSS phiên bản 16 và vẽ đồ thị, biểu diễn kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU V THẢO LUẬN
3.1Kết quả xác định thành phần khối lƣợng và thành phần hóa học của quả ca cao: a. Thành phần khối lƣợng:
Bảng 2.1 Thành phần khối lƣợng của quả ca cao tƣơi.
Trong đó:
mquả : khối lƣợng quả ca cao
m vỏ quả ca cao: khối lƣợng vỏ quả ca cao
m hạt : khối lƣợng của hạt ca cao
Nhận xét: Qua bảng thành phần khối lƣợng của quả ca cao ta thấy, tỷ lệ của vỏ quả ca cao là rất lớn chiếm 75,65%. Trong khi, tỉ lệ hạt ca cao đƣợc sử dụng chỉ là 24,35%. Vì thế, việc tận dụng phế liệu vỏ quả ca cao để sản xuất Theobromin rất có hiệu quả, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.
b.Thành phần hóa học của vỏ quả ca cao
Bảng 2.2 : Thành phần hóa học của vỏ quả ca cao Chỉ tiêu (% tổng hàm lƣợng chất khô)
Độ ẩm Theobromin (mg/kg vỏ ca cao khô) Lipid Protein Tro Cacbohydrat
0,93 2,42 11,44 85,21 87,06 63,52
Nhận xét: Qua bảng thành phần hóa học của vỏ quả ca cao ta thấy, độ ẩm của vỏ quả ca cao rất lớn chiếm tới 87,06%, hàm lƣợng chất khô chỉ chiếm 12,94%. Trong đó, hàm lƣợng lipid và protein rất thấp chỉ chiếm 0,93 và 2,42% tổng hàm lƣợng
Mẫu mquả (kg) m vỏ quả ca cao (kg) m hạt (kg) % Vỏ quả % Hạt 1 1,86 1,31 0,55 70,43 29,57 2 1,84 1,44 0,4 78,26 21,74 3 1,84 1,44 0,4 78,26 21,74 Trung bình 75,65 24,35
32
chất khô tƣơng ứng. Hàm lƣợng tro cũng khá thấp chiếm 11,44% tổng hàm lƣợng chất khô. Cacbohydrat chiếm tỷ lệ cao tới 85,21% tổng hàm lƣợng chất khô nên sẽ ảnh hƣởng nhiều đến quá trình chiết sau này. Đặc biệt, hàm lƣợng Theobromin thấp chỉ chiếm 63,52 mg/kg vỏ khô. Vì vậy, trong nghiên cứu tiếp theo phải tìm phƣơng pháp hợp lý cho quá trình tách chiết Theobromin từ vỏ quả ca cao để đạt hiệu quả cao nhất.
3.2 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn và giản đồ sắc ký:
Nhận xét:
Qua hai giản đồ phân tích HPLC-UV của mẫu chuẩn (đồ thị 2.2) và mẫu phân tích (đồ thị 2.3) ta thấy Theobromin đƣợc phát hiện ở khoảng thời gian từ 6 - 6,2 phút, ở bƣớc sóng 272nm.
Từ sắc kí đồ Theobromin của mẫu phân tích và phƣơng trình đƣờng chuẩn của Theobromin ta tính đƣợc hàm lƣợng Theobromin trong mẫu vỏ quả ca cao phân tích là 0,02mg/L.
Phần nền sắc ký đồ Theobromin của mẫu phân tích (đồ thị 2.3) có bƣớc sóng rất cao, chứng tỏ trong mẫu phân tích có nhiều tạp chất, ảnh hƣởng đến nền sắc ký của Theobromin trong mẫu vỏ ca cao khô.
Nồng độ Theobromin (mg/L) uV
Đồ thị 2.2 Sắc ký đồ Thebromine mẫu chuẩn
Đồ thị 2.3Sắc ký đồ Thebromine của mẫu phân tích
3.3 Kết quả xác định dung môi chiết Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
Kết quả thí nghiệm xác định dung môi chiết đƣợc thể hiện trên đồ thị 2.1 nhƣ sau:
Hàm lƣợng Theobromin thô thu đƣợc:
Mẫu trích ly bằng cloroform có kết quả 0,92 mg/kg. Mẫu trích ly bằng nƣớc thu đƣợc 3,45 mg/kg.
34
Mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V) thu đƣợc 22,25 mg/kg.
Từ kết quả phân tích ở trên ta thấy, mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V) cho hàm lƣợng Theobromin cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với mẫu trích ly bằng cloroform và nƣớc.
Đồ thị 2.4 Kết quả lựa chọn dung môi Chú thích:
1: Mẫu vỏ ca cao khô.
2: Mẫu trích ly bằng cloroform. 3: Mẫu trích ly bằng nƣớc cất 4: Mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V)
Kí hiệu a, b, c, d chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
Nhận xét:
Từ kết quả thực nghiệm thu đƣợc thể hiện ở đồ thị 2.4 cho thấy mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V) cho kết quả cao nhất và khác biệt so với mẫu trích ly bằng chloroform và nƣớc cất, gấp 24,2 lần so với cloroform, gấp 6,4 lần so với nƣớc cất. Tuy nhiên, kết quả hàm lƣợng Theobromin của mẫu trích ly bằng cồn 70 (%V) ở thời gian là 30 phút
thấp hơn nhiều so với hàm lƣợng Theobromin từ mẫu vỏ ca cao khô (Mẫu 1). Điều đó chứng minh rằng, thời gian trích ly 30 phút chƣa đủ để tách chiết hết Theobromin trong mẫu ca cao. Vì vậy cần bố trí thời gian trích ly mẫu ca cao hợp lý để hiệu suất trích ly là cao nhất.
Giải thích:
Trong cấu trúc phân tử của Theobromin có nhiều nhóm phân cực (–CO, -N=) hơn so với nhóm không phân cực (-CH3). Các nhóm phân cực này quyết định khả năng hòa tan của Theobromin trong các dung môi phân cực hơn là các dung môi không phân cực hoặc phân cực yếu. Vì vậy, Theobromin tan nhiều trong dung môi phân cực nhƣ là: cồn, nƣớc. Trong ba mẫu trích ly từ ba dung môi nhƣ: cồn 70 (%V), nƣớc, clorofoc. Mẫu ca cao trích ly bằng dung môi cồn 70 (%V) cho hàm lƣợng Theobromin cao nhất, khác biệt với các dung môi còn lại.
Từ kết quả này chọn cồn 70 (%V) làm dung môi.