nghiên cứu quy trình thu nhận chondroitin sulfate từ nguyên liệu thủy sản bằng phương pháp sinh học

Nghiên cứu ứng dụng enzym thay thế các chất hóa học trong quá trình thu nhận CS từ sụn động vật đặc biệt các nguồn sụn nguyên liệu thuỷ sản là rất cần thiết để giảm độ độc hại trong khi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳ hình thức nào khác

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho: TS Võ Hoài Bắc - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam: Số 2- Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội và TS Nguyễn Minh Trí - Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn

Xin cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giúp

đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua Xin cảm ơn các thầy cô phản biện

đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sụn động vật 3

1.2 Chondroitin sulfate 4

1.2.1 Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate 4

1.2.2 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate 7

1.2.2.1 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô 8

1.2.2.2 Các phương pháp tinh chế Chondroitin sulfate 8

1.2.2.2 Các nghiên cứu chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate 9

1.2.3 Ứng dụng của Chondroitin sulfate 10

1.2.3.1 Ứng dụng trong y học 10

1.2.3.2 Các ứng dụng khác 12

1.3 Protease 12

1.4 Giới thiệu về cá đuối và cá nhám 14

1.4.1 Cá đuối 14

1.4.2 Cá nhám 16

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Vật liệu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Xác định sự có mặt của Chondroitin sulfate trong sản phẩm theo phương pháp tách chiết và tinh chế: 19

2.2.2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 20

2.2.3 Định lượng Chondroitin sulfate bằng so màu với Dimethylmethylene blue theo Farndale và cộng sự 21

2.2.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 22

2.2.5 Phương pháp sinh học tách chiết Chondroitin sulfate 23

2.2.6 Xác định một số tính chất và chất lượng của chế phẩm Chondroitin sulfate 23

2.2.6.1 Xác định độ bền nhiệt của chế phẩm Chondroitin sulfate 23

2.2.6.2 Xác định độ bền acid của chế phẩm Chondroitin sulfate 23

2.2.6.3 Phương pháp xác định hàm ẩm 24

2.2.6.4 Xác định vết kim loại nặng: gửi mẫu kiểm tại Viện Hóa Học 24

2.2.7 Bố trí thí nghiệm 24

2.2.7.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu nhận và tinh sạch Chondroitin sulfate 24

2.2.7.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn điều kiện tối thích cho hoạt động của protease ngoại bào B26 26

2.2.7.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm ETM 29

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 31

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Xác định hàm lượng Chondroitin sulfate trong sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) ở Việt Nam 32

3.2 Lựa chọn nguồn enzyme thích hợp 33

3.2.1 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease từ chủng B26 để thủy phân sụn cá 34

3.2.1.1 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease từ chủng B26 34

3.2.2 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease ETM để thủy phân sụn cá và chiết rút Chondroitin sulfate 36

3.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 36

3.2.2.2 Ảnh hưởng của pH 37

3.2.2.3 Xác định thời gian và nồng độ chế phẩm ETM thủy phân tối ưu sụn cá 38

3.2.3 So sánh khả năng thủy phân sụn cá của papain, bromelain, ETM và protease ngoại bào từ chủng B26 40

3.3 Nghiên cứu quy trình tinh sạch 41

3.3.1 Hiệu suất thu hồi CS bằng ethanol 41

3.3.2 Khả năng chiết rút Chondroitin sulfate từ sụn cá bằng phương pháp hóa học và bằng phương pháp sinh học 43

3.3.3 Thu nhận Glycosaminoglycan (GAGs) 43

3.3.4 Phân tách Chondroitin sulfate trong phức hợp tủa CS-CPC 44

3.3.5 Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm Chondroitin sulfate 45

3.3.6 Quy trình tinh sạch Chondroitin sulfate từ sụn cá đuối, cá nhám bằng phương pháp sinh học 47

3.4 Xác định một số tính chất của Chondroitin sulfate tinh sạch 48

3.4.1 Độ bền với nhiệt và acid của chế phẩm Chondroitin sulfate tinh sạch 48

3.4.2 Một số chỉ tiêu phân tích chế phẩm Chondroitin sulfate tinh sạch 49

3.4.3 Dự toán giá thành sản xuất Chondroitin sulfate từ sụn cá đuối, cá nhám bằng phương pháp sinh học 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần chính của mô sụn 3

Bảng 1.2 Phân loại chondroitin sulfate 7

Bảng 1.3 Hàm lượng CS được tách từ các nguồn sụn khác nhau 10

Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn của tyrosine 21

Bảng 2.2 Xác định đường cong chuẩn CS4 22

Bảng 2.3 Xác định đường cong chuẩn protein 23

Bảng 3.1 Hàm lượng CS trong các mẫu sụn cá đuối và cá nhám Việt Nam 33

Bảng 3.2 Hiệu quả thuỷ phân sụn cá trong 48 giờ của các protease 40

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi CS 42

Bảng 3.4 Hàm lượng CS trong chế phẩm tinh sạch sơ bộ 42

Bảng 3.5 So sánh khả năng chiết rút CS từ sụn cá bằng phương pháp hóa học và bằng phương pháp sinh học 43

Bảng 3.6 Hiệu suất tủa GAGs 44

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi CS bằng tủa ethanol 45

Bảng 3.8 Hiệu suất thu CS tinh sạch 45

Bảng 3.9 Hàm lượng một số kim loại nặng trong chế phẩm CS 49

Bảng 3.10 Một số chỉ tiêu phân tích chế phẩm CS 49

Bảng 3.11 Sơ lược tính giá thành cho 100g CS tinh sạch (hàm lượng CS ~ 90%) từ sụn cá nhám, cá đuối 50

Bảng 3.12 Sơ lược tính giá thành cho 100g CS thô (hàm lượng CS 51,8%) sụn cá nhám, cá đuối 51

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS 5

Hình 1.2 Cấu trúc mạch của các CS 5

Hình 3.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease của chủng B26 34

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease của chủng B26 .35

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thuỷ phân sụn cá của protease từ chủng B26 35

Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ protease của chủng B26 lên quá trình thủy phân sụn cá 36

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ thủy phân của ETM và hàm lượng CS giải phóng 37

Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ thủy phân của ETM và hàm 38

lượng CS giải phóng 38

Hình 3.7 Hiệu quả thủy phân của ETM theo thời gian .38

Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ enzym ETM lên hoạt độ thuỷ phân sụn cá 39

Hình 3.9 Khả năng thủy phân sụn cá nhám, cá đuối của enzym ETM 40

Hình 3.10 Độ bền với nhiệt của chế phẩm CS 48

Hình 3.11 Độ bền với pH acid của chế phẩm CS 48

KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A660 Đo OD ở bước sóng 660 nm

A750 Đo OD ở bước sóng 750 nm

MỞ ĐẦU

Hiện nay, nước ta có khoảng 300 cơ sở chế biến thủy sản và 200 nhà máy chuyên sản xuất các sản phẩm đông lạnh phục vụ xuất khẩu Theo báo cáo “Đánh giá tác động môi trường trong lĩnh vực thủy sản năm 2002” thì tổng lượng chất thải rắn như: đầu, xương, da, vây, vẩy… từ các nhà máy chế biến thủy sản được ước tính khoảng hàng trăm tấn/năm [63]. Nhiều dược liệu quý đã được chiết xuất từ phế thải của các nhà máy chế biến thuỷ sản như glucosamine được chiết xuất từ vỏ tôm [35; 39], chondroitin từ sụn cá mập [44]. Điều đáng chú ý là trong sụn cá thường có hàm lượng chondroitin sulfate cao hơn các đối tượng nghiên cứu khác Vì vậy, việc điều tra và nghiên cứu nguồn dược liệu từ phế thải sau chế biến thủy sản là rất cần thiết, không những giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tận dụng được nguồn dược liệu, giảm giá thành nhập khẩu thuốc

Chondroitin sulfate (CS) là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp, CS còn có mặt trong các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo sự vận động linh hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép CS có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp CS làm tăng sản xuất chất nhầy và khả năng bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo chức năng dinh dưỡng và sự vận động linh hoạt của khớp Vì vậy, CS giúp giảm và ngăn chặn quá trình thoái hoá khớp [15] CS còn có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng ức chế các enzym phá huỷ sụn khớp như collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase [12] Ngoài ra CS cũng góp phần nuôi

dưỡng các tế bào của giác mạc mắt, tái tạo lớp giác mạc Một trong những tác dụng quan trọng khác của CS là khả năng ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch trong các khối u, làm cho khối u hạn chế phát triển CS có khả năng kháng viêm, ức chế sự tiết các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, nitric oxid và các gốc oxy hóa tự do [24] Hiện nay các thuốc kết hợp CS và glucosamine đang

được sử dụng hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp

Do phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên CS chưa được tổng hợp bằng

con đường hóa học mới chỉ được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên Những

năm trước đây CS được tinh chế chủ yếu từ sụn cá mập, do đó giá thành rất cao Một

số nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên liệu như từ da

của cá Labeo rohita [51], sụn của mực [61], cá mập [44], sụn gà [34], sụn bò [41]

Việc nghiên cứu để tách chiết CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau vẫn được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm đặc biệt nhằm hạ giá thành sản phẩm

Nghiên cứu ứng dụng enzym thay thế các chất hóa học trong quá trình thu nhận

CS từ sụn động vật (đặc biệt các nguồn sụn nguyên liệu thuỷ sản) là rất cần thiết để giảm độ độc hại trong khi sản xuất cũng như tăng chất lượng của chế phẩm CS

Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn rất mới mẻ, chưa có một công

trình nào đề cập đến vấn đề này Do vậy, đề tài: "Nghiên cứu quy trình thu nhận

chondroitin sulfate từ nguyên liệu thủy sản bằng phương pháp sinh học” có ý

nghĩa thực tiễn cao và nhiều triển vọng để ứng dụng vào thực tế sản xuất dược phẩm nước nhà trong giai đoạn tới

Đề tài cần thực hiện nhiệm vụ chính sau:

- Xây dựng được quy trình tách chiết và tinh sạch chondroitin sulfate từ sụn

cá đuối (Dasyatis kuhlii) và sụn cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng công nghệ enzym

- Nghiên cứu một số tính chất của chế phẩm CS tinh sạch

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống việc tìm chọn các thông số cho quy trình tách chiết chondroitin sulfate từ sụn cá nhám và cá đuối, vì vậy là nguồn bổ sung các tư liệu có tính khoa học về các tính chất dược lý của CS Các kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong phú cho các nhà nghiên cứu các sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế thải thuỷ sản

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm sử dụng các chất có tính dược học vào đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử

dụng của sụn cá

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sụn động vật

Sụn động vật là loại mô liên kết đặc tồn tại trong cơ thể động vật có xương sống, cũng như ở động vật không xương sống (sam, sên biển và động vật chân đầu (cephalopod) ) [63]

Trong cơ thể người và các loài động vật có xương sống khác, sụn có ở nhiều bộ phận như các khớp, xương sườn, tai, mũi, ống hô hấp, đĩa đệm cột sống… Sụn là phần chính trong bộ xương của bào thai, nhưng nó sẽ biến đổi thành xương khi cơ thể trưởng thành Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành Sụn khác biệt ở chỗ chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần kinh (aneurol) và không chứa hệ bạch huyết (alymphatic) [63]

Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm Thành phần hoá học của cả hai loại sụn nêu trên đều bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các chất điện phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes) Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn [63]

Bảng 1.1 Thành phần chính của mô sụn

Sụn khớp 68,0 – 85,0 10,0 - 20,0 ( loại I) 5,0-10,0 Sụn chêm 60,0 – 70,0 15,0 - 25,0 ( loại II) 1,0- 2,0 Thành phần chính của hai loại sụn được thể hiện trong bảng 1.1 Ba thành phần chính này tác động đồng bộ, tạo nên đặc tính cơ học của sụn Sự thay đổi của các thành phần này (do bị bệnh lão hoá ) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ học phụ thuộc vào thời gian của sụn Có tới 30% nước nằm trong khoảng không giữa các sợi collagen Kích thước sợi collagen và hàm lượng nước được xác định nhờ áp suất trương sinh ra

do mật độ điện tích của các đại phân tử proteoglycan mang điện tích âm phân bố trong khối collagen Sự gắn kết của proteoglycan ảnh hưởng đến trương lực và sự chuyển động của pha lỏng khi bị nén ép Chondroitin là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong sụn [63].

1.2 Chondroitin sulfate

1.2.1 Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate

CS được phát hiện và lần đầu tiên được tách chiết từ những năm 60 do

Davidson và Meyer CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide gọi là

glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polime

mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 đường (disaccharide) N-acetyl-D-

galactosamine (GalNAc) và glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau (polymeric

D-galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này được sulfate hoá hay

không bị sulfate hoá [23], một số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA) CS là một polime có phân tử lớn gồm 15-150 đơn vị cấu trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc Khối lượng phân tử của CS thường biến động trong khoảng

10.000 - 100.000 Dalton [29]

Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thường gắn với các

protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG) (glucoprotein),

là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide [14]

Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42-) của gốc đường với các nhóm carboxyl

(-COO-) của gốc đường acid làm cho phân tử chondroitin có mật độ điện tích âm

rất cao (anionic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong

cấu tạo của PG Chuỗi CS được gắn với nhóm -OH của gốc serine ở một số protein

Các protein gắn chọn lọc chính xác như thế nào với GAG vẫn chưa được làm sáng

tỏ GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi Sự gắn kết của chuỗi GAG bắt đầu với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-

Gal-Gal-GlcA; xylose được gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân

tử đường khác được gắn trong hệ Golgi [56]

CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao Các điều kiện thủy

phân cũng có thể làm giảm trọng lượng phân tử trung bình của sản phẩm thu được

Mỗi phân tử đường có thể không bị sulfate hoá, bị sulfate hoá 1 lần hay 2 lần Đa

phần nhóm OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulfate hoá, đối với một số

chuỗi GAG khác thì ở vị trí 2 của GlcA Quá trình sulfate hoá là nhờ các enzym

sulfotransferase đặc hiệu Việc sulfate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính

sinh học đặc thù của CS

Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzym và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào [36; 53; 59] GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào Phân tử (monomer) PG của mô sụn (chứa khoảng 80-100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [23]

Công thức hoá học của chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n :

sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulfate, CS6) Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế acid glucuronic Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối (rays, skates) ) Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng chứa ở mức độ nhiều hay ít một số lượng các isome của CS, có tới 16n isome của CS, phụ thuộc vào sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/ mỗi cặp [49] Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG [56].

+ Chondroitin Sulfate A (GlcA-GalNAc-4S)-CS4

+ Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S) -CS4

Tên cũ là dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thường

có nhiều ở da, còn thấy có ở van tim, gân, thành mạch Vị trí bị sulfate hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid

+ Chondroitin Sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S ) - CS6

CS được tách chiết trước khi cấu trúc của nó được xác định Vì vậy tên gọi của CS cũng có sự thay đổi Ngoài ra còn có chondroitin sulfate D và E Phân loại

các CS được tóm tắt trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Phân loại chondroitin sulfate

Chondroitin sulfate A

Carbon 4 của đường - acety-D-galactosamine (GalNAc)

Chondroitin sulfate C Carbon 6 của GalNAc Chondroitin-6-sulfate (CS6)

Chondroitin sulfate D Carbon 2 của glucuronic

acid and 6 của GalNAc Chondroitin-2,6-sulfate (C2,S6)

Chondroitin sulfate E Carbons 4 và 6 của

GalNAc Chondroitin-4,6-sulfate (C4,S6)

CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nước vì thế rất dễ hút ẩm; nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, cetone Khối lượng phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn, khoảng 15000 - 20000 Dalton

1.2.2 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate

Cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp nên chưa thu nhận CS được bằng con đường tổng hợp hoá học, cho đến nay mới chỉ tổng hợp được các mạch

oligosaccharide ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một số CS tetrasaccharide (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá của neron thần kinh [50], còn phân tử disaccharide thì không có tác dụng trên

Vì thế, hiện nay nguyên liệu CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ các

nguồn tự nhiên nhờ chiết xuất CS từ các loại mô động vật Sụn cá mập (xương sọ,

xương sống, vây ) là nguồn nguyên liệu CS phổ biến nhất trong các chế phẩm thuốc

và chế phẩm bổ sung dinh dưỡng

CS trong mô động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức proteoglycan Cho nên việc đầu tiên là phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc làm yếu mối liên kết giữa CS-protein và phân huỷ protein để giải phóng các phân tử CS

1.2.2.1 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô

Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn có thể được thực hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzym) để thuỷ phân sụn

Trong phương pháp hoá học mô sụn được xử lý bằng nước nóng, dung dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH ) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…) Phương pháp này đã áp dụng để thu CS từ sụn gà

[34], sụn bò [41] tuy nhiên, đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của CS khi thu nhận CS

Phương pháp sinh học dùng enzym để thuỷ phân mô sụn là phương pháp có

hiệu quả để thu nhận CS không bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh học

của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các hoá chất (muối, kiềm, acid ) gây nên Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các protease (papain, actinase, pronase…) để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi các protein liên kết Sau khi loại

bỏ protein thì CS được tách ra và tinh sạch Phương pháp này đã được dùng để thu

nhận GAG từ da cá Labeo rohita [51], sụn của mực [61], cá mập [44], cá sấu, cá đuối

Các chuỗi dài hydrophilic polymers GAG không tan trong ethanol, cetone và methanol, vì vậy có thể sử dụng các dung môi này để thu CS thô Một số nghiên cứu cho thấy ethanol 60-70% tủa được hàm lượng CS cao nhất và tách CS với một

số polysaccharide khác [55]

1.2.2.2 Các phương pháp tinh chế Chondroitin sulfate

Chế phẩm CS thô thu được còn chứa một lượng tạp chất nào đó như collagen, cặn protein, hyaluronic acid, muối khoáng Cho nên cần phải tiến hành các bước tinh sạch tiếp theo để loại các tạp chất trên

Để thu CS có thể sử dụng các muối của ammonium như cetylpyridium chloride (CPC) hoặc cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) để tạo phức tủa với

các GAG và các polysacharid khác, các collagen phần lớn sẽ bị loại bỏ trong giai đoạn này [28] Các GAG gốc sulfate thấp trong phức hợp tủa CPC-GAG và CTAB-GAG đó sẽ bị hòa tan trong một số muối NaCl hoặc KCl nồng độ thấp (0,3-0,4M) Sau khi loại bỏ các GAG gốc sulfate thấp như hyaluronic acid, chỉ còn lại tủa CPC-GAG và CTAB-GAG chứa các GAG gốc sulfate cao, chủ yếu là CS

CS trong phức tủa CPC-GAG và CTAB-GAG sẽ được hòa tan phần lớn trong các muối nồng độ cao (0,9-2,0M KCl; 2,0M NaCl; 1N MgCl2 và 0,7N-1,5M MgSO4 ) và tiếp tục đượctinh chế bằng thẩm tích và kết tủa bằng dung môi để thu

CS tinh khiết Scott đã mô tả cụ thể về phương pháp này và đây cũng là phương pháp hiệu quả để tách và tinh sạch các loại polysaccharide và nucleic acid [52; 21]

Vì CS là một polyanion có điện tích âm (-) rất cao, nên CS rất dễ liên kết và bám dính trên các cột sắc ký Vì vậy, còn có thể tinh sạch CS bằng sàng lọc phân tử nhờ các cột sắc ký trao đổi ion (DEAE-Sephacel, DOWEX 50 ) hoặc bằng sắc ký lọc gel (Sepharose CL-6B, Sephacryl S-300 ) [44]

1.2.2.2 Các nghiên cứu chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên liệu

như từ da của cá Labeo rohita [51], sụn của cá mực [61], cá mập [44], sụn gà [34],

sụn bò [41] Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành Đây là nguồn nguyên liệu dễ kiếm và có chứa thành phần CS Cho đến nay, tại Việt Nam chưa có công trình nào nghiên cứu tách chiết CS từ sụn cá đuối và cá nhám

Vì phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharid ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS: tổng hợp được một

số CS tetrasaccharid [28], có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá của neron trong khi đó disaccharid không có tác dụng trên Vì vậy, các CS chủ yếu được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên

Xác định hàm lượng CS theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu DMMB (1,9-dimethylmethylene blue) khi nó gắn với CS Hoà tan bột CS khô vào nước đã loại ion để nhận dung dịch 8-12% (w/v) và xác định hàm lượng CS của dung dịch theo Farndale và cộng sự dùng CS4 và CS6 tinh khiết làm chất chuẩn, và

đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 525nm trên máy quang phổ [19]

Hàm lượng CS được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu sụn khác nhau qua các phương pháp đã mô tả được tóm tắt trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Hàm lượng CS được tách từ các nguồn sụn khác nhau [21]

Cá sấu:

Sụn lưỡi 14,84 ± 0,38 13,54 ± 0,35 CS6,CS4 Xương sườn 5,56 ± 0,96 5,08 ± 0,87 CS6,CS4 Xương ức 11,55 ± 0,88 10,54 ± 0,80 CS6,CS4

1.2.3 Ứng dụng của Chondroitin sulfate

CS đã được sử dụng rộng rãi trong các loại chế phẩm bổ sung dinh dưỡng

(dietary supplements) khác nhau trong thời gian dài và đang ngày càng được mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau Thị trường chế phẩm bổ sung CS và glucosamine rất lớn Trong một năm (1998-1999) doanh thu bán lẻ ở Mỹ đạt tới

500 triệu USD [11] CS có nhiều tác dụng trong điều trị bệnh lý cũng như trong các lĩnh vực khác

1.2.3.1 Ứng dụng trong y học

+ Bệnh khớp (osteoarthritis):

Nhiều nghiên cứu trên thế giới [15] cho thấy CS đã được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là bệnh viêm khớp theo các cơ chế :

- Giảm đau, kháng viêm, giảm sưng khớp do làm giảm tạo ra tân dịch

- CS còn được tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp, tăng sự mềm mại của khớp

- Tham gia vào cấu trúc tái tạo sụn khớp

- Bảo vệ khớp bằng cách ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như

collagenase, elastase, proteoglycanase, phospholipase A2 và N

acetylglucosamindase; kích thích hoạt động các enzym xúc tác phản ứng tổng hợp hyaluronic acid giúp khớp hoạt động tốt [12]

Điều trị CS với liều 800 mg/ngày trong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một năm

có tác dụng giảm đau và cải thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp [38; 60]

Các nghiên cứu dược lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho thấy

CS được sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng phụ nào nghiêm trọng xảy ra [30]

+ Bệnh mắt:

CS là chất sinh lý của giác mạc duy trì độ trong suốt cho mắt, tạo độ nhớt thích hợp và bồi bổ nội mô giác mạc, nuôi dưỡng các tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp phím nước mắt trước giác mạc, tăng cường độ đàn hồi của thấu kính, chống tình trạng khô mắt Mac Rae và cộng sự đã chỉ ra CS có tác dụng giảm sự tổn thương thấu kính mắt CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt, mỏi mắt, thoái hoá võng mạc [27] Ngoài ra CS còn được sử dụng để điều chế chất nhầy thường được dùng trong phẫu thuật lấy thủy tinh thể và đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô và nội mô của giác mạc [7] Công ty TNHH ROHTO-MENTHOLATUM (Việt Nam) sản xuất thuốc nhỏ mắt New V.Rohto

có chứa CS chữa các bệnh: mỏi mắt, xung huyết kết mạc, bệnh mắt do tia cực tím hay các tia sáng khác, nhìn mờ do tiết dịch, mắt ngứa, viêm mi

Sụn cá mập cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ các chứng miễn dịch như thấp khớp, đau nhức xương (phong thấp), vẩy nến, chàm (eczema), luput đỏ [7].

Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả năng tăng cường kháng viêm [31], ức chế

sự tiết các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β [26], nitric oxid và các gốc oxy hóa tự do [24; 62]

1.2.3.2 Các ứng dụng khác

CS có trong thành phần các mỹ phẩm (tác nhân dưỡng tóc, kem dưỡng và chất giữ ẩm…) [17] CS còn có trong thành phần các chế phẩm chứa gelatin (thực phẩm, mỹ phẩm, thuốc, nguyên liệu công nghiệp và làm ảnh)

CS còn có thể bổ sung để điều trị và ngăn tắc nghẽn động mạch, có tác động chống đông máu

CS có tác động điều khiển tế bào CS làm tăng sinh một số loại tế bào bạch cầu, tăng tổng hợp RNA trong tế bào sụn nuôi cấy do đó làm tăng tổng hợp proteoglycogens

và collagens, thúc đẩy sự tích luỹ hyalin trong gan, tuỵ và hạt lympho [63]

1.3 Protease

Protease là những enzym xúc tác quá trình thuỷ phân mối liên kết peptit của các peptit hoặc protein Trong các protease, protease tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả Từ thế kỉ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Reomur đã phát hiện ra trong dich dạ dày của chim

ăn thịt có tác dụng tiêu hoá thịt Corvisart (1857) đã tách được tripxin từ dịch tụy Đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm Sau đó, Bruke đã tách pepxin từ dạ dày chó (1861)… Ngoài ra, thời bấy giờ người ta cũng đã có những quan sát đầu tiên về protease trong máu Các protease ở thực vật được phát hiện muộn hơn và Warts được coi là người đầu tiên tách được protease ở thực vật vào năm 1879 Đó là papain từ đu đủ (Carica papaya) Đến nửa đầu thế kỉ 20, người ta phát hiện thêm các peptithydrolase khác là bromelain ở dứa, catepxin ở

mô cơ động vật Tuy nhiên nguồn protease chủ yếu là từ các vi sinh vật, đặc biệt từ các vi sinh vật Bacillus, Aspergilus, Streptomyces…Các vi sinh vật này thường tổng hợp nhiều protease khác nhau

Cùng với những hiểu biết về protease, việc phân loại và gọi tên các protease cũng thay đổi qua các thời kỳ Năm 1960, Harley phân chia protease thành 4 nhóm theo cơ chế xúc tác, nhưng do có những hiểu biết mới về mặt hoá học của trung tâm xúc tác ở các nhóm này nên Barrett (1980) đã sửa đổi cho phù hợp và được uỷ ban danh pháp hoá sinh quốc tế công nhận (1984) Theo Barrett, tên gọi của 4 nhóm protease này bao gồm tên của acid amin quan trọng nhất đối với vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động và theo đó chúng được chia thành 4 nhóm nhỏ Chúng là các enzym thuộc nhóm 3-hydrolases (thuỷ phân), và phân nhóm 3.4 - peptide hydrolases (thuỷ phân peptide) hay peptidases, có ký hiệu chung là nhóm EC 3.4 Theo tên của acid amin quan trọng nhất hay nhóm hoạt chất đóng vai trò xúc tác

trong trung tâm hoạt động mà protease được chia thành 4 nhóm nhỏ: serine [E.C 3.4.21]; Protease-cysteine (thiol) [E.C 3.4.22]; Protease-aspartic hay endopeptidase [E.C 3.4.23] và Protease kim loại (metallo-protease hay metalloendopeptidase) [E.C 3.4.24] [13; 8]

Protease-Nhiều protease, đặc biệt protease của động vật được tổng hợp ở dạng không hoạt động gọi là tiền enzym (zimogen hay proenzym) Các zimogen có thể chuyển thành dạng hoạt động nhờ quá trình thuỷ phân giới hạn hoặc quá trình chuyển vị cầu disulfit

Các protease tham gia vào hầu hết các quá trình quan trọng của hệ thống sống, chúng không chỉ đóng vai trò là chìa khoá trong việc điều hoà quá trình đổi mới protein trong tế bào mà còn tham gia điều hoà nhiều quá trình sinh lý khác Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y dược và trong nghiên cứu khoa học… Ở nước ta việc nghiên cứu và

sử dụng protease đã được bắt đầu từ những năm 60 và cũng thu được một số thành tựu đáng kể và tạo nhiều chế phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn như: sản xuất nước mắm ngắn ngày, bột làm mềm thịt, bột dinh dưỡng cao cấp

Các protease chiếm vị trí then chốt về chức năng sinh lý trong cơ thể sống đồng thời có tiềm năng ứng dụng thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% thị phần enzym công nghiệp toàn cầu [20;16] Nguồn nguyên liệu để thu protease rất đa dạng và phong phú bao gồm các cơ thể thực vật, động vật và vi sinh vật

Nhiều protease thực vật như Papain từ nhựa của thân, lá, quả đu đủ (Carica papaya); Bromelain từ quả, đọt và chồi dứa (Ananas sativa); Phycin từ nhựa cây cọ (Ficus carica); Keratinase thuỷ phân tóc và len đã được nghiên cứu và thu nhận Papain và Bromelin là những enzym thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực (dược phẩm, mỹ phẩm, chế biến thực phẩm ) Việc sản xuất protease thực vật bị hạn chế vì phụ thuộc vào các yếu tố như diện tích và điều kiện khí hậu để trồng nguyên liệu, hơn nữa quy trình thu nhận enzym tốn nhiều thời gian.Vì thế cho đến nay chỉ có Papain và Bromelain còn đang được sản xuất để ứng dụng [46; 20]

Các protease có nguồn gốc động vật cũng đã được nghiên cứu nhiều như trypsin, chymotrypsin, pepsin và rennin từ tuyến tuỵ, dạ dày Tuy nhiên, nguồn

nguyên liệu để thu các enzym này cũng bị hạn chế vì phụ thuộc nhiều vào sự phát triển của ngành chăn nuôi [16]

Khối lượng protease thực vật và động vật thu được không có khả năng đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thực tiễn cho nên các protease từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virut ) đang được quan tâm đặc biệt Riêng protease vi khuẩn chiếm trên 40% thị phần enzym toàn cầu Đặc điểm ưu việt là chúng có tất cả các đặc tính cần thiết cho các ứng dụng về công nghệ sinh học, nguồn nguyên liệu lại vô cùng lớn, đa dạng và phong phú, hơn nữa quy trình thu nhận lại ít tốn kém về thời gian

và chi phí, hạ được giá thành Trong phạm vi đề tài này chỉ đề cập tới nhóm protease của vi khuẩn là những vi sinh vật sản sinh nhiều loại protease ngoại bào đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ dược phẩm, dệt may, tẩy rửa, thực phẩm và xử lý phế thải

Đa số các protease thương mại từ vi khuẩn chủ yếu thuộc loại enzym trung

tính và kiềm được sản suất từ chi (giống) Bacillus Các protease vi khuẩn trung tính

hoạt động trong dải pH hẹp (pH 5-8) và nhiệt độ tương đối thấp, chúng làm giảm vị đắng (so với protease động vật) cho các sản phẩm thuỷ phân protein, có ái lực cao với các amino acid kỵ nước nên nó được ưa chuộng cho công nghệ chế biến thực phẩm và sữa Một số protease trung tính thuộc protease chứa kim loại nên đòi hỏi các ion kim loại hoá trị 2 cho hoạt động của chúng Các protease vi khuẩn mang tính kiềm có hoạt độ cao ở pH cao (pH 10) và có đặc thù về phổ cơ chất rộng, nhiệt

độ tối ưu khoảng 60oC cho nên rất thích hợp cho công nghệ giặt tẩy [22]

Ở nước ta việc nghiên cứu và sử dụng protease đã được bắt đầu từ những năm 60 và cũng thu được một số thành tựu đáng kể tạo nhiều chế phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn như: thuốc, thực phẩm (sản xuất nước mắm ngắn ngày, bột làm mềm thịt, bột dinh dưỡng cao cấp), chế biến sữa, dệt may, thức ăn cho chăn nuôi và thuỷ sản, xử lý môi trường [4]

1.4 Giới thiệu về cá đuối và cá nhám

1.4.1 Cá đuối

Cá đuối (CĐ) thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) là cá có cơ thể bẹt, và, giống như cá nhám và cá mập, là các loài cá sụn chủ yếu sinh sống ngoài biển, nghĩa là chúng có bộ xương không cấu tạo từ chất xương mà là từ chất sụn cứng và đàn hồi Phần lớn các loài cá đuối có 5 lỗ huyệt cơ thể giống như khe hẹp ở bụng,

gọi là các khe mang dẫn tới các mang, nhưng họ Hexatrygonidae có 6 lỗ huyệt Phần lớn các loài cá đuối có 5 khe mang nhưng có loài có tới 6 khe mang, các khe mang của các loài cá đuối nằm dưới các vây ngực trên mặt bụng, trong khi

ở cá nhám và cá mập thì các khe mang ở hai bên đầu Phần lớn các loài cá đuối có thân phẳng, giống như cái đĩa bẹt, với ngoại lệ là cá giống và cá đao, trong khi phần lớn các loài cá nhám có cơ thể thuôn động học Nhiều loài cá đuối có các vây ngực phát triển thành các phần phụ rộng và bẹt, giống như cánh Chúng không có vây hậu môn Các mắt và các lỗ thở nằm trên đỉnh đầu

Phần lớn các loài cá đuối sống tại đáy biển, trong các khu vực địa lý khác nhau - nhiều loài trong vùng nước ven bờ, một vài loài tại vùng biển sâu tới độ sâu

ít nhất là 3.000 m (9.800 ft), phần lớn các loài cá đuối có sự phân bố rộng khắp thế giới, trong các môi trường nhiệt đới và cận nhiệt đới, ôn đới hay vùng nước lạnh Chỉ vài loài, như cá ó nạng hải (Manta birostris), là sinh sống ngoài biển khơi, và chỉ vài loài sinh sống trong vùng nước ngọt Một số loài cá đuối có thể sống trong các vùng nước lợ và cửa sông Các loài cá đuối sinh sống tại tầng đáy thở bằng cách lấy nước vào thông qua các lỗ thở, chứ không phải thông qua miệng như phần lớn các loài cá khác vẫn làm, và đẩy nước qua các mang ra ngoài

Phần lớn các loài cá đuối có các răng phát triển, nặng, thuôn tròn để nghiền mai hay vỏ cuat các loài sinh vật tầng đáy như ốc, trai, hàu, động vật giáp xác, và một vài loài cá, phụ thuộc vào từng loài Cá ó nạng hải ăn các thức ăn là động vật phù du

Cá đuối được chia thành 2 bộ:

- Bộ Cá đuối thường (Rajiformes) không có cơ quan phát điện Bộ cá này trông giống như cá mập, có đuôi để bơi và các vây ức nhỏ hơn so với phần lớn các loài cá đuối khác Các vây ức của chúng gắn với phần trên của mang như ở mọi loài

cá đuối khác, làm cho chúng có bề ngoài với đầu rộng Chúng có mõm dài, phẳng với một hàng các tấm răng ở cả hai hàm Mõm chúng dài tới 1,8 mét (6 ft), và rộng

30 cm (1 ft), được dùng để chém và xiên qua các con cá nhỏ cũng như để thăm dò trong bùn nhằm tìm kiếm các sinh vật ẩn nấp trong đó Cá đao có thể tiến vào các sông và hồ nước ngọt Một vài loài dài tới 6 mét (20 ft) Bộ CĐ thường gồm nhiều

họ: CĐ đĩa (Platyrhinidae), CĐ bướm (Gymnuridae), ngoài ra còn có các họ cá ó,

có hình dạng như hình con chim, là loài cá đắt nhất do thịt của chúng rất ngon như

cá ó thường (Myliobatidae), cá ó dơi (Mobulidae), cá ó một hàng răng (Aetobatidae), cá ó mõm bò (Rhinopteridae)

- Bộ CĐ điện (Torpediniformes) có cơ quan phát điện, có hình dạng như cây đàn ghi ta, nếu đâm chúng bằng xiên sắt tay sẽ bị tê giật như điện giật Cá đuối điện

có các cơ quan phát ra điện trong các tấm vây ức Các cơ quan này được sử dụng để phóng ra tia điện nhằm làm tê liệt con mồi và để phòng ngự Dòng điện này đủ mạnh để làm con người bất tỉnh, và những người Hy Lạp cùng La Mã cổ đại sử dụng các loài cá này để điều trị chứng đau đầu

Bộ CĐ điện có 2 họ: CĐ điện hai vây lưng (Torpedinidae) và CĐ điện một

vây lưng (Narkidae)

Cá đuối rất đa dạng, nặng từ vài kilôgam đến trên một tấn, dài từ vài chục centimet đến 6 - 7m, phần lớn là cá đáy, ăn chủ yếu các loài động vật trôi nổi, động vật đáy, thân mềm, giáp xác, cá con Ở Việt Nam, đã phát hiện 33 loài, thuộc 16

chi, 10 họ Loài có giá trị kinh tế đáng kể nhất: CĐ bồng gai (Dasyatis uarnak) có

thể dài đến 2m, được khai thác chủ yếu bằng lưới kéo đáy Cá đuối thường xuất hiện nhiều từ tháng giêng đến tháng ba âm lịch, xương của chúng không giống như xương cá bình thường mà là những đốt sụn có thể nhai được Bộ xương của các loài

cá sụn có thành phần chủ yếu là sụn Trong sụn cá đuối với hàm ẩm 65% thì có khoảng 13,8 % protein; 0,19% chất béo; 17,12% là các chất khoáng và khoảng 3,61%

là các hydrate cacbon khác [21]

1.4.2 Cá nhám

Cá nhám thuộc bộ cá sụn cỡ lớn và vừa, sống ở biển Thân thon dài, mõm nhọn, vây ngực rộng, nằm dọc; vây đuôi lớn, khoẻ, hai thùy không bằng nhau Nhiều loài có giá trị kinh tế lớn, thường được khai thác lấy gan làm dầu cá, vây làm cước cá, thịt để

ăn, da làm hàng mỹ nghệ Có nhiều họ: cá nhám búa (Sphyrnidae); cá nhám xà (Carchariidae); cá nhám góc (Squalidae); cá nhám hổ (Heterodontidae); cá nhám mèo (Scyliorhinidae); cá nhám thu (Lamnidae); cá nhám voi (Cetorhinidae); cá nhám kình (Rhincodontidae) Ở biển Việt Nam, gặp nhiều loài cá nhám khác nhau

Cá nhám sinh sống trong các đại dương thuộc vùng nhiệt đới và ôn đới ấm của thế giới Được coi là sống ngoài đại dương nhưng chúng cũng tụ tập lại theo mùa ở một vài khu vực ven bờ như dải đá ngầm Ningaloo ở khu vực miền tây Úc cũng như Pemba và Zanzibar ở khu vực ven bờ đại dương của Đông Phi Khu vực phân bố

của chúng giới hạn trong khoảng vĩ độ ±30 ° tính từ các khu vực này Cá nhám chủ yếu sống cô độc và ít khi thấy chúng bơi thành đàn Người ta tin rằng chúng sống di trú, nhưng các chuyên gia vẫn không rõ chúng có thể di cư xa bao nhiêu (có thể là di trú xuyên đại dương)

Cá nhám ăn các loại sinh vật phù du, tảo lớn, nhuyễn thể hay các loại mực và động vật có xương sống nhỏ Các răng nỏ li ti không giúp ích gì cho quá trình ăn uống của nó, thay vì thế, nước bị hút vào qua miệng và đi qua mang lược và sau đó bị tống

ra khỏi bằng mang cung Những gì mắc lại tại mang lược được nó nuốt hết Cá nhám

có thể luân chuyển nước với tốc độ tới 1,7 L/s (3,5 panh (pint) Hoa Kỳ/s) Tuy nhiên,

cá nhám là loài tích cực săn mồi và chúng phát hiện các mục tiêu như các chỗ có nhiều sinh vật phù du hay cá nhờ các tín hiệu khứu giácchứ không phải luôn luôn chỉ là cơ chế 'hút bụi'

Theo những thủy thủ thì cá nhám voi tập trung tại các bãi đá ngầm ngoài khơi

bờ biển Belize (vùng Caribe), là nơi có thể bổ sung thêm cho thức ăn thông thường của chúng các loại trứng cá chỉ vàng, được các loài cá này đẻ vào giai đoạn từ tháng 5 đến tháng 7 hàng năm trong khoảng thời gian 6-7 ngày kể từ ngày trăng tròn trong các tháng này

Các loài cá nhám thường được lấy gan làm dầu cá, gan chiếm 10-15% trọng lượng cơ thể, khoảng 50% dầu gan có hàm lượng vitamin A và D cao hơn dầu gan cá thu Thịt cá nhám chứa hàm lượng cao protit, 1,9% lipit trong đó có 0,5% omega-3 Sụn có độ ẩm khoảng 6% thì chứa khoảng 40% protein, trong đó chủ yếu là mucopolisacaridos (chondroitin) và collagen Sụn cá nhám chứa 6% canxi và 9% phospho

Giống như phần lớn các loại cá mập khác, tập tính sinh sản của cá nhám vẫn chưa được rõ Dựa trên nghiên cứu một quả trứng đơn lẻ tìm thấy ngoài khơi Mexico vào năm 1956, người ta cho rằng chúng là loài đẻ trứng, nhưng con cá nhám cái có chửa bị bắt vào tháng Bảy năm 1996 chứa tới 300 cá nhám con lại chỉ ra rằng chúng là loài đẻ con với sự phát triển của cơ chế đẻ trứng thay Các trứng phát triển thành cá con trong cơ thể con mẹ bằng các nguồn dưỡng chất ngay trong trứng và con mẹ sẽ đẻ các con non dài 40 - 60 cm Người ta tin rằng cá nhám đạt tới độ tuổi trưởng thành vào khoảng 30 năm và chúng có tuổi thọ ước tính khoảng 60 - 150 năm

Hiện nay hầu hết các chế phẩm CS có bán trên thị trường được sản xuất từ

sụn cá mập là chủ yếu, một phần từ sụn bò, sụn gà nên giá thành cao Ở Việt

Nam, nguồn nguyên liệu CS là nhập từ nước ngoài giá thành lại càng cao và cũng chưa có một công trình nào nghiên cứu thu nhận CS Vì thế việc nghiên

cứu tách chiết CS từ sụn các loài cá nhám, cá đuối có trong nước ta là điều rất cần thiết để thay thế nguồn nguyên liệu đắt tiền là cá mập

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

* Sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii), cá nhám (Carcharhinus sorrah) được thu

thập từ vùng biển Hải Phòng, do Phòng Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản cung cấp

* Chế phẩm enzym protease ngoại bào từ vi sinh vật (B26): Viện Công nghệ

Sinh học cung cấp Hoạt tính 0,17UI/g B26

* Chế phẩm enzym protease ngoại bào từ vi sinh vật (ETM): Trung tâm

BIOLAP cung cấp Hoạt tính 0,96UI/g ETM

* Papain: P3375 (Sigma), hoạt tính 1,5-10UI/mg

* Bromelain: B4882 (Sigma), hoạt tính 3-7 UI/mg

* Hoá chất, thiết bị thí nghiệm

- Các hóa chất phân tích đều đạt độ tinh khiết, chủ yếu là các hóa chất nhập ngoại của các hãng Sigma, Invitrogen, Merk, Prolabo, Bio-Canada: Casein, Folin, BSA (albumin huyết thanh bò), TCA (tricloacetic), tyrosine, cetylpyridium chloride (CPC)

- Thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu này có độ chính xác cao của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hoá học -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

và Trung tâm BIOLAP như: máy đo pH Corning 215 (Anh), cân điện Shimazu (Nhật Bản), cân kỹ thuật Caltex (Tây Đức), box Laminar (Pháp), tủ sấy (Anh), nồi khử trùng (Đài Loan, Nhật Bản), máy ly tâm eppendorf (Đức), bể điều nhiệt Memmer (Mỹ)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định sự có mặt của Chondroitin sulfate trong sản phẩm theo phương pháp tách chiết và tinh chế:

- Gửi mẫu xác định CS bằng phổ NMR gửi mẫu tại Viện hóa học

- Gửi mẫu kiểm hàm lượng CS trong mẫu thô và mẫu đã tinh sạch tại trung tâm Phân tích và Giám định thực phẩm Quốc gia, Viện công nghệ thực phẩm đánh giá

+ Kiểm tra hàm lượng CS trong mẫu thô mục đích xác định phương pháp so màu sử dụng để khảo sát các thông số của quy trình thu nhận chondroitin sulfate

+ Kiểm tra hàm lượng CS trong mẫu tinh mục đích để khảo sát tính chất của sản phẩm chondroitin sulfate

2.2.2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến

* Nguyên lý cơ bản của phương pháp

Cho enzym protease tác dụng với cơ chất casein, sau đó kết tủa protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym trong điều kiện chuẩn, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA tương ứng với 1µmol

+ Phản ứng màu:

Lấy 0,5ml dịch sau phản ứng enzym cho vào ống nghiệm, thêm 2ml Na2CO36%, lắc đều, thêm 0,5ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần, lắc đều Sau 30phút để ở nhiệt độ phòng đem so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 750nm

+ Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosine

Chuẩn bị dung dịch tyrosine với nồng độ khác nhau 0,1-1 µmol/ml trong HCl 0,2N Lấy 0,5ml từ mỗi nồng độ làm phản ứng màu như trên Đo mật độ quang học của các ống Dựng đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ tyrosine Tính hiệu số giá trị mật độ quang học của mẫu thí nghiệm

và mẫu kiểm tra, dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng µmol tyrosine tương ứng Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym ở điều kiện tiêu chuẩn 30oC, sau 1 phút phân giải

protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA tương ứng với 1 micromol tyrosine

Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn của tyrosine

* Nguyên lý cơ bản của phương pháp

Dựa trên sự thay đổi trong quang phổ hấp thụ của DMMB Dimethylmethylene blue) khi tác dụng với glycosaminoglycan sulfate, dùng đồ thị đường chuẩn của CS4 để thấy mối quan hệ giữa tuyến tính hấp thụ ở bước sóng 525nm của phức chất DMMB và CS Phương pháp DMMB rất nhạy có thể định tính

(1,9-và định lượng CS với khối lượng rất nhỏ (µg)

* Vật liệu và hóa chất

- Các dung dịch CS4 chuẩn với các nồng độ khác nhau (1, 2, 4, 6 và 8µg/ml)

- Dung dịch thuốc thử DMMB pha sẵn

với đồ thị chuẩn CS4 (phần phụ lục) để tính ra lượng CS dịch nghiên cứu

2.2.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry

* Nguyên lý cơ bản của phương pháp

Phương pháp Lowry dựa trên nguyên tắc sau: Sự tạo thành phức hợp của đồng

và protein trong dung dịch kiềm, phức hợp của đồng và protein khử phosphomolybdic

– phosphotungstate tạo dung dịch màu xanh đậm

Phương pháp này có thể được sử dụng để xác định từ 20-200µg protein/ml

* Vật liệu và hóa chất

- Dung dịch BSA (bovine serum albumin) có nồng độ khác nhau (0,4; 0,8; 1,2; 1,6 và 2,0mg/ml)

- Thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần

- Thuốc thử A: 1,56g CuSO4.5H2O/100ml nước cất

- Thuốc thử B: 2,37g sodium tartarte/100ml nước cất

- Thuốc thử C: 2g NaOH + 10g Na2CO3/500ml nước cất

- Thuốc thử D: 100ml C+1ml A+1ml B

* Xây dựng đồ thị chuẩn Protein

Bảng 2.3 Xác định đường cong chuẩn protein

STT Protein

(µl) H2O (µl)

Lượng Protein (mg)

Dung dịch D (ml)

Thuốc thử Folin (µl)

2.2.5 Phương pháp sinh học tách chiết Chondroitin sulfate

- Chuẩn bị mẫu: Xương sụn cá nghiền nhỏ, 10g xương sụn thêm vào 40 ml

nước khử ion, 1ml azid natri (0,02%)

- Sử dụng phương pháp thủy phân xương sụn cá đuối, cá nhám bằng enzym papain từ nhựa đu đủ [47], bằng enzym protease ngoại bào B26 và enzym ETM

- Sử dụng ethanol thu tủa CS và phân tách các tạp chất khác [55].

- Sử dụng các muối như cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) hoặc cetylpyridium chloride (CPC), tạo tủa và tinh chế thu CS Các glycosaminoglycan khác, các collagen và hyaluronic acid phần lớn sẽ bị loại bỏ [23]

2.2.6 Xác định một số tính chất và chất lượng của chế phẩm Chondroitin sulfate 2.2.6.1 Xác định độ bền nhiệt của chế phẩm Chondroitin sulfate

Tiến hành xử lý nhiệt chế phẩm CS tinh sạch ở 3 mức nhiệt độ khác nhau:

50oC, 70oC và 90oC trong 6giờ bằng phương pháp sấy thông thường trong tủ ổn nhiệt và so sánh với mẫu CS được đông khô Kết thúc quá trình, kiểm tra mẫu bằng phản ứng màu DMMB để xác định hàm lượng CS còn lại

2.2.6.2 Xác định độ bền acid của chế phẩm Chondroitin sulfate

Tiến hành xử lý chế phẩm trong HCl 0,01M có pH=2 trong 1giờ Kết thúc quá trình, kiểm tra mẫu bằng phản ứng màu DMMB để xác định hàm lượng CS còn lại

2.2.6.3 Phương pháp xác định hàm ẩm

Áp dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi ở nhiệt độ 105oC

Độ ẩm của chế phẩm CS được tính theo công thức:

Trong đó:

mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi

m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy

m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi

2.2.6.4 Xác định vết kim loại nặng: gửi mẫu kiểm tại Viện Hóa Học

2.2.7 Bố trí thí nghiệm

2.2.7.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu nhận và tinh sạch Chondroitin sulfate

Nồng độ: 0,1-0,9ml/10g sụn

T0: 300C– 700C pH: 4,5 – 8,5 Thời gian: 4 - 60giờ Sụn cá

Thủy phân bằng enzym

Rửa tủa bằng NaCl

CPC/ CTAB

KCSN

Thuyết minh quy trình:

3 Ly tâm, thu dịch chứa CS

Dịch sau khi được thuỷ phân đem ly tâm 1200v/phút để thu dịch chứa CS Sử dụng ethanol ở 40C trong 24 giờ để tủa dịch CS vừa thu được Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid Ethanol ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của protein và làm protein kết tủa Sau đó tiếp tục ly tâm

để thu tủa chứa CS Hoà tủa trong nước khử ion bổ sung muối của ammonium (CPC- CTAB) để tạo tủa và tinh chế thu CS

4 Rửa tủa

Dùng NaCl 0,4M để hoà tan các GAG gốc sulfate thấp trong phức hợp tủa CTAB-GAG và CPC-GAG Sau khi loại bỏ các GAG gốc sulfate thấp như hyaluronic acid, chỉ còn lại tủa CPC-GAG và CTAB-GAG chứa các GAG gốc sulfate cao, chủ yếu là CS CS trong phức tủa CPC-GAG và CTAB-GAG sẽ được hòa tan phần lớn trong các muối nồng độ cao 2,1M NaCl và tiếp tục đượctinh chế bằng thẩm tích và kết tủa bằng ethanol để thu CS tinh khiết

5 Chế phẩm CS tinh sạch

Sau khi tủa dịch bằng ethanol thu được CS tinh khiết đem đi sấy khô để bảo quản

Từ sơ đồ tổng quát trên sẽ tiến hành nghiên cứu xác định các thông số thích hợp

cho từng quá trình nghiên cứu cụ thể

2.2.7.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn điều kiện tối thích cho hoạt động của protease ngoại bào B26

2.2.7.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH tối thích

Với cùng một điều kiện giống nhau, chỉ thay đổi pH của dung dịch đệm (Na-acetat (0,01M) ở pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate (0,01M) ở pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5) trong phản ứng thủy phân Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym protease (B26) cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám

Lấy 10g sụn cắt nhỏ, bổ sung 4ml H2O khử ion và cuối cùng cho 2,5ml enzym ở

400 C trong 6h, sau đó thu dịch sau thủy phân và tủa protein bằng TCA 7% với tỷ lệ 1/2, để qua đêm ở nhiệt độ 40C

Các mẫu tủa bằng TCA được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên và xác định hàm lượng tyrosine bằng phương pháp Anson cải tiến như đã trình bày trong phần 2.2.2

7,5

6,5 ,4,5

Sụn cá Thủy phân

5,5 5

- Nhiệt độ: 400C

- Thời gian: 2 giờ

- Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn

2.2.7.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ tối thích của ch ế phẩm B-26

Với cùng một điều kiện thủy phân giống nhau, chỉ thay đổi nhiệt độ của phản

ứng thủy phân và pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1 Dựa vào phương pháp

Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym B26 cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám Tiến hành thí nghiệm và các bước xác định nồng độ tyrosine trong các mẫu sau thủy phân tương tự như đã mô tả ở

mục 2.2.7.2.1

2.2.7.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích

Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (pH tối ưu được

xác định ở mục 2.2.7.2.1, nhiệt độ tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.2) và cùng 1

nồng độ enzym (2,5ml enzym B26 thủy phân 10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân ở các thời gian khác nhau (4h, 8h, … ,

400C

- pH: Tối thích

- Thời gian: 2giờ

- Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn

Dịch thủy phân chứa CS

Dịch thủy phân chứa CS

Chế phẩm enzym B26

48h 44h

4h

Sụn cá Thủy phân

8h

- pH: Tối thích

- Nhiệt độ: Tối thích

- Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn