phẩm ETM
2.2.7.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH tối thích
Với cùng một điều kiện thủy phân giống nhau, chỉ thay pH. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym ETM cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám.
Lấy 10g sụn cắt nhỏ, bổ sung 4ml H2O khử ion và cuối cùng cho 0,5ml enzym. Thay đổi pH của dung dịch đệm (Na-acetat (0,01M) ở pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate (0,01M) ở pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5) ở nhiệt độ 550C trong 6h, sau đó thu dịch sau thủy phân và tủa protein bằng TCA 7% với tỷ lệ 1/2, để qua đêm ở nhiệt độ 40C.
Các mẫu tủa bằng TCA được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên và xác định hàm lượng tyrosine bằng phương pháp Anson cải tiến như đã trình bày trong phần 2.2.2.
Dịch sau thủy phân được tủa bằng ethanol 96% và để qua đêm ở nhiệt độ -40C. Sau đó ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 20 phút để thu tủạ Hàm lượng CS trong tủa được xác định bằng phương pháp DMMB.
Dịch thủy phân chứa CS
9,5 Chế phẩm enzym ETM 8,5 7,5 6,5 4,5 Sụn cá Thủy phân 5,5 - Nhiệt độ: 550C - Thời gian: 6giờ
2.2.7.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ tối thích
Với cùng một điều kiện giống nhau, chỉ thay đổi nhiệt độ của phản ứng thủy phân 400C, 450C, 500C, 550C, 600C, 650C, 700C và cùng 1 nồng độ enzym (0,5ml enzym Etm thủy phân/10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân thời gian 6giờ. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym protease (ETM) cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám. Tiến hành thí nghiệm và các bước xác định nồng độ tyrosine và CS trong các mẫu sau thủy phân tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.3.1.
2.2.7.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích
400C ... 650C Chế phẩm enzym ETM 700C Sụn cá Thủy phân 450C - pH: Tối thích
- Thời gian: 6giờ
- Nồng độ:0,5ml enzym/10g sụn
Dịch thủy phân chứa CS
Chế phẩm enzym ETM 66h 60h ... 6h Sụn cá Thủy phân 12h - Nhiệt độ: tối thích - pH: tối thích - Nồng độ: 0,5ml enzym/10g sụn
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu) và cùng 1 nồng độ enzym enzym (0,5ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân ở các thời gian khác nhau (6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine và CS tương tự như đã mô tả ở trên.
2.2.7.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng độ tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu (nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, thời gian tối ưu) đã được xác định ở trên, tiến hành thủy phân ở các nồng độ enzym khác nhau 0,1 ; 0,2; … ; 0,9ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá đuối, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine và CS tương tự như đã mô tả ở mục trên.