protease ngoại bào B26 .
2.2.7.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH tối thích.
Với cùng một điều kiện giống nhau, chỉ thay đổi pH của dung dịch đệm (Na-acetat (0,01M) ở pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate (0,01M) ở pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5) trong phản ứng thủy phân. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym protease (B26) cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám.
Lấy 10g sụn cắt nhỏ, bổ sung 4ml H2O khử ion và cuối cùng cho 2,5ml enzym ở 400 C trong 6h, sau đó thu dịch sau thủy phân và tủa protein bằng TCA 7% với tỷ lệ 1/2, để qua đêm ở nhiệt độ 40C.
Các mẫu tủa bằng TCA được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên và xác định hàm lượng tyrosine bằng phương pháp Anson cải tiến như đã trình bày trong phần 2.2.2.
Chế phẩm enzym B26
Dịch thủy phân chứa CS
9,5 8,5 7,5 6,5 , 4,5 Sụn cá Thủy phân 5,5 5 - Nhiệt độ: 400C - Thời gian: 2 giờ
2.2.7.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ tối thích của chế phẩm B-26
Với cùng một điều kiện thủy phân giống nhau, chỉ thay đổi nhiệt độ của phản ứng thủy phân và pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym B26 cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám. Tiến hành thí nghiệm và các bước xác định nồng độ tyrosine trong các mẫu sau thủy phân tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.2.1.
2.2.7.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1, nhiệt độ tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.2) và cùng 1 nồng độ enzym (2,5ml enzym B26 thủy phân 10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân ở các thời gian khác nhau (4h, 8h, … ,
Chế phẩm enzym B26 700C 600C 500C 300C Sụn cá Thủy phân 400C - pH: Tối thích - Thời gian: 2giờ
- Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn
Dịch thủy phân chứa CS
Dịch thủy phân chứa CS
Chế phẩm enzym B26 48h 44h ... 4h Sụn cá Thủy phân 8h - pH: Tối thích - Nhiệt độ: Tối thích - Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn
44h, 48h). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine tương tự như đã mô tả ở mục
2.2.7.2.1.
Dịch sau thủy phân được tủa bằng ethanol 96% và để qua đêm ở nhiệt độ -40C. Sau đó ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 20 phút để thu tủạ Hàm lượng CS trong tủa được xác định bằng phương pháp DMMB.
2.2.7.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng độ tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1, nhiệt độ tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.2, thời gian tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.3 và tiến hành phản ứng ở các nồng độ enzym khác nhau (4 ml, 6ml, 8ml, 10ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá đuối, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp ). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.2.1, và xác định CS tương tự như đã mô tả ở mục
2.2.7.2.3.
Dịch thủy phân chứa CS
4ml/10g 6ml/10g 8ml/10g 10ml/10g Chế phẩm enzym B26 Sụn cá Thủy phân - pH: tối thích - Nhiệt độ: tối thích - Thời gian: tối thích