* Nguyên lý cơ bản của phương pháp
Cho enzym protease tác dụng với cơ chất casein, sau đó kết tủa protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym trong điều kiện chuẩn, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA tương ứng với 1µmol tyrosine[45; 9].
* Hoá chất
Thuốc thử folin pha loãng 5 lần, Na2CO3 6%; TCA 5%; Casein 1% trong đệm phosphate 0,01M, pH 7,0
* Tiến hành
+ Phản ứng enzym:
Lấy 0,5ml enzym, giữ 10–15phút ở 30oC, thêm 1ml dung dịch casein 1% (đã đạt 30oC), lắc đều, giữ ở 30oC đúng 10phút. Sau đó cho ngay 2,5ml TCA vào, lắc đều và để lắng 30phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10phút để thu dịch trong suốt có chứa sản phẩm hoà tan của phản ứng enzym. Hàm lượng của sản phẩm trong dung dịch lọc được xác định bằng phản ứng màụ
+ Phản ứng màu:
Lấy 0,5ml dịch sau phản ứng enzym cho vào ống nghiệm, thêm 2ml Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0,5ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần, lắc đềụ Sau 30phút để ở nhiệt độ phòng đem so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 750nm.
+ Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosine
Chuẩn bị dung dịch tyrosine với nồng độ khác nhau 0,1-1 µmol/ml trong HCl 0,2N. Lấy 0,5ml từ mỗi nồng độ làm phản ứng màu như trên. Đo mật độ quang học của các ống. Dựng đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ tyrosinẹ Tính hiệu số giá trị mật độ quang học của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng µmol tyrosine tương ứng. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym ở điều kiện tiêu chuẩn 30oC, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA tương ứng với 1 micromol tyrosine.
Bảng 2.1. Xác định đường cong chuẩn của tyrosine Nồng độ Dung dịch 0,1mM 0,2 mM 0,3mM 0,4 mM 0,5 mM 0,6mM 0,7mM Tyrosine (ml) 0,05 0,1 0,15 0,20 0,25 0,3 0,35 HCl 0,2N (ml) 0,45 0,4 0,35 0,30 0,25 0,2 0,15
Hoạt độ phân giải protein của 1 ml dung dịch enzym được xác định như sau: a . 4 . k
X = t Trong đó:
X: Số đơn vị hoạt độ trong 1ml dịch enzym 4: Thể tích của hỗn hợp phản ứng và TCA
a: Số µmol tyrosine tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang học của ống thí nghiệm và ống kiểm tra
k: Độ pha loãng dung dịch enzym. t: Thời gian phản ứng (10 phút).