bằng phương pháp sinh học.
Bảng 3.11. Sơ lược tính giá thành cho 100g CS tinh sạch (hàm lượng CS ~ 90%) từ sụn cá nhám, cá đuối
TT Nguyên liệu Đơn
vị Số lượng Đơn giá (nghìn đồng) Thành tiền (nghìn đồng) 1 Nguyên liệu Sụn cá nhám, cá đuối kg 2,0 100 200 2 Hóa chất NaCl kg 2,1 48 101 Ethanol lit 10,0 15 150 CPC kg 0,24 2.900 8.640 (hãng Merk) 696 (2.074) KSCN kg 0,24 256 61 Enzym ETM g 100 0,42 42 3 Bao bì 5
4 Vật liệu tiêu hao 10
5 Năng lượng (than, điện, nước)
20
6 Công lao động 50
7 Khấu hao thiết bị 10
Tổng chi phí sản xuất 1.345 (giá CPC trên mạng)
2.723 (Hãng Merk)
8 Các chi phí khác bằng 10% chi phí sản xuất (hao hụt trong sản xuất, vận chuyển, dịch vụ,… 135 (giá CPC rẻ) 272 (giá CPC của Merk) Tổng chi phí 1.480 (CPC rẻ) 2.995 (CPC Merk) Kết quả sơ lược tính chi phí cho quy trình sản xuất quy mô 100g CS tinh sạch (hàm lượng CS khoảng 88,8%) bảng 3.11 cho thấy giá thành CS khoảng 1.480.000 đồng (tính theo giá CPC mua trên mạng), nếu giá CPC theo hãng Merk (đặt mua) thì giá thành của 100g CS tinh sạch sẽ là 2.995.000đ. Giá thành sản xuất thấp hơn nhiều so với giá CS của các hãng Sigma, Bio-Canada, và rẻ hơn giá CS do Trung Quốc sản xuất. Giá CS trên thị trường được một số công ty cung cấp rất cao, giá cho 100 gam CS.
- CS4(9819) từ sụn bò, Sigma, độ tinh sạch ≥ 60%, giá 21.450.000 đồng.
- CS6(CB0300) từ sụn cá mập, Bio-Canada, độ tinh sạch ≥ 70%, giá 30.000.000 đồng. - CS6(C4384) từ sụn vi cá mập,Sigma, độ tinh sạch ≥ 90%, giá: 150.000.000 đồng.
- CS4 từ sụn bò của Trung Quốc do công ty hóa chất Minh Anh, Thạch Bàn, Long Biên, Hà nội cung cấp có giá 1.800.000 đồng.
Bảng 3.12. Sơ lược tính giá thành cho 100g CS thô (hàm lượng CS 51,8%) sụn cá nhám, cá đuối
TT Nguyên liệu Đơn
vị Số lượng Đơn giá (nghìn đồng) Thành tiền (nghìn đồng) 1 Nguyên liệu Sụn cá nhám, cá đuối kg 0,4 100 40 2 Hóa chất Ethanol lit 2 15 30 Enzym (ETM) g 20 0,42 8 3 Bao bì 5
4 Vật liệu tiêu hao 5
5 Năng lượng (than, điện, nước) 15
6 Công lao động 25
7 Khấu hao thiết bị 10
Tổng chi phí sản xuất 138 8 Các chi phí khác bằng 10% chi phí
sản xuất (hao hụt trong sản xuất, vận chuyển, dịch vụ,…)
14
Tổng chi phí 152
Giá thành để sản xuất 100g chế phẩm CS thô (có hàm lượng CS khoảng 50%) là 152.000 đồng (bảng 3.12). Trong thành phần sụn có rất nhiều các chất có hoạt tính sinh học như collagen, hyaluronic acid, và các glycosaminoglycan khác không phải CS. Các hoạt chất này cũng đã được nghiên cứu phối trộn cùng với CS sử dụng trong nhiều loại thực phẩm chức năng để tăng cường hệ thống miễn dịch, chống viêm khớp, làm đẹp dạ...Vì vậy việc sử dụng chế phẩm CS thô làm thực phẩm chức năng sẽ giảm nhiều giá thành và đồng thời cũng tận thu được các hoạt chất quý hiếm khác có trong sụn.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Ị KẾT LUẬN
1. Điều tra được hàm lượng CS trong sụn cá nhám (Carcharhinus sorrah) đạt khoảng 17,2%, trong sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) đạt khoảng 12,0% trên trọng lượng sụn khô.
2. Xác định được pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease từ chủng B26 trên cơ chất sụn cá đuối và cá nhám. Enzym protease của chủng B26 có hoạt tính cao nhất tại pH 8,5 và ở 50°C. Xác định được các điều kiện thuỷ phân tối ưu của protease từ chủng B26 với tỷ lệ 4ml enzym (hoạt độ: 0,17UI/ml enzym)/10g sụn cá và thời gian thủy phân là 48 giờ. Protease ngoại bào của chủng B26 là nguồn enzym tiềm năng có thể sử dụng cho quá trình thủy phân sụn và chiết tách CS.
3. Đã nghiên cứu được các điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm enzym ETM thủy phân protein liên kết CS trong sụn cá: nhiệt độ tối ưu: 55ºC; pH tối ưu 5,5; thời gian thủy phân 48 giờ, tỷ lệ thủy phân tối ưu: 0,7ml ETM /10g sụn (hoạt độ: 0,96 UI/ml ETM). Chế phẩm ETM cho hiệu quả thủy phân sụn, chiết rút CS mạnh hơn và giá thành rẻ hơn so với sử dụng papain hay protease ngoại bào từ chủng B26.
4. Xây dựng được quy trình tinh sạch CS từ sụn cá đuối và cá nhám bằng chế phẩm enzym ETM và enzym ngoại bào từ chủng B26.
- CS thu được đạt các tiêu chuẩn chất lượng USA: Chế phẩm CS có độ sạch đạt khoảng 88,8%; hiệu suất tinh sạch CS đạt 9,65%trên trọng lượng mẫu khô của sụn cá nhám và cá đuối, hàm lượng protein trong chế phẩm rất thấp khoảng 0,39%, hàm lượng kim loại nặng không quá 2ppm.
- Chế phẩm CS bền nhiệt, bền trong pH acid.
IỊ KIẾN NGHỊ
1. Hoàn thiện quy trình tinh sạch CS ở quy mô lớn hơn làm cơ sở cho việc ứng dụng sản xuất CS. Nghiên cứu sử dụng có hiệu quả chế phẩm CS thô để giảm giá thành.
2. Thử nghiệm phối trộn với các chế phẩm thuốc khác như glucosamine sulfate, hyaluronic acid, collagen… để tạo các sản phẩm thuốc đạt hiệu quả phòng chữa bệnh caọ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bùi Thị Bằng.(2006), Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao-Nghiên cứu thuốc từ
thảo dược, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.; tr: 581-607.
2 .Đỗ Trung Đàm (1996) Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Y học. 3. Nguyễn Kim Cẩn, (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược. NXB Khoa học và Kỹ
thuật Hà nộị
4. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, (1998),
Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.
5. Lại Thị Ngọc Hà, (2009), Nghiên cứu tách và tạo chế phẩm bromelain từ phế phụ
phẩm dứạ Tạp chí khoa học và phát triển, tập 7, số 2: 203-211.
6. Lê Xuân Phương, (2001) Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nộị
7. Phạm Thị Khánh Vân, Vũ Thị Thái, (2004) Phím nước mắt và tác dụng của
Chondrroitin sulfate, Tạp chí Thuốc và Sức khoẻ, số 273 tháng 12/2004.
8. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, (2006).Hoá Sinh Học, NXB Giáo dục.
9. Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Đình, Lê Thị Lan Oanh, (2010), Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng công nghệ sinh học. Tạp chí Viện nghiên cứu Hải sản số 16: 26-30
Nước ngoài
10. Abdelnasser S.S.I, Nefisa M.Ạ EI-Shayeb and Sohair S. M. (2007), Isolation and
Identification of Alkaline Protease Producing Alkaliphilic Bacteria from an Egyptian Soda Lake, Journal of Applied Sciences Research. ; 3(11): 1363-1368.
11. Adebowale E, Liang Z, Ashraf M, Eđington ND, (1999), Development and validation of a high performance size exclusion chromatographic method for the quantitation of chondroitin sulfate in raw materials, powder blends and dosage forms. . Under review J Pharmaceut Biomed. Anal.
12. Antonilli L, Paroli E, (1993), Role of the oligosaccharide inner core in the inhibition of human leukocyte elastase by chondroitin sulfates, 13: 7-11.
13. Barrett J, (1986), The classes of proteolytic enzym. In Plant proteolytic enzymes, Dalling MJ. pres. 1-16.
14. Bernfield M, Gotte M, Park P.W, Reizes O, Fitzgerald M.L, Lincecum J, and Zako M. (1999), Functions of cell surface heparin sulfate proteoglycans. Annụ
Rev, Biochem. 68: 729-777.
15. Bruyere O, Reginster JY, (2007), Glucosamine and chondroitin sulfate as therapeutic agents for knee and hip osteoarthritis. Drugs Aging. 24(7): 573-580.
16. Cristobal NA, Garardo GS, Plilia A, Rado-B, Raul RH, Jose L, Martinez-H and Juan C, Contreras-E, (2008), Perspectives of Solid State Fermentation for Production of Food Enzymes, American Journal of Biochemistry and Biotechnology ,
17. Cohen M, Wolfe R, Mai T, Lewis D, (2003), A randomized, double blind, placebo controlled trial of a topical cream containing glucosamine sulfate, chondroitin sulfate, and camphor for osteoarthritis of the knee, J Rheumatol 30:523-528.
18. Don W.C, Hee S.K, Soo H.C, Gi S.J, Kyung ỴS, Seung Ỵ C. (2003). A size- exclusion HPLC method for the determination of sodium chondroitin sulfate in pharmaceutical preparations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 3: 1229-1236.
19. Farndale W.R, Buttle D.J, Barrett ẠJ, (1986), Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene bluẹ Biochim. Biophys. Acta 883. 173-177.
20. Folasade M. Olajuyigbe and Joshua Ọ Ajelẹ (2005), Production dynamics of extracellular protease from Bacillus species, African Journal of Biotechnology Vol.4(8), pp 776-779.
21. Garnjanagoonchorn W, Wongekalak L, Engkagul A, (2007), Determination of chondroitin sulfate from different sources of cartilage, Chemical Engineering and Processing 46. 465-471.
22. Gupta R., Beg Q.K., Lorenz P, (2002), Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Appl Microbiol Biotechnol. 59(1):15-32
23. Hascall V.C. (1988), Proteoglycans: The chondroitin sulfate/keratin sulfate proteoglycan of cartilage, Institute for Scientific Information Atlas of Science, Biochemistry, Institute for Scientific Information, Philadelphia, PẠ (1): 189- 198.
24. Iovu M, Dumais G and du Souich P. (2008) Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate, Osteoarthritis Cartilagẹ 16 (3): 8-14
25. James K, "Nuclear magnetic resonance (NMR)" (tái bản tại Đại học Cambridge).
University of California, Irvine.
26. Jomphe C, Gabriac M, Hale TM, Heroux L, Trudeau LE, Deblois D, (2007).
Chondroitin sulfate inhibits the nuclear translocation of nuclear factor-kappaB in interleukin-1beta-stimulated chondrocytes. Basic Clin Pharmacol Toxicol .
27. Kamata K, Takahashi M, Terajima K, Nishijima M. (1995). Spectrophotometric
determination of sodium chondroitin sulfate in eye drops after derivatization with 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazolẹ Analyst 120:2755-2758
28. Kamura T.Na, Matsunaga E, and Shinkai H, (1983). Isolation and some structural analyses of a proteodermatan sulfat from calf skin. Biochem J. 213 (2): 289-296.
29. Kazufusa S, Yozo K, Toshihiko T, Toshio I, Yoichiro I, (2001), Separation of chondroitin sulfate and hyaluronic acid fragments by centrifugal precipitation chromatography, Journal of Chromatography A, 922. 365-369.
30. Leeb F et al, (2000).Chondroitin sulfate: Clinical review in osteoarthritis, J. Rheumatol, 27(1): 205-211.
31. Legendre F, Bauge C, Roche R, Saurel AS, Pujol JP, (2007), Chondroitin sulfate
modulation of matrix and inflammatory gene expression in IL-1beta-stimulated chondrocytes-study in hypoxic alginate bead cultures, Osteoarthritis Cartilage 2007.
32. Liang Z, Leslie J, Adebowale A, Ashraf M, Eđington ND, (1999).
Determination of the nutraceutical glucosamine hydrochloride in raw materials, dosage forms, and plasma using pre-column derivatization with ultraviolet HPLC, J Pharm Biomed Anal 1999; 20: 807-814.
33. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951), Protein measurement
with the Folin phenol reagent, J. Biol, Chem, 193 (1): 265–75.
34. Luo XM, Fosmire GJ, Leach RMJr, (2002).Chicken keel cartilage as a source of
chondroitin sulfatẹ Poult Sci, 81(7): 1086-1089.
35. Luspez CJ, Sỏnchez MDI, Delgado RKẸ (2007), Quantitation of glucosamine from shrimp waste using HPLC. J Chromatogr Sci, 45(4): 195-199.
36. Lyon M, and Gallagher JT, (1998).Bio-specific sequences and domains in
heparan sulphate and the regulation of cell growth and adhesion, Matrix Biol, 17: 485-493.
37. Miller, Gail L, (1959), Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of
reducing sugar, Analytical Chemistry, March 31 (3): 426-428
38. Michel BA, Stucki G, Frey D, De Vathaire F, Vignon E, Bruehlmann P, (2005)
Chondroitins 4 and 6 sulfate in osteoarthritis of the knee: a randomized controlled tria,. Arthritis Rheum, 52: 779-786.
39. Mojarrad JS, Nemati M, Valizadeh H, Ansarin M, Bourbour S. (2007).Preparation of glucosamine from exoskeleton of shrimp and predicting
production yield by response surface methodologỵ J Agric Food Chem. 55 (6): 2246-2250.
40. Nakano T, Ikawa N, and Ozimak L, (2000), An economical method to extract chondroitin sulphate-peptide from bovine nasal cartilage, Canadian agricultural engineering, 42 (4): 205 -208.
41. Nakano T, Nakano K, Sim JS, (1998), Extraction of glycosaminoglycan peptide from bovine nasal cartilage with 0.1M sodium acetate, J. Agric. Food Chem. 46: 772–778.
42. Nakano T, Ikawa N and Ozimek L, (2001). Extraction of Glycosaminoglycans from Chicken Eggshell. Poultry Science,. 80: 681-684.
43. Nakano T, Sunwoo HH, Li X, Price MA, and Sim JS. (1996). Study of sulfated
glycosaminoglycans from porcine skeletal muscle epimysium including analysis of iduronosyl and glucuronosyl residues in galactosaminoglycan fractions, J. Agric, Food Chem, 44: 1424–1434.
44. Ogamo A, Yamada T, Nagasawa K, (1987), A study on heterogeneity in molecular species of shark cartilage chondroitin sulfate C, Fractionation of the polysaccharide on Sepharose CL-4B in the presence of high concentrations of ammonium sulfatẹ Carbohydr Res. 165 (2): 275-280.
45. Pietrowa JS, Wincjunajte MM. (1966). Opredelenie proteoliticheskoi aktivnosti fermentnykh preparatov mikrobiologicheskovo proiskhozhdenia, Priklad. Biochem. Mikro-bio, 2. 232.
46. Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Deshpande VV, (1998), Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases, Microbiol Mol Biol Rev, 62: 597–635.
47. Robert ML, Thomas NH, and Ian AN, (2000).A fingerprinting method for
chondroitin/dermatan sulfate and hyaluronan oligosaccharides, Glycobiolog, 10 (4): 393-401.
48. Robert M. Lauder, (2009), Chondroitin sulphate: A complex molecule with potential impacts on a wide range of biological systems, Complementary Therapies in Medicine, 17: 56-62.
49. Rodén L, Baker JR, Cifonelli A, and Mathews MB, (1972), Isolation and characterization of connective tissue polysaccharides, Methods in Enzymology 53Ạ 69-82.
50. Sarah ET, Ross M, Cristal IG, Sherry MT, Xuewei L, and Linda C. Hsieh- Wilson. (2004), A Chondroitin Sulfate Small Molecule that Stimulates Neuronal
Growth. J. Am. Chem. Soc. 126 (25), pp 7736–7737
51. Sikder K,Das Ạ (1979), Isolation and characterization of glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) from the skin of the fish Labeo rohita, Carbohydr, Res. 71: 273-285
52. Scott JE, (1965), Methods in Carbohydrate Chemistry, Whistler R. L., Ed.; Academic:
Newyork. 5: 38-44.
53. Selleck SB, (2000), Proteoglycans and pattern formation: sugar biochemistry meets developmental genetics, Trends Genet, 206-212.
54. Sharmin S, Hossain Md.T and Anwar MN, (2005), Isolation and
Characterization of a Protease Producing Bacteria Bacillus amovivorus and Optimization of Some Factors of Culture Conditions for Protease Production. Journal of Biological Sciences. 5 (3): 358-362.
55. Shil SC, You SJ, Anb K, Kang CW, (2006), Study on extraction of
mucopolysaccharide-protein containing chondroitin sulfate from chicken keel cartilage. Asian-australasian journal of animal sciences, 19 (4): 601-604.
56. Silbert JE, Sugumaran G. (2002), Biosynthesis of chondroitin/dermatan sulfate,
IUBMB Life 54. (4): 177-186.
57. Schiller S, Solver GA, Dorfman A, (1961), A method for the separation of acid mucopolysaccharides: its application to the isolation of heparin from the skin of rats. J. Biol, Chem, 983-987.
58. Sperling MB, Welz B, (1999), Atomic Absorption Spectrometry, Weinheim: Wiley-VCH.
59. Turnbull J, Powell A, and Guimond S, (2001), Heparan sulfate: decoding a 0dynamic multifunctional cell regulator, Trends Cell Biol, (11): 75-82.
60. Uebelhart D, Malaises M, Marcolongo R, DeVathairell F, Piperno M, Mailleux E, Fioravanti A, Matoso L, Vignon Ẹ (2004). Intermittent treatment of knee
osteoarthritis with oral chondroitin sulfate: a one year, randomized,double blind, multicenter study versus placebo, Osteoarthr. Cartilage 12. 269-276.
61. Vynios DH, Aletras A, Tsiganos CP, Tsegenidis T, Antonopoulos CA, Hjerpe A, Engfeld B, (1985).Proteoglycans from squid cranial cartilage extraction and
characterization, Comp. Biochem. Physiol. 80B. 4: 761-766.
62. Xiong SL, Jin ZY, Li AL, (2006), Bioactive composition of pig laryngeal cartilage extracts and their free radical-scavenging activity, Food Sci Technol Int, 12:371—377. 63. Trang Web: http://www.hiendaihoạcom/environment_detail.php?id=224 http://dictionarỵbachkhoatoanthụgov.vn http://ccbolgroup.com/hierbas2Ẹhtml http://vịwiktionarỵorg/wiki/hplc http://wikipediạCartilage http://wikipediạBME/ME 456 Biomechanics http://wikipediạChondrroitin Sulfate
PHỤ LỤC Bảng 3.12. Nồng độ chuẩn CS Nồng độ CS4 chuẩn: y = 0,025x + 0,0825 với R2 = 0,943 Microgam 2 4 6 8 10 OD 0,126 0,191 0,24 0,282 0,334 Nồng độ CS6 chuẩn: y = 0,0294x +0,1092 với R2 = 0,992 Microgam 2 4 6 8 10 OD 0,163 0,224 0,3 0,344 0,397
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease của chủng B26
pH 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5
Hoạt tính tương đối (%) 9,2 71,8 79,5 87,1 100 94,6 Hoạt độ protease (unit/ml) 0,036 0,282 0,310 0,338 0,386 0,350
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease của chủng B26
Nhiệt độ (0C) 30 40 50 60 70
Hàm lượng Tyrosine 0,15 0,20 0,21 0,16 0,05 Hoạt độ (unit/ml.phut) 0,307 0,401 0,426 0,316 0,096 Hoạt tính tương đối (%) 72,1 93 100 74,4 23,3
Bảng 3.15. Ảnh hưởng nồng độ protease của chủng B26 lên quá trình thủy phân sụn cá Nồng độ 0,2 ml/g 0,4 ml/g 0,8 ml/g 1ml/g % tyrosine 90,5 100 75,4 74,7 protein (mg) 0,73 0,61 0,596 0,572 % protein 100 83,5 81,6 78,4 CS(%) 85,2 100 95,8 90,7
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thuỷ phân sụn cá của protease từ chủng B26 Thời gian 1h 4h 8h 12h 18h 24h 36h 48h Đối chứng 0,254 0,291 0,3175 0,353 0,4175 0,4 0,399 0,402 Thí nghiệm 0,5875 0,7035 0,754 0,817 0,883 0,871 0,877 0,875 Hiệu OD 0,3335 0,4125 0,435 0,46 0,4655 0,471 0,478 0,473 % Tyrosine 69,66 86,4 91 96,2 97,28 98,53 100 98,95 CS 1791 5763 9782 10642 11024 11853 11836 11841 % CS 15,1 48,6 82,5 89,8 93 100 99,85 99.89 Protein 10,72 9,83 9,24 8,861 7,972 6,429 %Protein 100 91,7 86,19 82,65 74,34 59,98
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ thủy phân của ETM và hàm lượng CS giải phóng. Nhiệt độ (0C) 40 45 50 55 60 65 70 Tyrosin (micromol) 22,6352 24,5852 30,9952 34,0152 27,6752 17,1552 15,2752 % tyrosin 66,55 72,28 91,12 100 81,36 50,44 44,91 CS (mcg) 117888 160272 119700 144102 161136 131922 119364 % CS 90,22 97,3 98,06 100 97,67 84,35 80,22