2.2.6.1. Xác định độ bền nhiệt của chế phẩm Chondroitin sulfate
Tiến hành xử lý nhiệt chế phẩm CS tinh sạch ở 3 mức nhiệt độ khác nhau: 50oC, 70oC và 90oC trong 6giờ bằng phương pháp sấy thông thường trong tủ ổn nhiệt và so sánh với mẫu CS được đông khô. Kết thúc quá trình, kiểm tra mẫu bằng phản ứng màu DMMB để xác định hàm lượng CS còn lạị
2.2.6.2. Xác định độ bền acid của chế phẩm Chondroitin sulfate
Tiến hành xử lý chế phẩm trong HCl 0,01M có pH=2 trong 1giờ. Kết thúc quá trình, kiểm tra mẫu bằng phản ứng màu DMMB để xác định hàm lượng CS còn lạị
2.2.6.3. Phương pháp xác định hàm ẩm
Áp dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi ở nhiệt độ 105oC. Độ ẩm của chế phẩm CS được tính theo công thức:
Trong đó:
mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy
m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổị
2.2.6.4.Xác định vết kim loại nặng: gửi mẫu kiểm tại Viện Hóa Học
2.2.7. Bố trí thí nghiệm
2.2.7.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu nhận và tinh sạch Chondroitin sulfate
Nồng độ: 0,1-0,9ml/10g sụn T0: 300C– 700C
pH: 4,5 – 8,5
Thời gian: 4 - 60giờ Sụn cá B26 ETM Thủy phân bằng enzym Tủa dịch bằng ethanol Chế phẩm CS tinh sạch Dịch thủy phân chứa CS Tủa dịch bằng ethanol Ly tâm thu tủa
chứa CS
Thu tủa GAGS+ CPC/CTAB
Rửa tủa bằng NaCl
CPC/ CTAB
Thuyết minh quy trình:
1. Sụn cá
Sụn cá được thu thập từ vùng biển Hải Phòng, do phòng Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải Sản cung cấp.
2. Thuỷ phân
Sụn cá sau khi được nghiền nhỏ sử dụng enzym protease để thuỷ phân các mối liên kết peptit để giải phóng CS. Vì CS thường gắn với các protein bằng liên kết o- glycosid tạo thành một proteoglycan.
3. Ly tâm, thu dịch chứa CS
Dịch sau khi được thuỷ phân đem ly tâm 1200v/phút để thu dịch chứa CS. Sử dụng ethanol ở 40C trong 24 giờ để tủa dịch CS vừa thu được. Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid. Ethanol ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của protein và làm protein kết tủạ Sau đó tiếp tục ly tâm để thu tủa chứa CS. Hoà tủa trong nước khử ion bổ sung muối của ammonium (CPC- CTAB) để tạo tủa và tinh chế thu CS.
4. Rửa tủa
Dùng NaCl 0,4M để hoà tan các GAG gốc sulfate thấp trong phức hợp tủa CTAB-GAG và CPC-GAG. Sau khi loại bỏ các GAG gốc sulfate thấp như hyaluronic acid, chỉ còn lại tủa CPC-GAG và CTAB-GAG chứa các GAG gốc sulfate cao, chủ yếu là CS. CS trong phức tủa CPC-GAG và CTAB-GAG sẽ được hòa tan phần lớn trong các muối nồng độ cao 2,1M NaCl và tiếp tục đượctinh chế bằng thẩm tích và kết tủa bằng ethanol để thu CS tinh khiết.
5. Chế phẩm CS tinh sạch
Sau khi tủa dịch bằng ethanol thu được CS tinh khiết đem đi sấy khô để bảo quản. Từ sơ đồ tổng quát trên sẽ tiến hành nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho từng quá trình nghiên cứu cụ thể.
2.2.7.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn điều kiện tối thích cho hoạt động của protease ngoại bào B26 . protease ngoại bào B26 .
2.2.7.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH tối thích.
Với cùng một điều kiện giống nhau, chỉ thay đổi pH của dung dịch đệm (Na-acetat (0,01M) ở pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate (0,01M) ở pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5) trong phản ứng thủy phân. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym protease (B26) cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám.
Lấy 10g sụn cắt nhỏ, bổ sung 4ml H2O khử ion và cuối cùng cho 2,5ml enzym ở 400 C trong 6h, sau đó thu dịch sau thủy phân và tủa protein bằng TCA 7% với tỷ lệ 1/2, để qua đêm ở nhiệt độ 40C.
Các mẫu tủa bằng TCA được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên và xác định hàm lượng tyrosine bằng phương pháp Anson cải tiến như đã trình bày trong phần 2.2.2.
Chế phẩm enzym B26
Dịch thủy phân chứa CS
9,5 8,5 7,5 6,5 , 4,5 Sụn cá Thủy phân 5,5 5 - Nhiệt độ: 400C - Thời gian: 2 giờ
2.2.7.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ tối thích của chế phẩm B-26
Với cùng một điều kiện thủy phân giống nhau, chỉ thay đổi nhiệt độ của phản ứng thủy phân và pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym B26 cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám. Tiến hành thí nghiệm và các bước xác định nồng độ tyrosine trong các mẫu sau thủy phân tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.2.1.
2.2.7.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1, nhiệt độ tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.2) và cùng 1 nồng độ enzym (2,5ml enzym B26 thủy phân 10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân ở các thời gian khác nhau (4h, 8h, … ,
Chế phẩm enzym B26 700C 600C 500C 300C Sụn cá Thủy phân 400C - pH: Tối thích - Thời gian: 2giờ
- Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn
Dịch thủy phân chứa CS
Dịch thủy phân chứa CS
Chế phẩm enzym B26 48h 44h ... 4h Sụn cá Thủy phân 8h - pH: Tối thích - Nhiệt độ: Tối thích - Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn
44h, 48h). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine tương tự như đã mô tả ở mục
2.2.7.2.1.
Dịch sau thủy phân được tủa bằng ethanol 96% và để qua đêm ở nhiệt độ -40C. Sau đó ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 20 phút để thu tủạ Hàm lượng CS trong tủa được xác định bằng phương pháp DMMB.
2.2.7.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng độ tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1, nhiệt độ tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.2, thời gian tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.3 và tiến hành phản ứng ở các nồng độ enzym khác nhau (4 ml, 6ml, 8ml, 10ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá đuối, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp ). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.2.1, và xác định CS tương tự như đã mô tả ở mục
2.2.7.2.3.
Dịch thủy phân chứa CS
4ml/10g 6ml/10g 8ml/10g 10ml/10g Chế phẩm enzym B26 Sụn cá Thủy phân - pH: tối thích - Nhiệt độ: tối thích - Thời gian: tối thích
2.2.7.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm ETM phẩm ETM
2.2.7.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH tối thích
Với cùng một điều kiện thủy phân giống nhau, chỉ thay pH. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym ETM cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám.
Lấy 10g sụn cắt nhỏ, bổ sung 4ml H2O khử ion và cuối cùng cho 0,5ml enzym. Thay đổi pH của dung dịch đệm (Na-acetat (0,01M) ở pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate (0,01M) ở pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5) ở nhiệt độ 550C trong 6h, sau đó thu dịch sau thủy phân và tủa protein bằng TCA 7% với tỷ lệ 1/2, để qua đêm ở nhiệt độ 40C.
Các mẫu tủa bằng TCA được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên và xác định hàm lượng tyrosine bằng phương pháp Anson cải tiến như đã trình bày trong phần 2.2.2.
Dịch sau thủy phân được tủa bằng ethanol 96% và để qua đêm ở nhiệt độ -40C. Sau đó ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 20 phút để thu tủạ Hàm lượng CS trong tủa được xác định bằng phương pháp DMMB.
Dịch thủy phân chứa CS
9,5 Chế phẩm enzym ETM 8,5 7,5 6,5 4,5 Sụn cá Thủy phân 5,5 - Nhiệt độ: 550C - Thời gian: 6giờ
2.2.7.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ tối thích
Với cùng một điều kiện giống nhau, chỉ thay đổi nhiệt độ của phản ứng thủy phân 400C, 450C, 500C, 550C, 600C, 650C, 700C và cùng 1 nồng độ enzym (0,5ml enzym Etm thủy phân/10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân thời gian 6giờ. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym protease (ETM) cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám. Tiến hành thí nghiệm và các bước xác định nồng độ tyrosine và CS trong các mẫu sau thủy phân tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.3.1.
2.2.7.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích
400C ... 650C Chế phẩm enzym ETM 700C Sụn cá Thủy phân 450C - pH: Tối thích
- Thời gian: 6giờ
- Nồng độ:0,5ml enzym/10g sụn
Dịch thủy phân chứa CS
Chế phẩm enzym ETM 66h 60h ... 6h Sụn cá Thủy phân 12h - Nhiệt độ: tối thích - pH: tối thích - Nồng độ: 0,5ml enzym/10g sụn
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu) và cùng 1 nồng độ enzym enzym (0,5ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân ở các thời gian khác nhau (6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine và CS tương tự như đã mô tả ở trên.
2.2.7.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng độ tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu (nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, thời gian tối ưu) đã được xác định ở trên, tiến hành thủy phân ở các nồng độ enzym khác nhau 0,1 ; 0,2; … ; 0,9ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá đuối, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine và CS tương tự như đã mô tả ở mục trên.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
- Xử lý số liệu bằng student test ở mức ý nghĩa α= 0,05 - Vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excell. Chế phẩm enzym ETM 0,9ml/10g 0,8ml/10g ... 0,1ml/10g Thủy phân 0,2ml/10g
Dịch thủy phân chứa CS
- Nhiệt độ: tối thích - pH: tối thích
- Thời gian: tối thích
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH HÀM LƯỢNG CHONDROITIN
SULFATE CỦA M ẪU GỬI PHÂN TÍCH
Kết quả phân tích phổ NMR của Viện Hóa Học cho thấy sản phẩm là CS
Kết quả mẫu thô đem đi kiểm tại trung tâm phân tích cho hàm lượng CS là 50,1% và hàm lượng CS trong mẫu tinh sạch là 88,1%.
Sử dụng phương pháp DMMB kiểm tra hàm lượng CS trong mẫu thô và tinh song song cho kết quả 53,6% và 88,8%. Cho thấy:
Qui trình tách chiết và tinh chế của luận văn cho ra sản phẩm là CS.
Phương pháp DMMB trong trường hợp này (sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch của luận văn) dùng để phân tích hàm lượng CS là đáng tin cậy (cho kết quả gần đúng với trung tâm kiểm nghiệm).
Nhận xét: dùng phương pháp DMMB để khảo sát hàm lượng CS trong tất cả các thí nghiệm của luận văn. Các kết quả nghiên cứu của đề tài dựa trên phân tích định lượng CS bằng DMMB như sau:
3.1. Xác định hàm lượng Chondroitin sulfate trong sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) ở Việt Nam và cá nhám (Carcharhinus sorrah) ở Việt Nam
Sử dụng phương pháp DMMB để xác định hàm lượng CS trong mẫu sụn. Phương pháp dựa trên sự thay đổi phổ hấp thụ của 1,9 – dimethylmethylene blue khi gắn với các GAGs (glycosaminoglycans) [19]. Sử dụng CS4 và CS6 làm chất chuẩn đã
chỉ ra sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ CS và phổ hấp thụ ở bước sóng 525nm theo phương trình hồi quy sau: y = 0,025x + 0,0825 với R2 = 0,943 và y= 0,0294x + 0,1092 với R2 = 0,992 có độ chính xác cao được chỉ ra ở hình 3 (phụ lục). Phương pháp DMMB có độ nhạy cao có thể xác định CS với hàm lượng rất nhỏ (µg). Sự khác nhau ở vị trí sulfate của CS4 và CS6 có thể ảnh hưởng đến phổ hấp phụ 525 nm. Các nghiên cứu của các nhà khoa học nước ngoài cho thấy tỷ lệ CS4 ở phần lớn các mẫu sụn của các loài động vật như bò, gà, cá sấu, cá đuối là cao hơn tỷ lệ CS6 [21], trừ sụn
cá mập có hàm lượng CS6 cao hơn. Vì vậy, sử dụng CS4 là chất chuẩn cho việc xác định hàm lượng CS trong sụn cá đuối và cá nhám Việt Nam.
Bảng 3.1. Hàm lượng CS trong các mẫu sụn cá đuối và cá nhám Việt Nam
Mẫu sụn % CS/trọng lượng
sụn khô Cá đuối (Dasyatis Kuhlii) 12,0 ± 1,54 Cá nhám (Carcharhinus Sorrah) 17,2 ± 1,53 Hỗn hợp cá đuối, cá nhám 15,5 ± 1,45
Do CS liên kết với protein và là thành phần cấu tạo trong sụn, nên sụn cá cần phải được thủy phân để loại protein mới có thể xác định được hàm lượng CS. Sử dụng papain như các tác giả khác đã sử dụng để thủy phân mẫu sụn và dùng phương pháp DMMB để xác định hàm lượng CS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy hàm lượng CS trong sụn cá nhám (Carcharhinus sorrah) là 17,2% và hàm lượng CS trong sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) là 12%. Hàm lượng CS trong cá đuối (Dasyatis kuhlii) ở Việt Nam cũng gần tương đương với hàm lượng CS trong cá đuối (Dasyatis zugei) ở Thái Lan được Garnjanagoonchorn và cộng sự khảo sát. Garnjanagoonchorn cũng xác định hàm lượng CS trong sụn vi cá mập là khoảng 18,36% [21]. Như vậy nguyên liệu sụn cá đuối và cá nhám từ các nhà máy chế biến thủy sản Việt Nam có hàm lượng CS khá cao, đây là cơ sở để tiến hành nghiên cứu, khai thác nguồn dược liệu quý chondroitin sulfatẹ
3.2. Lựa chọn nguồn enzyme thích hợp
CS thường gắn với các protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG) [14]. Chondroitin trong mô của động vật là một polysaccharide mang điện tích âm (anionic polysaccharide) liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu tạo của PG. Chuỗi CS được gắn với nhóm -OH của gốc serine của một số protein [56]. Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng 80-100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học vững chắc.
Vì thế CS được chiết rút từ sụn động vật bằng phương pháp sinh học nhờ sự thủy phân protein liên kết bởi các exogenous protease (như papain) [49; 34; 21]. Tuy nhiên sử dụng papain để chiết rút CS giá thành thường rất cao và hiện khó kiếm.
Việc khảo sát và sàng lọc protease từ các nguồn nguyên liệu khác nhau (vi sinh vật, thực vật và động vật) có khả năng thủy phân protein gắn kết với CS trong sụn
nhằm hạ giá thành sản xuất và giảm thiểu tác động môi trường là rất cần thiết. Các enzym protease từ vi sinh vật hiện chiếm tới 60% enzym sử dụng trên thị trường.
3.2.1. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease từ chủng B26 để thủy phân sụn cá
Dựa vào kết quả nghiên cứu sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh protease ngoại bào có khả năng thủy phân sụn cá đuối và cá nhám đã công bố [9]. Chúng tôi lựa chọn chủng B26 để nghiên cứu ứng dụng thủy phân sụn cá và so sánh với các nguồn protease khác
3.2.1.1. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease từ chủng B26 chủng B26
Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzym... tối thích cho phản ứng. Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt độ protease, phản ứng enzym được thực hiện ở cùng một thời gian, nhiệt độ 40ºC trong đệm Na-acetat (pH: 4,5; 5,5) và đệm phosphate (pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5). Kết quả ở hình 3.3 cho thấy protease ngoại bào của chủng B26 có hoạt tính