Để có thể phân tách CS trong phức hợp tủa CS-CPC, một số nghiên cứu đã sử dụng các nồng độ muối NaCl khác nhau để tách CS khỏi các glycosaminoglycan khác
[57]. Nakano và cộng sự nhận thấy khi rửa phức hợp CS-CPC bằng NaCl 0,4M phần
lớn các hyaluronic acid đã bị loại [42]. Chế phẩm CS tinh sạch sơ bộ được hòa trong nước khử ion, CPC được bổ sung vào dịch hòa tủa đạt nồng độ 1,5% để tạo liên kết CS-CPC như đã nghiên cứu trong mục 3.3.3. Dựa vào nghiên cứu của một số tác giả Garnjanagoonchorn, Nakano và cộng sự [21; 42], rửa tủa CS-CPC ở trên với NaCl 0,4M. Lượng CS mất đi sau rửa tủa chỉ khoảng 0,3%. Ly tâm 12.000 v/phút trong 30 phút, loại dịch thu tủạ Tủa CS-CPC hòa trong NaCl 2,1M. Nakano đã chỉ ra phân đoạn hòa NaCl 2,1M này chứa phần lớn CS và một hàm lượng nhỏ dermatan sulfate disaccharides [43; 57].
Để thu lại phần CPC dư thừa trong hỗn hợp dung dịch CS-CPC hòa trong NaCl 2,1M, sử dụng potassium thiocyanat 1,5% bằng nồng độ CPC đã sử dụng. Phần tủa được loại, thu dịch trong (1). Phần tủa được hòa lại trong NaCl 2,1M, loại tủa, thu dịch trong (2). Khối lượng tủa CS ở dịch trong (2) rất thấp (chiếm 1,9%/ tổng khối lượng tủa CS thu được từ dịch trong (1) và dịch trong (2)).
Khảo sát nồng độ ethanol khác nhau để thu hồi CS tinh sạch. Dịch (1) và (2) thu ở trên được tủa với ethanol theo các tỷ lệ khác nhau (bảng 3.7). Thu tủa bằng ly tâm 12.000 v/phút trong 30 phút ở 4ºC. Đông khô chế phẩm CS tinh sạch.
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi CS bằng tủa ethanol
Tỷ lệ tủa (dịch lọc/ethanol)
Hiệu suất thu hồi tủa CS (%) 1:1 Tủa lởn vởn, huyền phù 1:2 96,3 1:3 99,0 1:4 100,0 1:5 100,0
Kết quả bảng 3.7 cho thấy tỷ lệ thể tích dịch lọc và ethanol là 1:2 đã thu được gần lượng lớn CS. Tuy nhiên với tỷ lệ 1 thể tích dịch lọc và 3 thể tích ethanol (1:3), lượng CS thu được cao hơn và đặc biệt tủa CS kết dính chặt, không cần sử dụng ly tâm mà vẫn thu được tủa rất thuận lợi cho việc thu CS với khối lượng lớn. Để sản xuất với quy mô lớn, có thể tái sử dụng lại ethanol bằng chưng cất, sẽ giảm được giá thành sản xuất.